Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Современные представления о структурно-функциональной организации лимфомикроциркуляторной системы 11
1.2. Изменение микроциркуляции при стрессе 34
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Моделирование стрессорной реакции 42
2.2. Исследование функции лимфатических микрососудов в условиях in vivo 42
2.3. Фармакологическая модификация NO-регуляции лимфомикроциркуляции 45
2.4. Применение низкоинтенсивного лазерного излучения 45
2.5. Исследование лимфотока с использованием спекл-интерференционного метода 47
2.6. Способы статистической обработки результатов исследований 50
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Состояние лимфомикроциркуляции в брыжейке интактных и стрессированных животных 52
3.1.1. Опыты на интактных животных 52
3.1.2. Опыты на стрессированных животных 56
3.2. Влияние гелий-неонового лазерного излучения на лимфатические микрососуды интактных и стрессированных животных 63
3.2.1. Опыты на интактных животных
3.2.2. Опыты на стрессированных животных
3.3. Реакция лимфатических микрососудов интактных и стрессированных животных на аппликацию нитропруссида натрия
3.3 1. Опыты на интактных животных 73
3.3.2. Опыты на стрессированных животных 79
3.4. Модификация биоэффекта НИЛИ на фоне действия нитропруссида натрия у интактных и стрессированных животных 85
3.4.1. Опыты на интактных животных 85
3.4.2. Опыта на стрессированных животных 89
3.5, Реакция лимфатических микрососудов интактных и стрессированных животных на аппликацию блокатора NO-синтаз 92
3.5.1. Опыты на интактных животных 92
3.5.2. Опыты на стрессированных животных 96
3.6. Модификация биоэффекта НИЛИ на фоне блокады NO-синтаз интактных и стрессированных животных 99
3.6.1. Опыты на интактных животных 99
3.6.2. Опыты на стрессированных животных 102
3,7. Влияние нитропруссида натрия на функцию лимфатических микрососудов на фоне блокады NO-синтаз у интактных и стрессированных животных 104
3.7.1 .Опыты на интактных животных і04
3.7.2. Опыты на стрессированных животных 109
3.8. Сравнительный анализ биомикроскопического и спекл-интерференционного методов исследования лимфотока 115
Обсуждение результатов 118
Выводы 142
Литература 145
- Современные представления о структурно-функциональной организации лимфомикроциркуляторной системы
- Исследование функции лимфатических микрососудов в условиях in vivo
- Исследование лимфотока с использованием спекл-интерференционного метода
- Влияние гелий-неонового лазерного излучения на лимфатические микрососуды интактных и стрессированных животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Концепция стресса, сформулированная выдающимся канадским ученым Г. Селье около 70-ти лет назад, оказала большое влияние на различные направления науки о человеке - медицину, психологию, социологию и другие области знаний. Возникновение и широкое распространение учения о стрессе связано с особенностями жизни современного человека, научно-техническим прогрессом и ускоренным развитием цивилизации (Меерсон Ф.З. 1981; Зикмунд В., 1987; Тигранян Р.А.,1988; К.В. Судаков, 1992).
Физиологический стресс (общий адаптационный синдром) занимает важное место в патогенезе различных заболеваний, являясь неспецифическим компонентом системного ответа организма (Селье Г., 1982; Меерсон Ф.З., 1993; Брилль Г.Е., 1998). Важнейшим этапом формирования адаптивных реакций выступают изменения различных звеньев нейро-гуморальной регуляции и последующие структурно-функциональные перестройки. При патологическом стрессе, когда нарушается адекватность реакции организма на действие стрессора, возникают нарушения функции многих органов и систем. Несмотря на многолетнюю историю изучения проблемы стресса, многие аспекты патогенеза стресс-индуцированной патологии остаются неясными.
До последнего времени основное внимание исследователей, анализирующих механизмы стрессорной патологии, привлекали изменения со стороны сердца и кровеносных сосудов, лежащие в основе развития ишемической болезни сердца, гипертонической болезни, атеросклероза и других важнейших форм стресс-индуцированной патологии человека (Меерсон Ф.З., 1984; Анищенко Т.Г., 1995; Брилль Г.Е., Романова Т.Г. 2001). Вместе с тем, на сегодняшний день остаются мало исследованными изменения, возникающие при стрессе в системе лимфомикроциркуляции, хотя важность
этих изменений для формирования нарушений сосудисто-тканевого гомеостаза не вызывает сомнений.
