Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Пероксиредоксины - новое семейство белков-антиоксидантов 8
2.1.1. Общие свойства 10
2.1.2. Представители подкласса 2-Cys Ргх 13
2.1.3. Нетипичные представители 2-Cys пероксиредоксинов 17
2.1.4. Представители І-Cys пероксиредоксинов 20
2.1.5. Секреторный 28-кДа пероксиредоксин VI 23
2.1.6. Локализация пероксиредоксинов в тканях крыс и культуральных клетках 25
2.1.7. Функционирование пероксиредоксинов в клетке 26
2.2. Регенерация ран 29
2.2.1. Признаки фаз регенерации 31
2.2.2. Роль факторов роста в процессе регенерации ран 32
2.2.3. Замедленная регенерация ран при сепсисе 33
2.3. Исследование влияния антиоксидантных и других веществ на процесс регенерации ран и другие патологические процессы в коже 35
2.4. Исследования динамики экспрессии пероксиредоксинов при различных патологиях 45
3. Постановка задачи исследования 56
4. Материалы и методы 57
4.1. Материалы 57
4.2. Методы 58
4.2.1. Характеристика экспериментов 58
4.2.2. Иммуногистохимический анализ 59
4.2.3. Иммунофлуоресцентный анализ 60
4.2.4. Мечение коньюгата флуоресцентным красителем 61
4.2.5. Приготовление гистологических препаратов кожи 62
4.3. Определение ферментативной активности 63
4.3.1. Определение ферментативной активности пероксиредоксина VI 63
4.3.2. Определение ферментативной активности каталазы 64
4.3.3. Определение ферментативной активности глутатионпероксидазы 65
4.4. Определение общего белка в ранах кожи после механических и термических травм 65
5. Результаты 66
5.1. Исследование динамики экспрессии и секреции пероксиредоксина VI в процессе регенерации ран 66
5.1.1. Модель хирургического надреза 66
5.1.2. Модель ожога кожи 72
5.2. Активность других ферментов-антиоксидантов в коже в норме и в процессе регенерации ран после механических и термических травм 79
5.3. Исследование влияния аппликации пероксиредоксина VI на процесс регенерации ран кожи после надреза 81
5.4. Сравнение лечебного эффекта пероксиредоксина VI с лечебным эффектом обычных средств, применяемых для обработки ран 83
5.4.1. Модель хирургического надреза 87
5.4.2. Модель травмы 89
Обсуждение 100
Выводы 107
Список литературы 108
- Регенерация ран
- Исследования динамики экспрессии пероксиредоксинов при различных патологиях
- Определение ферментативной активности
- Активность других ферментов-антиоксидантов в коже в норме и в процессе регенерации ран после механических и термических травм
Введение к работе
Актуальность проблемы
В процессе метаболизма в организме постоянно образуются активные формы кислорода (АФК), которые в избыточном количестве способны вызывать повреждение биологических макромолекул, мембран, ДНК, что может приводить к развитию патологических состояний. Для эффективной нейтрализации АФК в клетках присутствуют антиоксидантные ферменты: супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза. Кроме того, в защите клеток от негативного действия АФК участвует недавно открытый класс белков-антиоксидантов - пероксиредоксинов, один из представителей которых, пероксиредоксин VI (Ргх VI), идентифицирован и изучается в лаборатории механизмов рецепции ИБК РАН [Андреева С.Г. и др., 1998; Новоселов В.И. и др., 1998а, 1999, 1999а; Новоселов СВ. и др., 1998, 1998а; Камзалов С.С. и др., 1998]. Этот белок способен нейтрализовать как органические, так и неорганические перекиси и, как было показано ранее, Ргх VI экспрессируется в эпителиальных тканях воздухоносных путей и коже, где его вклад в антиоксидантную защиту клеток от АФК составляет 70%. Показано, что нормальное функционирование этих тканей связано с Ргх VI [Peshenko, I.V. et al., 1998; Novoselov S.V. et al., 1999; Novoselov V.I. et al., 1999; Новоселов В.И. и др., 2000]. При различных патологиях кожи (ожоговые травмы, ранения, рак кожи и хронические язвы ног) наблюдается, во-первых, накопление в ткани метаболитов клеток, находящихся в состоянии некроза или апоптоза, причем
АФК составляют значительную часть среди этих метаболитов; во-вторых, в месте поражения развивается воспалительный процесс, который сопровождается инфильтрацией нейтрофилов и макрофагов, продуцирующими АФК и усиливающих окислительный стресс [Brigham PA, McLoughlin Е., 1996; ICreis R.W., 1996; U.S. markets for wound management products., 1997; Phan T. et al., 2002; James T. et al., 2003]. Повреждение клеток и клеточных органелл происходит как результат прямого действия АФК или образования перекисей и продуктов их распада. Таким образом, проблема нейтрализации АФК при различных патологических процессах в коже является очень актуальной.