Одним из важнейших регуляторов и оптимизаторов стрессорного ответа является система оксида азота (NO) (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б.,1998). В зависимости от характера, силы и продолжительности стрессорного воздействия может происходить повышение или понижение продукции N0 в тканях. Известно, что N0 принимает участие в регуляции функции кровеносных и лимфатических микрососудов в физиологических условиях, а также при патологии (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б.,1998; Смирин Б.В. и соавт., 1999; Hassoun P.M. et al.,1995; LeakL.V. et al, 1995; Koller A., Misuno R., 1999). Однако большинство работ, посвященных анализу роли N0 в регуляции сосудистого тонуса, выполнены на разных сосудах в различных условиях эксперимента, в связи с чем полученные результаты подчас противоречивы (Eisenhoffer J. et al., 1995; Hassoun P.M. et al.,1995; Leak L.V.et al., 1995; Koller A., Misuno R., 1999).
Вместе с тем, понимание механизмов нарушения функции лимфатических микрососудов при стрессе необходимо для разработки эффективных методов коррекции расстройств лимфомикроциркуляции в условиях патологии с использованием медикаментозных средств или воздействия физических факторов.
В последние годы широкое применение в клинической практике находит низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), которое применяется при лечении различных заболеваний (Богданович У .Я. и соавт., 1978; Крюк А.С. и соавт. 1986; Черная Т.Т. и соавт., 1988; Гордиенко В.И., Залесский В.Н., 1989; Дегтярева А.А., 1989; Илларионов В.Е., 1992; Павлова Т.Н., 1993; Кошелев В.Н. и соавт., 1994; Хомерики С.Г. и соавт., 1994; Чернышева Л.А., Хан М.А., 1995; Ларюшин А.И., Илларионов В.Е., 1997; Hecht J., 1994). В многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях установлено, что НИЛИ
способно оказывать разнообразное воздействие на биологические объекты (Брилль Г.Е., 2000; Каш T.I., 1996, 2001). Особое место в реализации позитивного клинического эффекта когерентного света занимает его влияние на микроциркуляторное русло (Лещенко В.М. и соавт., 1991; Охширо Т. Калдерхед Р.Г., 1991).
Положительный клинический эффект, достигаемый при применении света гелий-неонового лазера при различных формах патологии, позволяет предположить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на универсальные механизмы, реализующие разнообразные адаптивные и защитно-приспособительные формы реагирования живого организма на воздействие патогенных факторов (Брилль Г.Е. и соавт., 1998). Одной из таких форм ответа является стресс-реакция. Вместе с тем влияние низкоинтенсивного гелий-неонового лазерного излучения на формирование стрессорного ответа до настоящего времени не изучено.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явились
комплексное изучение нарушений деятельности системы
лимфомикроциркуляции в условиях патологического иммобилизационно-звукового стресса, анализ участия NO-ергических систем в регуляции функции лимфатических микрососудов в норме и при стрессе, а также исследование изменения фотореактивности структурных элементов брыжейки в условиях стресса и при изменении тканевого уровня оксида азота.
Задачи исследования:
1. Изучить состояние лимфомикроциркуляции в брыжейке интактных
животных и ее изменения при патологическом иммобилизационно-звуковом
стрессе.
2. Изучить влияние НИЛИ на состояние лимфомикроциркуляции в
брыжейке интактных и стрессированных животных.
3. Исследовать влияние экзогенного донора оксида азота (нитропруссида натрия) на лимфатические микрососуды интактных и стрессированных животных.
"^.Проанализировать динамику изменений параметров
лимфомикроциркуляции на фоне блокады NO-синтаз у интактных и стрессированных животных.
5.Изучить изменение фотореактивности лимфомикроциркуляторной системы в условиях повышения тканевого уровня NO, а также при нарушении его синтеза.
Научная новизна. В работе получены новые данные об изменении лимфомикроциркуляции при иммобилизационно-звуковом стрессе. Установлено, что в условиях патологического стресса лимфатические микрососуды активно вовлекаются в дренажную функцию, однако при этом нарушается их регуляция и возникает дискоординация фазной сократительной активности лимфангионов и работы клапанного аппарата. Показано, что облучение брыжейки светом He-Ne лазера вызывает дозозависимые изменения функции лимфатических микрососудов. В условиях стресса и при изменении базального уровня NO нарушается фотореактивность тканевых структур. Впервые обнаружено, что повышение тканевого уровня N0 сенсибилизирует элементы лимфомикроциркуляторного русла к действию излучения гелий-неонового лазера. При этом существуют различия в изменении фотореактивности сосудов интактных и стрессированных животных. В условиях стресса измененяется реакция контрактильных и пеисмекерных структур лимфатических микрососудов на уменьшение базального уровня оксида азота. Получены данные, свидетельствующие о важности базального уровня N0 в формировании нормальной реактивности пеисмекерных клеток и контрактильных структур лимфангионов.
Практическая значимость. Полученные в работе новые научные факты о характере нарушений лимфомикроциркуляции при комбинированном иммобилизационно-звуковом стрессе, об изменении фотореактивности лимфатических микрососудов в условиях стресса, а также о важном значении базального тканевого уровня оксида азота в формировании реакции лимфатических микрососудов на действие гуморальных регуляторов и фотовоздействие в норме и при стрессе, явятся необходимой теоретической предпосылкой для разработки эффективных методов коррекции нарушений лимфомикроциркуляции в условиях патологии.
Внедрение результатов. Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах патологической физиологии и физики Саратовского государственного медицинского университета, а также на кафедре оптики СГУ. По материалам диссертации внедрено 1 рационализаторское предложение.
Достоверность представленных научных результатов обусловлена
тем, что они получены при использовании современных апробированных
методик. Достоверность подтверждается воспроизводимостью
экспериментальных результатов, а также результатами статистической обработки.
Основные положения выносимые на защиту:
І.При патологическом иммобилизационно-звуковом стрессе возникают выраженные изменения лимфомикроциркуляции. При этом нарушается координированная работа внутренних и внешних механизмов, обеспечивающих движение лимфы, и возникает относительная недостаточность внутренних насосных механизмов.
2. Облучение брыжейки светом гелий-неонового лазера (V-632,8 нм) вызывает зависимое от дозы изменение функции лимфангионов. При иммобилизационно-звуковом стрессе изменяется фотореактивность
структурных элементов брыжейки: повышается чувствительность контрактильных элементов и пейсмекерных клеток стенок и клапанов лимфатических микрососудов к фотовоздействию.
3. В условиях стресса изменяется реакция лимфомикроциркуляторной
системы на действие экзогенного донора N0 - нитропруссида натрия.
Повышение тканевого уровня N0 сенсибилизирует элементы лимфомикроциркуляторного русла брыжейки к облучению. При этом существуют различия в изменении фотореактивности сосудов интактных и стрессированных животных.
В условиях блокады тканевых NO-синтаз Ы-нитро-Ь-аргинином изменяется тонус, фазная сократительная активность лимфангионов, что свидетельствует о важной роли базального уровня оксида азота в регуляции функции лимфатических микрососудов. В условиях стресса изменяется характер сосудисто-тканевого отклика на действие блокатора NO-синтаз.
6. При блокаде NO-синтаз изменяются ответ лимфатических
микрососудов интактных и стрессированных животных на действие НПН, а
также реакция лимфангионов на фотовоздействие.
Апробация работы. Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на научных конференциях Центральной научно-исследовательской лаборатории (2000-2002 гг.), на совместном заседании кафедр общей биологии, патофизиологии и физики Саратовского государственного медицинского университета. Фрагменты работы представлены на научных конференциях молодых ученых и студентов СГМУ (Саратов, 1999,2000,2001), на Международной конференции "Workshop on Optical Technologies in Biophysics and Medicine" (Саратов, 1999), на Международной конференции "European Biomedical Optics Week EBiOS, SPIE-2000" (Amsterdam, Netherlands, 2000), на II Международном симпозиуме "Tissue Monitoring and 3D-Imaging of Diseased Organs" (Erlangen, Germany, 2000), на
Международной конференции "Light Scattering Technologies for Mechanics, Biomedicine, and Material Science" (Саратов, 2000), на "European Conferences on Biomedical Optics" (Munich, Germany, 2001); на Международной конференции "International Workshop on Biophotonics- SIWB-02" (Саратов, 2002), на 5-ой Международой конференции "Lymphedema Network International Conference" (USA, 2002), на 22-м заседании European Society for Microcirculation (UK, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 10 в зарубежной печати.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материалы и методы исследований, главы, отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Указатель литературы включает 87 отечественных и 92 зарубежных источников. Работа содержит 4 таблицы и 65 рисунков.
Современные представления о структурно-функциональной организации лимфомикроциркуляторной системы
Лимфатические сосуды обычно подразделяются в зависимости от их диаметра, структуры стенки и особенностей выполняемой функции на макро- и микрососуды. Последние являются анатомическим субстратом, обеспечивающим лимфообразование, Движение межтканевой жидкости, а также лимфомикроциркуляцию. К лимфомикроциркуляторному руслу принято относить сосуды с наружным диаметром от 10 до 200 мкм (Борисов А.В., 1990; Бородин Ю.И. и соавт., 1990).
В свою очередь микрососуды подразделяются на капилляры и посткапилляры. Правомерность такого деления признается большинством исследователей (Куприянов В.В., 1989; Выренков И.В., Пестерева Н.А., 1990).