По имеющимся статистическим данным в США приблизительно 2,5 млн. человек ежегодно обращаются с ожоговыми повреждениями из них 80 тыс. необходима госпитализация и 12 тыс. умирают [Phan Т. et al., 2002]. Ежегодно 6,5 млн. страдают от хронических язв ног, возникающих из-за сдавления при травмах, болезней вен или диабета [Brigham Р.А., McLoughlin Е., 1996; U.S. markets for wound management products. 1997; Boulton A., 1998]. Ежегодно около 1 млн. человек в США заболевают раком кожи. Рак кожи может быть вызван как повышенной радиацией, так и длительным воспалительным процессом. В воспалительном процессе участвуют лейкоциты, которые продуцируют избыточное количество АФК, их длительное действие вызывает окислительный стресс, также приводящий к раку кожи. Для лечения ожогов в США тратится биллионов долларов ежегодно [ICreis R.W., 1996]. В Англии затраты на лечение хронических язв ног оцениваются 236 млн. долларов в год. Язвы ног- обычная причина госпитализации среди больных диабетом на Западе, и уход за такими пациентами представляет основной компонент расходов, который оценивается свыше 500 млн. долларов в США и 15 млн. долларов в год в Англии [Boulton А., 1998]. Одна из проблем пациентов с большой поверхностью раны является медленное раневого затягивания раны и предотвращение долговременного стягивания и формирования рубца. Для того чтобы снизить процент больных с ожогами и улучшить качество жизни пациентов с проблематичными ранами необходимо ускорить заживление ран и процесс регенерации. За последние два десятилетия много сделано в установлении молекулярных и клеточных механизмов регенерации ран, а также в биохимии, физиологии и патологии лечения ран. В настоящее время разрабатывается применение прогрессивных технологий (тканевая инженерия кожи, рекомбинантные факторы роста, генная терапия и др.) в лечении ран. Имеющиеся статистические данные по США и Восточной Европе свидетельствует, что возрастает процент выживающих и улучшается качество жизни многих пациентов с большими ожоговыми повреждениями и долго незаживающими, хроническими ранами [Brigham Р.А., McLoughlin Е., 1996; U.S. markets for wound management products. 1997; Boulton A., 1998; Phan T. et al., 2002]. Однако широкое клиническое применение этих технологии все еще ограничивается их стоимостью [Peacock Е. et al., 1983].
Регенерация ран
Регенерация - обновление структур организма в процессе жизнедеятельности и восстановление тех структур, которые были утрачены в результате патологических процессов. Различают два вида регенерации: физиологическую (непрерывное обновление структур на клеточном и внутриклеточном уровнях, которым обеспечивается функционирование органов и тканей) и репаративную (процесс ликвидации структурных повреждений после действия патогенных факторов). В ряде случаев у млекопитающих в результате регенерации в зоне повреждения образуется не специфическая для данного органа ткань, а рубец — соединительная ткань, в дальнейшем подвергающаяся рубцеванию, что обозначают как неполную регенерацию. Рубец - участок соединительной ткани, замещающий дефект кожи, слизистой оболочки, органа или ткани, возникший в результате их повреждения или патологического процесса. К развитию рубца приводят ожоги, отморожения, различные другие повреждения и хронические воспалительные процессы. Рубцевание, особенно на большом участке, сопровождается стягиванием краев заживающей раны, что приводит к деформации органов и тканей. Иногда даже крупные рубцы в толще органа могут не вызывать функциональных изменений, в то время как мелкие рубцы, но локализующиеся, например, в проводящей системе сердца, зрительном тракте, спинномозговом канале, обусловливают тяжелые функциональные расстройства. Рубцы на лице приводят к косметическим дефектам, в области суставов - к развитию контрактур. При локализации рубцов в области естественных отверстий и в полых органах возможно развитие частичной или полной непроходимости.
Например, рубец, образующийся при заживлении язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, нередко является причиной пилородуоденального стеноза или деформации желудка, рубец в оболочках и ткани головного мозга может быть причиной очаговых мозговых расстройств, эпилептических припадков. Разновидностью рубцов являются спайки, возникающие в полостях тела при организации экссудата, очагов некроза, кровоизлияний и др. В ряде случаев, особенно после ожогов, нормальное созревание рубца нарушается, в нем длительно сохраняются сосуды, а фибробласты продолжают продуцировать атипичные коллагеновые волокна. Такой рубец называется келоидный. Микроскопически рубец состоит из сосудов, фибробластов и коллагеновых волокон. Формированию рубца обычно предшествует воспаление и развитие грануляционной ткани. Морфологической особенностью грануляционной ткани является разнообразный клеточный состав: фибробласты, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты, макрофаги и тучные клетки. Фиброласты грануляционной ткани, в отличие от обычных, большего размера с увеличенным числом митохондрий, гипертрофией аппарата Гольджи и шероховатого эндоплазматического ретикулума. Повышенная биосинтетическая активность фибробластов грануляционной ткани стихает в процессе развития рубца, и они превращаются в "покоящиеся" фиброциты [Петровский Б., 1977]. Регенерация ран это активный, динамичный каскад событий, вызванных повреждением и длящийся до восстановления целостности ткани. Он может быть разделен на отдельные фазы, которые характеризуются по преобладанию клеточной популяции и клеточной функции. Разрушение ткани вызывает кровотечение и запускает каскад свертывания крови. Активация тромбоцитов в виде дегрануляции и адгезии приводит к остановке кровотечения и хемотаксису воспалительных клеток. Воспалительная фаза регенерации (5 дней после повреждения) характеризуется инфильтрацией нейтрофилов с последующей заменой макрофагами и лимфоцитами. Каждая популяция клеток действует в ответ на специфические цитокины, которые временно высвобождаются в процессе нормальной регенерации. Первоначальная в процессе регенерации ран функцией нейтрофилов является очищение раневого окружения выработкой АФК, которые убивают бактерии и фагоцитарная функция, удаления некротического материала. Хотя для оптимальной регенерации требуется присутствие различных клеточных популяций, только макрофаги являются абсолютно необходимыми (в ранах с отсутствием инфекции) [Singer A. and Clark R. 1999; Шапошников Ю. Г. и др., 2002]. Фибропластическая фаза является второй фазой регенерации ран (с 4 до 12 дня после повреждения).