Лимфатические капилляры являются начальным звеном лимфатической системы. Они образуют густые сети в подкожной клетчатке, стенках внутренных органов, серозных оболочках, капсулах суставов. Лимфатических капилляров сравнительно мало в мышцах, плотных соединительнотканных анатомических образованиях (связках, фасциях, сухожилиях). Неравномерно распределены они в железах. Нет лимфатических капилляров и сосудов в головном мозге, мозговых оболочках, костях, глазном яблоке, роговице, гиалиновом хряще, эпидермисе, плаценте.
Терминальные отделы лимфатических капилляров чаще всего выглядят как слепо начинающиеся трубки, другие начинаются петлей, по типу разветвлений корня или имеют шарообразную форму (Арутюнов В.Д. и соавт., 1976; Куприянов В.В., 1983; Русньяк И.К.). Располагаясь вокруг кровеносных капилляров, они образуют многоярусную сеть. Для типичного лимфатического капилляра характерен ряд признаков: извилистость, наличие расширений, формирование в местах слияния "озер" и "лакун", наличие в ряде случаев слепых отростков (Бородин Ю.И. и соавт., 1990). Стенки лимфатического капилляра состоят из слоя уплощенных эндотелиальных клеток. Эти эндотелиоциты примерно в 4 раза крупнее эндотелиальных клеток кровеносных капилляров (Айнсон Х.Х., 1984). На структуру эндотелиоцитов существенное влияние оказывают региональные особенности функционирования лимфангионов, а также нагрузочные факторы, реализуемые через изменения внутрипросветного давления и объема перемещаемой жидкости. Эндотелиальные клетки лимфатических капилляров различаются по форме: широко распространены фестончатые эндотелиоциты, клетки с глубоким вдавливанием в цитоплазму, эндотелиоциты веретенообразной формы, а также клетки неправильной конфигурации, напоминающие овал, ромб, или многоугольники со сглаженными углами (Аминова Г.Г., 1963,1996). Форма эндотелиоцитов, а, следовательно, и типы клеток не статичны. Эндотелиоциты представляют собой динамичные образования, способные постоянно менять свою конфигурацию. Важнейшей функцией эндотелия лимфатических капилляров является участие в лимфообразовании и начальных этапах движения лимфы, а также участие в регуляции проницаемости лимфатических капилляров. Кроме того, эндотелиальные клетки лимфатичесих микрососудов принимают участие в регуляции тонуса гладкомышечных клеток (Ohhashi Т., Takahashi N.,1991; Ferguson М.К., 1992), а также модулируют частоту спонтанных сокращений лимфангиона, необходимых для продвижения лимфы (Ohhashi Т, Takahashi N, 1991; Reeder L.B., Yang L.H., Ferguson M.K., 1994). Поступление тканевой жидкости и растворенных в ней веществ в лимфатические капилляры осуществляется, в основном, в результате формирования пор в области межэндотелиальных контактов (Айнсон Х.Х., 1984), а также путем везикулярного транспорта через эндотелиальные клетки (Cornford М.Е., 1993). Поры в области межклеточных соединений выполняют основную роль при образовании лимфы. Число таких пор и их величина могут регулировать не только количество лимфы, но и ее качественный состав.
По данным ряда авторов (Leak L.V., 1968; Castenholz А., 1987), величина межэндотелиальных щелей может изменяться благодаря сократительной активности эндотелиоцитов. Сокращение эндотелиальных клеток стимулируется растяжением эндотелия, нагреванием ткани, биологически активными веществами, а также некоторыми лекарственными препаратами. В основе процесса сокращения клеток эндотелия предположительно лежит активный транспорт ионов Са+ , Na+ и К+. Эндотелиоциты, сокращаясь, способствуют избирательному проникновению молекул из тканевой жидкости в просвет микрососуда.
При изменении гидродинамических условий межэндотелиальные щели могут закрываться, и, таким образом, функционировать как клапаны, предотвращая обратный ток жидкости (Айсон Х.Х.,1984; Castenholz А., 1987, 1991; Schmid-Schonbein GW., 1990; Adair Т.Н., Montani J-P, 1991).