Макрофаги продуцируют факторы роста и другие цитокины, которые затем стимулируют миграцию фибробластов, пролиферацию и синтез коллагена. В процессе этой фазы восстанавливается целостность ткани, до конца доводятся эпителизация и процессы восстановления кровеносных сосудов и других кожных дериватов. Нагноение и реконструирование соединительнотканного рубца начинается в течение фибропластической фазы и характеризуется реорганизацией предварительно синтезированного коллагена. Коллаген разрушается за счет металлопротеиназы, которая локализуется в матриксе кожи, и сеть коллагена в ране является результатом баланса между лизисом и синтезом коллагена [Singer A. and Clark R. 1999]. акторы роста - полипептидные субстанции, функция которых состоит в стимуляции миграции, пролиферации и других функций клеток (табл. 3). Их названия часто происходят от тех клеток, из которых они были впервые извлечены (например, извлеченный из тромбоцитов фактор роста PDGF) или по тем функциям, которые первоначально были у них установлены (например, фактор роста фибробластов). Однако эти названия обманчивы, так как факторы роста имеют множественные функции (и эти функции продолжают определяться). Большинство факторов роста очень эффективны и вызывают эффекты обычно в наномолярных концентрациях. Они могут действовать аутокринным способом (когда факторы роста действуют на клетки, продуцирующие их), паракринным способом (через высвобождение их во внеклеточное окружение, где они действуют непосредственно на ближайшие
Исследования динамики экспрессии пероксиредоксинов при различных патологиях
В настоящий момент мало известно об экспрессии пероксиредоксинов в норме и в патологических состояниях, например при дегенерации сухожилий, которая часто поражает пожилых людей и приводит к травмам. Точная природа дегенерации сухожилия недостаточно понятна. Однако исследования показали, что данная патология, является следствием возрастных изменений в метаболизме сухожилия [Chard М. et al., 1989; Riley G., 1994; Riley G., et al., 1994; Blevins F. et al., 1997]. Причем, к одному из важных факторов, вызывающих тканевые изменения, связанные с возрастом, относится окислительный стресс, который вызывают АФК [Lavrovsky Y. et al., 2000]. Как известно, небольшие количества АФК, таких как Ог", Н2О2, ОН и NO , постоянно образуются в ходе нормального клеточного метаболизма и играют важную роль во многих биохимических процессах, включая трансдукцию сигнала [Finkel Т. et al., 1998], клеточную дифференциацию и иммунитет [Mates J. et al., 1999]. Однако, когда АФК образуются в избытке или не инактивируются соевременно они действуют как оксиданты, что может приводить к гибели клеток [Chandra J. et al., 2000] и тканевым повреждениям [Yu В., 1994; Mignotte В. and Vayssiere J., 1998]. Все больше появляется доказательств, что АФК играют значительную роль в возрастных процессах [Melov S., 2000; Osiewacz Н. and Borghouts С, 2000; Droge W., 2002], а также в патогенезе атеросклероза [Dhalla N. et al., 2000], дегенерации нервной системы [Knight J., 1997; Болдырев A.A. 1998], раке [Klauning J. et al., 1998; Wright R. et al., 1999], ревматоидных артритах [Bauerova К. and Bezek A., 1999; Kerimova A. et al., 2000] и остеоартритах [Roberts С. et al., 1989; Murrell G. et al., 1995; Tiku M. et al., 1990; Tiku M. et al., 2000]. В норме клетки млекопитающих имеют несколько антиоксидантных защитных механизмов, лимитирующих тканевые повреждения, вызванные АФК. К тканевым антиоксидантам относятся различные эндогенные ферменты: каталаза, пероксидазы, супероксиддисмутаза и глютатионпероксидаза [Mates J. and Sanchez-Jimenez F., 1999]. При излишках образования АФК или при ослаблении антиоксидантной защиты нормальный окислительный-восстановительный баланс нарушается, приводя к патологическим или клиническим проявлениям [Mates J. et al., 1999]. Было высказано предположение, что Ргх V - новая тиоредоксиновая пероксидаза, которая играет важную роль в защитных механизмах от окислительного стресса, может вовлекаеться в процесс дегенерации сухожилий [Wang М., et al., 2001]. Ргх V широко экспрессируется клетками млекопитающих и локализуется внутри клеток в митохондриях, пероксисомах и цитоплазме. Предварительные данные показали, что в нормальном сухожилии Ргх V экспрессируется в фибробластах. При изучении дегенеративных сухожилий человека наблюдалось значительное увеличение экспрессии Ргх V нормальными фибробластами, окружающими дегенеративную ткань, и эндотелиальными клетками. Авторы акцентируют внимание на том, что основными компонентами дегенеративной ткани являются округлые, незрелые фибробласты, которые не экспрессировали Ргх V. Кроме того, дегенеративная ткань при данной патологии подобна гистологически поврежденной ткани, которая образуется в слабых сухожилиях, которые чаще подвержены разрывам [Khan К. et al., 1999], а также образуется при растяжении крепких нормальных сухожилий. Исходя из значительного увеличения экспрессии Ргх V авторы предполагают, что окислительный стресс вовлекается в патогенезис дегенерации сухожилия и именно сверхэкспрессия Ргх V защищает окружающую не дегенеративной ткань от окислительного стресса в течение этого патологического процесса.
Кроме дегенеративных изменений сухожилий с возрастом у большинства женщин наступают дегенеративные изменения в костях, которые приводят к остеопорозу. Последние исследования также показали, что у больных, страдающих от остеопороза, в плазме крови происходит истощение пула всех известных антиоксидантов и значительное усиление окислительного стресса [MaggioD. etal.,2003].Эпителий воздухоносных путей постоянно подвергается действию неблагоприятных факторов окружающей среды и в норме обладает мощной антиоксидантной системой защиты. При различных заболеваниях в воздухоносных путях возникает воспалительный процесс, приводящий к дисбалансу в системе оксидантов — антиоксидантов [Yang J. et al., 2002]. Недавно были проведены исследования экспрессии всех 6 типов пероксиредоксинов в эпителии легких и бронхов в норме и при патологии в гранулемах и саркоидозах [Kinnula V. et al., 2002]. Было показано, что ни каталаза, ни глутатионпероксидаза не индуцируются в течение острого окислительного стресса в эпителиальных клетках бронхов человека [Erzurum S. et al., 1993; Comhair S. et al., 2000]. В нормальном легком пероксиредокины III, V и VI обнаруживают среднею или высокую экспрессию. Предварительные данные также показали, что бронхиальный эпителий человека содержит Тгх и Тгх R и что их экспрессия увеличивается у больных с различными типами пневмоний. Исследования показали индукцию Тгх у пациентов с саркоидозами (образованьями эпителиоидно-клеточных саркоидозных гранулем, развитие которых сопровождается дистрофическими и некротическими изменениями окружающих тканей и процессом рубцевания). Предпологается, что высокая экспрессия Ргх III, V и VI в нормальном альвеолярном и бронхиальном эпителии, а также в альвеолярных макрофагах, вызвана тем, что они образуют важную первичную защитную систему в легких организма [Kinnula V. et al., 1992; Kinnula V. et al., 1994]. Исследования, проведенные на культуральных альвеолярных эпителиальных клетках, бронхиальных эпителиальных клетках и плевральных мезотелиальных клетках, показали, что они экспрессируют всех представителей семейства пероксиредоксинов. Альвеолярные макрофаги и моноциты имеют высокую активность каталазы и глутатионредуктазы, а также экспрессируют Ргх І, Ш и V [McDonald R. et al., 1991; Pietarinen P. et al., 1995]. Наблюдается экспрессия пероксиредоксинов I, III, V и VI в макрофагах и в пневмоцитах II типа биопсийных образцов контрольного легкого у людей. Некоторые из этих белков могут индуцироватся оксидантами и цитокинами [Kang S. et al., 1998]. Количество Ргх I, II и III увеличивается у пациентов в
Определение ферментативной активности
Активность пероксиредоксина VI определяли по его способности защищать"У і глутаминсинтетазу от инактивации Fe /ДТТ/О2 окислительной системой, генерирующей перекиси и свободные радикалы. Смесь (20 мкл белка, 20 мкл глутаминсинтетазы и 20 мкл смеси 3 мМ ДТТ и Змкм FeCl 3) инкубировали 10 мин при 37 С. Затем добавляли 200 мкл смеси (глутамин - 100 мМ, АДФ - 0.4 мМ, MnCl 2 - 0.4 мМ, арсенат калия - 10 мМ, гидроксиламин - 20 мМ, HEPES 50 мМ, рН 7.4), инкубировали 10 мин при 37 С и затем приливали 100 мкл стоп-раствора (FeCb - 0.37 М, НС1 - 0.67 М, трихлоруксусная кислота - 0.2 М). Поглощение образующегося комплекса гамма-глутамилгидроксамата-Fe регистрировали при 540 нм на Multiscan Plus (Финляндия). Активность пероксиредоксина VI определялась как концентрация белка в пробе, при которой происходила 50% защита активности глутаминсинтетазы в системе Ре3+/ДТТ/02.