Движение веществ в интерстициальном пространстве зависит от уровня транскапиллярного обмена, действия физико-химических и нейрогуморальных регуляторных факторов (Бородин Ю.И. и соавт., 1990). Процесс лимфообразования определяется, прежде всего, величиной результатирующего давления, зависящего от соотношения гидростатического, онкотического и осмотического давлений в данном участке ткани и обеспечивающего движение жидкости из ткани в лимфатический сосуд (Куприянов В.В., 1989). Предполагается, что начальные лимфатические сосуды действуют как маленькие гидравлические насосы для создания гидростатической всасывающей силы. Когда гидростатическое давление в ткани становится выше, чем в лимфатическом капилляре, проникающая в сосуд жидкость растягивает межэндотелиальные соединения (Castenholz А., 1987). Поступление интерстициальной жидкости прекращается, когда гидростатическое давление в лимфатическом капилляре и межклеточном пространстве выравнивается, а расслабление фиксирующих волокон приводит к более полному контакту эндотелиальных клеток друг с другом и препятствует обратному выходу больших молекул в окружающее пространство (Айсон Х.Х., 1984). Таким образом, образуясь в лимфатических капиллярах, лимфа далее попадает в другой отдел лимфомикроциркуляторного русла - лимфатические посткапилляры.
Наиболее существенным отличием посткапилляров является наличие клапанов, образованных складками стенки (Куприянов В.В.,1989; Борисов А.В., 1990). Эндотелиоциты, участвующие в образовании клапана и самой стенки посткапилляра, сходны с эндотелиоцитами лимфатических капилляров (Бобрик И.И. и соавт., 1986).
Исследование функции лимфатических микрососудов в условиях in vivo
Функциональное состояние системы микролимфоциркуляции исследовали на сосудах брыжейки тонкого кишечника крысы методом витальной биомикроскопии. У наркотизированных животных через срединный разрез передней брюшной стенки извлекали петлю тонкого кишечника с брыжейкой. Участок брыжейки расправляли на световоде специального столика для биомикроскопии с термостабилизацией (38 С). Препарат постоянно орошали раствором Рингера для теплокровных (состав в г/л: NaCl -9,0; КС1 - 0,2; СаС12 - 0,2; фосфатный буфер, рН-7,4, t=38C). Петлю кишечника накрывали марлевой салфеткой, смоченной этим же раствором. На участке брыжейки находили лимфатический микрососуд, свободный от жировой ткани. За состоянием микроциркуляторного русла постоянно наблюдали на экране телемонитора, одновременно производя запись на видеомагнитофон.
Данный метод позволяет проводить прижизненную объективную регистрацию параметров микролимфоциркуляции, не нарушая целостности сосуда, а также дает возможность наблюдать за изменениями микроциркуляции при воздействии различных факторов (физических, химических и биологических) (Хугаева В.К., 1991, Takeshita Т. et al., 1989).
В процессе эксперимента через определенные промежутки времени (от 5 до 30 мин) регистрировали состояние микрососудов на видеопленке. При обработке видеоматериалов оценивали параметры, характеризующие состояние лимфомикроциркуляторного русла. Диаметр микрососуда измеряли в центральной (внеклапанной) части лимфангиона. Регистрировали наличие фазной сократительной активности лимфангионов, определяли частоту фазных сокращений в 1 мин. Амплитуду сокращений выражали в абсолютных значениях (в мкм) или вычисляли в процентах к исходному диаметру сосуда по формуле: А= max minxl00% где Dmax и Dmin - соответственно, максимальный и минимальный диаметр сосуда во время фазного сокращения.
Используя покадровый режим воспроизведения видеомагнитофона (метод "frame-by-frame"), измеряли продолжительность периода сокращения, устойчивой констрикции, расслабления и полного цикла фазного сокращения, рассчитывали средние скорости сокращения и расслабления лимфангиона, а также соотношения между длительностью различных фаз сократительного цикла.
При наличии в поле зрения работающего клапана анализировали его активность. Регистрировали частоту смыкания створок клапана, продолжительность периода смыкания и размыкания створок, периода закрытых створок и общую длительность цикла работы клапана.
Скорость поступательного движения лимфоцитов измеряли (в мкм/с) в течение 0,08-0,4 с методом "frame-by-frame" при витальной биомикроскопии. На одном участке лимфангиона проводили 8-10 измерений. 2.3. Фармакологическая модификация NO-регуляции лимфомикроциркуляции В последние годы показано, что в регуляции функции лимфатических макро- и микрососудов в физиологических условиях принимает участие оксид азота (N0). Однако данные о влияние N0 на лимфатические микрососуды в условиях стресса в литературе нами не найдены. В связи с этим нами были проведены исследования реакции лимфатических микрососудов на введение экзогенного донора оксида азота, а также изучена роль блокады NO-синтазы в условиях стресса.
В качестве экзогенного донора оксида азота использовали нитропруссид натрия (Lancaster, Англия). Препарат, разведенный физиологическим раствором Рингера до концентрации 10"5М (t =37С), апплицировали на брыжейку крысы. Действие нитропруссида натрия изучали в течение 30 мин. Блокаду NO-синтазы осуществляли с помощью Ы-нитро-Ь-аргинина (Sigma, США). Препарат апплицировали на брыжейку в концентрации 10"4 М (t=37C) в течение 30 мин.
В отдельной серии экспериментов были изучены показатели лимфомикроциркуляции в условиях стресса при начальной 15-минутной блокаде NO-синтазы, с последующей 15-минутной аппликацией нитропруссида натрия. Изменения картины миркроциркуляторного русла брыжейки регистрировали на видеопленку каждые 5 мин. Для сравнения изменений, возникающих в системе лимфомикроциркуляции, были проведены аналогичные серии экспериментов на группе интактных животных. Контролем для последних служила серия экспериментов с аппликацией на брыжейку раствора Рингера в течение 30 мин (t=37C).
Облучение брыжейки крысы осуществляли гелий-неоновым лазером (Х,-632,8 нм) с помощью лазерной установки ЛГ 79-1 со световодной насадкой. Для облучения лимфатического сосуда световод подводили к исследуемому участку брыжейки. В экспериментах использовали лазерное излучение с плотностью мощности 14 и 450 мВт/см . Облучение проводили однократно в течение 15 мин.
Облучению подвергались интактные животные контрольной группы, а также группа крыс, подвергавшихся 2-х часовому иммобилизационно-звуковому стрессу. Для 1-ой группы проводился сравнительный анализ с данными, полученными на интактных микрососудах без лазерного воздействия. Результаты, полученные на 2-ой группе животных, сравнивались с патологическими изменениями микролимфоциркуляции, вызванными стрессом без последующего лазерного облучения, а также с данными, полученными при лазерном облучении интактных лимфангионов.
Принимая во внимание известное предположение о том, что возможными акцепторами лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм являются гуанилатциклаза и NO-синтаза (Брилль Т.Е., Брилль А.Г., 1997) представляло интерес проанализировать возможности модификации стрессорных изменений функции лимфатических микрососудов лазерным светом на фоне повышенного количества оксида азота в тканях, а также в условиях изменения активности NO-синтазы. Для этого проводились следующие серии экспериментов: -15 минутная аппликация экзогенного донора оксида азота (нитропруссида натрия, 10"5М) на интактные микрососуды, с последующим 15 минутным облучением гелий-неоновым лазером (на фоне аппликации нитропруссида натрия); -15 минутная аппликация блокатора NO-синтазы (N-нитро-Ь-аргинина, 10" М) на интактные микрососуды, с последующим 15 минутным облучением гелий-неоновым лазером (на фоне аппликации №нитро-Ь-аргинина). Аналогичные серии экспериментов были проведены на животных после стрессорного воздействия. В дальнейшем осуществляли сравнительный анализ изменений, возникающих при облучении сосудов интактных животных, и лимфангионов крыс, подвергавшихся стрессу. Подобные сравнения проводили и для серий экспериментов с блокадой NO-синтазы.
Исследование лимфотока с использованием спекл-интерференционного метода
Если рассеивающая среда находится в движении, то интенсивность рассеянного поля изменяется во времени в соответствии с особенностями этого движения. Средний размер спеклов и их контраст определяются структурой данной биоткани (Ruth В., 1987; Braiers J.D., 1996). При рассеянии лазерного пучка на движущемся фазовом экране (модели биоткани или потока клеток) имеет место изменяющаяся во времени фазовая модуляция дифрагированного пучка в плоскости дифракции. Это является результатом временных флуктуации интенсивности рассеянной волны в дальней зоне дифракции. При этом время корреляции флуктуации интенсивности спеклов обратно пропорционально скорости исследуемых потоков. Использование жесткой фокусировки лазерного пучка позволяет проводить исследование потоков в микрососудах. При этом кровеносные сосуды с диаметром менее 5 мкм ведут себя подобно слабо рассеивающему движущемуся фазовому экрану. Сосуды большего диаметра (более 12 мкм) могут рассматриваться как глубокий фазовый экран со значительными фазовыми флуктуациями (Ulyanov S.S., 1993). Результаты теоретического анализа процесса дифракции жестко сфокусированных гауссовых пучков в кровеносных капиллярах показывают, что время корреляции также обратно пропорционально скорости потока. Экспериментальные исследования процессов рассеяния света в потоках разведенной крови и ее отдельных компонентов в стеклянных капиллярах подтвердили теоретические выводы и показали, что время корреляции существенно зависит от рассеивающих характеристик потока, а также от диаметра исследуемого микрососуда (Aizu Y. et al., 1989; Ulyanov S.S., 1993).