Каталазнау активность измеряли при помощи прямого измерения снижения концентрации перекиси водорода [Peshenko I.V. et al., 1998; Novoselov V.I. et al., 1999]. Реакция инициировалась добавлением 0,5 мМ Н2Ог в реакционную смесь, содержащую 50 мМ HEPES (рН 7,5) и образец белка. Измерение проводили при 25С. После соответствующего промежутка времени к реакционной смеси добавляли стоп-раствор 0,05 мл НС1 (концентрация 0,6 М). Затем в реакционную смесь добавляли 0,1 мл Fe(NH4)2(S04)2 (концентрация 10 мМ) и 0,05 мл KSCN (концентрация 2,5 М). Концентрацию Н2Ог измеряли при длине волны 480 нм. Измерение оптической плотности образцов проводили на Labsystems Multiskan Plus (Финляндия).
Глутатион пероксидазную активность измеряли спектрофотометрически при 25С по модифицированной методике [Shichi and Demar, 1990]. Состав стандартной смеси: 50 Мм Трис/HCl, (рН 7,2), 1 мМ NaN3, 1мМ GSH, 0,25 мМ Н2О2. Пробы инкубировали 5 мин при 38С. Затем добавляли по 0,2 мл 1мМ DTNB. Концентрацию глутатиона измеряли при 405 нм на Labsystems Multiskan Plus (Финляндия). При построении таблиц 3, 4 по динамике активностей ферментов-антиоксидантов использовали значения измерений полученных в трех сериях экспериментов (л=18), по которым определяли среднее значение и среднеквадратичное отклонение.
Кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95%-ного этилового спирта. Добавляли 100 мл 85%-ной (масс/об.) фосфорной кислоты. Разбавляли водой до 1 л. Использовали образец, содержащий 10-100мкг белка в 0,1 мл. Добавляли 5,0 мл реагента-красителя. Через 30 мин измеряли поглощение при 595 нм. Для микроанализа использовали образец, содержащий 1-10 мкг белка в 0,1 мл, добавляли 1 мл раствора красителя, смешивали и определяли поглощение при 595 нм. Концентрацию белка находили по градуировочному графику [Anal. Biochem., 1978].Для исследования забирали крыс через 8 часов, 1 сутки, 2 суток, 8 суток и 13 суток после надреза. Как видно на рисунке 4, через 8 часов после надреза происходило увеличение количества пероксиредоксина VI по краям раны и внутри раны.
Параллельные гистологические исследования показали, что края раны были плотно окружены молодыми фибробластами, которые секретировали пероксиредоксин VI во внеклеточный матрик и в раневое пространство (рис. 5(2-4)). Через 1 сутки после надреза по краям раны наблюдалось большое скопление молодых фибробластов (рис. 5(1)). Эти фибробласты имели повышенный уровень экспрессии пероксиредоксина VI и секретировали его во внеклеточный матрикс (рис. 5(3)). Максимальное содержание пероксиредоксина VI наблюдалось, через 2 суток после надреза (рис. 4(5)). Пероксиредоксин VI увеличивался по краям раны, в новообразованном эпидермисе и в окружающем рану внеклеточном матриксе (рис. 4(5)).