С целью адаптации спекл-интерференционного измерительного метода к исследованию лимфотока в микроскоп «Биолам» был введен дополнительный оптический канал, в котором пучок He-Ne лазера (А,-632,8 нм) жестко фокусируется на исследуемый микрососуд в пятно диаметром «1,5 мкм. Мощность излучения до 1 мВт. Принцип данной установки, описан в работе (Bednov A.A, UTyanov S.S et.al, 1996). Лимфоток модулирует жестко сфокусированный Гауссов пучок в плоскости перетяжки. Это приводит к появлению динамической спекл-картины в зоне дифракции Фраунгофера. Флуктуации интенсивности рассеянного поля регистрируются с помощью фотоприемника, размеры которого намного меньше размера спекла. В фотоприемнике изменение светового потока преобразовывалось в переменный электрический сигнал, который записывался на аудиомагнитафон, а затем на жесткий диск компьютера. Полученные данные подвергались математической обработке с помощью программного пакета Mathcad 7 Pro. Вычисляли первый взвешенный спектральный момент - показатель, пропорциональный средней скорости лимфотока (Mi).
Перед началом экспериментов на модели иммобилизационно-звукового стресса необходимо было составить ясное представление об особенностях функциональной организации лимфатических микрососудов и лимфодинамики в брыжейке интактных, не подвергавшихся стрессорному воздействию, животных. Опыты были проведены на 35 интактных крысах, составивших контрольную группу.
Учитывая возможные естественные колебания тонуса лимфатических микрососудов (вазомоции) в ходе эксперимента, вначале нами были изучены изменения диаметра интактных сосудов в течение 30-минутного наблюдения без какого-либо возмущающего воздействия. Анализировалось состояние сосудов, исходный диаметр которых в среднем составил 137+3 мкм.
Установлено, что практически для всех интактных лимфангионов с течением времени характерны небольшие естественные колебания диаметра, как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения в среднем на 7-11 мкм. Фазная сократительная активность появляется в 10% исходно неактивных микрососудов и продолжается не более 2-3 мин. Возникающие сокращения имеют частоту 13 в 1 мин и амплитуду 18±2 мкм.
Следовательно, для интактных лимфатических микрососудов даже в покое характерны незначительные колебания тонуса (вазомоции); в небольшой части лимфангионов может возникать кратковременная спонтанная фазная сократительная активность.
В брыжейке интактных крыс постоянная фазная сократительная активность встречается в 55% интактных лимфангионов. Параметры фазной сократительной активности - амплитуда и частота, - составляют 18+2 мкм и 13+1 в 1 мин, соответственно. Обычно спонтанной сократительной активностью обладают более крупные микрососуды: средний диаметр сосудов с фазными сокращениями составляет 148±5 мкм, спокойных лимфангионов -122±3 мкм (р 0,001). Между диаметром лимфангиона и амплитудой фазных сокращений регистрируется прямая линейная корреляционная связь (г= +0,67). Заметная корреляция выявляется также между диаметром сосуда и частотой фазных сокращений (г= +0,58).
Каждый цикл фазного сокращения состоит из трех периодов: сокращения лимфангиона, периода устойчивой констрикции, в течение которого сосуд находится в максимально суженном состоянии (фаза плато), и периода расслабления. Периоды сокращения и расслабления в среднем одинаковы по времени (по 27% от общей длительности цикла). Примечательно, что в каждом сократительном цикле средняя скорость сокращения сосуда практически не отличается от средней скорости расслабления и составляет 24+2 и 23+2 мкм/с (р 0,5), соответственно. Период устойчивой констрикции является наиболее продолжительным и занимает около половины (46%) общей длительности сократительного цикла. За каждым циклом фазного сокращения следует пауза. Иногда 2-3 сокращения следуют друг за другом. Отношение средней продолжительности фазного сокращения к средней продолжительности паузы равно 1:1,4.
Влияние гелий-неонового лазерного излучения на лимфатические микрососуды интактных и стрессированных животных
До последнего времени основное внимание исследователей, изучающих феноменологию воздействия гелий-неонового лазерного излучения на систему микроциркуляции, привлекали изменения, возникающие в кровеносных микрососудах (Тупикин Г.В. и соавт., 1981; Пиликин А.С. и соавт., 1984; Борисов А.В. и соавт., 1985; Александров М.Т. и соавт., 1986; Барила Г.Г., 1986; Прохончуков А.А. и соавт., 1986; Мельман Е.П. и соавт., 1987; Козлов В.И. и соавт., 1989, 1990, 1991; Лещенко В.М. и соавт., 1991). Вместе с тем, до сих пор остается мало изученным другое звено микроциркуляторного русла - лимфатические микрососуды.
В литературе имеются лишь единичные работы, указывающие на возможность влияния НИЛИ на лимфатические сосуды. Так, показано, что облучение гелий-неоновым лазером небольшого участка кожи на передней брюшной стенке крыс вызывает расширение различных по диаметру лимфатических сосудов тонкой кишки и брыжейки (Борисов А.В. и соавт., 1985). В то же время имеются данные о действии НИЛИ на лимфатические микрососуды в условиях патологии. Так, после 10-дневного курса лазерного облучения при дистрофических заболеваниях органа зрения отмечено увеличение линейной скорости лимфотока и диаметра лимфатических сосудов склеры (Шмырева В.Ф. и соавт., 1989). Кроме того, P.Lievens (1985,1986) отметил повышение дренажной функции лимфатических микрососудов при отеке на фоне облучения светом низкоинтенсивного лазера. Отсюда можно было предположить, что излучение гелий-неонового лазера может модифицировать патологические изменения функции лимфатических микрососудов, вызванные иммобилизационно-звуковым стрессом.
Учитывая недостаточную изученность характера влияния ГНЛИ на интактные лимфатические микрососуды, вначале нами было исследовано влияние лазерного излучения на функционирование лимфангионов в физиологических условиях. С этой целью участок брыжейки с исследуемым сосудом, постоянно орошаемый раствором Рингера для теплокровных, облучали светом гелий-неонового лазера (плотность мощности 14 мВт/см2 и 450 мВт/см , время облучения - 15 мин).
Опыты показали, что 15-минутное облучение брыжейки гелий-неоновым лазером при плотности мощности 14 мВт/см2 не вызывает заметных изменений диаметра лимфангионов. В 41% исследуемых сосудов отмечается лишь небольшое увеличение просвета лимфангионов, степень дилатации в среднем составляет 6±0,6 мкм. Уменьшение диаметра в среднем на 9±2 мкм встречается в 43% исследуемых лимфангионов. Диаметр 16% сосудов остается без изменения. Подобные небольшие колебания диаметра, как в сторону увеличения, так и сторону уменьшения, не могут быть расценены как эффекты НИЛИ, поскольку они отражают естественные изменения тонуса лимфатических микрососудов (вазомоции) и характерны для интактных лимфангионов. Следовательно, данная доза лазерного облучения не вызывает существенных изменений диаметра, но сохраняет вазомоции лимфатических микрососудов.
Количество фазноактивных сосудов после облучения ГНЛ при плотности мощности 14 мВт/см" снижается в 2,5 раза (с 55 до 20%). Однако амплитуда фазных сокращений увеличивается на 50% (с 18±2 мкм до 35±5 мкм; р 0,05) (рис. 10). Другой показатель, характеризующий фазную активность лимфангиона, - частота - не изменяется при данной дозе лазерного воздействия и составляет 8-9 сокращений в 1 мин. Количество функционирующих клапанов составляет 57%. Частота работы створок клапана равна 12±2 в 1 мин, что соответствует контрольным значениям. Кроме того, данная доза облучения не изменяет показатели, характеризующие лимфоток. Так, число сосудов с движущейся лимфой составляет 85%, а средняя скорость движения лимфоцитов при действии лазерного излучения равна 230±11мкм/с.
Вместе с тем на фоне облучения наблюдается нарушение ранее регистрируемых корреляционных связей между диаметром сосуда и амплитудой фазных сокращений (г=+0,67 в контроле, г=+0,15 после облучения), а также между диаметром сосуда и частотой фазных сокращений (г=+0,58 в контроле, г=+0,03 после облучения).
Следовательно, ГНЛИ при плотности мощности 14 мВт/см может модифицировать работу интактных лимфатических микрососудов, что выражается в снижении числа фазноактивных микрососудов и увеличении амплитуды их сокращений. Другие показатели, характеризующие состояние лимфомикроциркуляции, при использовании данной дозы облучения не изменяются. В связи с этим возникло предположение, что увеличение дозы облучения за счет плотности мощности излучения, может вызвать более выраженные изменения лимфодинамики, поскольку известно, что влияние ГНЛИ на гемомикроциркуляцию зависит от плотности мощности излучения (Александров М.Т. и соавт., 1986; Охширо Т., Калдерхед Р.Г., 1991; Козлов В.И. исоавт., 1992).
Учитывая этот факт, в следующей серии экспериментов плотность мощности лазерного излучения была увеличена примерно в 30 раз и составила 450 мВт/см2, время облучения не изменялось.
Проведенные исследования показали, что 15-минутное облучение брыжейки ГНЛ (плотность мощности 450 мВт/см ) приводит к расширению более половины (65%) лимфангионов в среднем на 16±1 мкм. Диаметр остальных 35% лимфангионов практически не изменяется.