Активность других ферментов-антиоксидантов в коже в норме и в процессе регенерации ран после механических и термических травм
Активности каталазы и глутатионпероксидазы через 2, 8, 13 суток после надреза и ожога, в целом, были ниже нормы. Исключение составляет каталаза, активность которой через 2 суток после надреза увеличивалась более чем в 2 раза (табл. 4, рис. 12). Предварительные исследования показали, что данное увеличение активности каталазы в экстрактах ткани происходит за счет большого количества эритроцитов, которые присутствуют в экстрактах ран кожи через 2 суток после надреза. При гомогенировании, центрифугировании кожи происходило повреждение кровеносных сосудов, эритроциты разрушались и внутриклеточная каталаза (защищающая гемоглобин от АФК), попадала в супернатант. Исследовать активность каталазы после ожога именно в ткани было невозможно, так как во всех экстрактах ран наблюдалось большое количество разрушенных эритроцитов. Показания ферментативной активности каталазы в таких пробах не свидетельствуют о ее антиоксидантном участие в процессе регенерации ран кожи. Таким образом, при механических и термических травмах каталаза и глутатионпероксидаза не играют основную роль в качестве антиоксидантов в процессе регенерации ран.Полученные результаты показали, что экспрессия пероксиредоксина VI существенно увеличивалась в процессе регенерации ран и, что молодые фибробласты рубца экспрессировали пероксиредоксин VI. Поэтому в дальнейшем мы решили исследовать действие аппликации пероксиредоксина VI на процесс регенерации раны и образование рубца.
Использование натурального пероксиредоксина VI (EMB/GenBank, Y 17295) является затруднительным из-за его высокой стоимости и сложности получения (так с одной крысы можно получить 1 мкг белка). Поэтому для обработки ран использовали рекомбинантный человеческий пероксиредоксин VI (EMB/GenBank D1 4662). Предварительные исследования показали, что его антиоксидантные характеристики практически не отличаются от натурального пероксиредоксина VI. Эксперименты in vivo показали, что с применением пероксиредоксина VI регенерация раны происходила в значительно быстрее (рис. 13). Характерной особенностью ран при применении пероксиредоксина VI было то, что они не переходили в длительную воспалительную фазу, причиной которой по литературным данным, является инфекция. Таким образом, возможно, что аппликация пероксиредоксина VI способствовала ускорению фагоцитирования инфекции нейтрофилами и макрофагами в ране и, тем самым, являлась причиной ускорения заживления ран. Проведенные гистологические исследования показали, что при аппликации пероксиредоксина VI на рану рубец был значительно меньше (рис. 14). Исследование регенерации нестерильных ран (модель травмы) показало, что все раны переходили в длительную воспалительную фазу. Применение пероксиредоксина VI в такой модели существенно сокращало длительную воспалительную реакцию, но чаще всего полностью предотвращало ее. Сравнение клеточного состава рубца через 8 суток после хирургического надреза показало, что аппликация пероксиредоксина VI значительно уменьшала число нейтрофилов, макрофагов, тромбоцитов, лимфоцитов и эритроцитов, которые характерны для воспалительной фазы регенерации ран (табл. 6). Кроме того, число молодых фибробластов в рубце при аппликации пероксиредоксина VI было значительно меньше (табл. 6, рис. 14 и 15 (1а, 2а)).
Для сравнения лечебного эффекта пероксиредоксина VI мы использовали бактерицидный пластырь, бриллиантовый зеленый и раствор фурацилина, которые обычно применяются в травматических пунктах на практике при механических травмах кожи или хирургических вмешательствах. В качестве альтернативного белка мы использовали БСА. Примечание: а) рассчитано по 18 срезам 0,049 х 0,068 мм из 3 серий экспериментов (п=18);б) процентное соотношение клеток рассчитано при условии, что общееколичество клеток в каждом случае принято за 100%;в) в интактной коже не присутствуют молодые фибробласты, в этом случаебыли подсчитаны зрелые дермалъные фибробласты.
