Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. СВЯЗЬ ДИНАМИКИ ПРОТОПЛАЗМЫ С СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВ
НОСТЬЮ ПЛАЗМОДИЯ МИКСОМИЦЕТА . 9
I. Взаимодействие сократительной активности плазмодия миксомицета с переносом протоплазмы ... 9
2. Структурные и молекулярные основы сократительной активности плазмодия миксомицета 16
3. Золь-гель преобразования протоплазмы 21
4. Некоторые закономерности хемотактических реакций 25
5. Температурные зависимости параметров подвижности 29
ГЛАВА 2. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ЛАЗЕРНОЙ ДОПЛЕРОВСКОЙ АНЕМОМЕТРИИ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ СКОРОСТИ ПОТОКА ПРОТОПЛАЗМЫ В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ 35
I. Характеристики гетеродинной схемы ЛДА .. 36
2. Трудности обработки сигнала ЛДА от направленных потоков в живых клетках 45
3. Расчет спектра мощности сигнала однолучевого измерителя скорости в тонком плоском канале с оптически неоднородной стенкой 52
4. Экспериментальное обоснование рассчитанного спектра 62
5. Выводы 74
ГЛАВА 3. ТЕПЛОВЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА РИТМИКУ ЧЕЛНОЧНОГО ТЕЧЕНИЯ
ПРОТОПЛАЗМЫ В ТЯЖАХ ПЛАЗМОДИЯ МИКСОМИЦЕТА 78
I. Экспериментальная установка и методика измерений 79
2. Зависимости статистических характеристик колебаний от температуры 92
3. Нестационарные тепловые воздействия на ритмику челночного транспорта протоплазмы
4. Выводы 117
ГЛАВА 4. МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МОДЕМ ПОДВИЖНОСТИ ПЛАЗМОДИЯ МИКСО-
МИЦЕТА 121
I. Механическая модель тяжа плазмодия 122
2. Модель периодической сократительной активности тяжа с учетом структурной перестройки сократи
тельного аппарата 131
3. Моделирование сократительных ритмов, регулируемых изменениями концентрации ионов кальция. 137
4. Обсуждение результатов моделирования 144
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 146
- Взаимодействие сократительной активности плазмодия миксомицета с переносом протоплазмы
- Характеристики гетеродинной схемы ЛДА
- Экспериментальная установка и методика измерений
- Механическая модель тяжа плазмодия
Введение к работе
Подвижность живых организмов составляет одну из фундаментальных проблем биофизики. Несмотря на многообразие конкретных проявлений биологической подвижности, в ее основе лежит несколько общих молекулярных механизмов. Основным компонентом двигательного аппарата большинства эукариот является актомиозиновый белковый комплекс, обеспечивающий механохимическое преобразование энергии, высвобождающейся при гидролизе АН. Универсальность молекулярной структуры биологических двигательных систем придает значительную степень общности результатам исследований биологической подвижности на самых различных уровнях,
В последние годы внимание исследователей в нашей стране и за рубежом привлекает автоколебательный характер временной организации процессов подвижности, свойственный в той или иной мере как отдельным клеткам, так и многоклеточным системам высокоорганизованных организмов.
На уровне живой клетки ритмичность важнейших типов подвижности: сократительной активности и транспорта протоплазмы особенно ярко выражена в плазмодии миксомицета Phvsarum роусе-pfUtum . За последнее десятилетие число работ, посвященных исследованию этого объекта, резко возросло. На его примере интенсивно изучаются молекулярная структура и принципы работы немышечных сократительных систем, механизмы взаимодействия сократительной деятельности и массопереноса протоплазмы, природа автоколебательных и автоволновых процессов в распределенных живых системах.
Сложность, взимосвязанность и выраженная нестационарность перечисленных явлений требует комплексного подхода к их изучению, разработки методов невозмущающего контроля сократительной активности, скорости течения протоплазмы внутри клетки и других ее параметров в реальном масштабе времени, широкого использования разнообразных способов воздействия на объект и построения математических моделей внутриклеточных процессов и клетки в целом»
Нестационарные воздействия (в том числе тепловые) на живую автоколебательную систему могут быть использованы для выяснения устройства клеточных часов. Эффективность подобных методов применительно к автогенераторам небиологического происховдения позволяет надеяться на успех и в экспериментах с живыми объектами.
На протяжении многих лет исследование внутриклеточной гидродинамики и процессов массопереноса было сопряжено с большими техническими трудностями. В настоящее время разработаны методы дистанционного бесконтактного измерения скоростей потоков жидкости с помощью лазерных доплеровских анемометров (ЛДА). Однако, применение ЛДА в биофизических экспериментах осложняется тем, что оптическая неоднородность стенок биологических объектов нарушает когерентные свойства зондирующего лазерного излучения, осложняет обработку сигналов и интерпретацию результатов измерений. Таким образом, актуальным является анализ наиболее пригодных для использования в биофизике оптических схем ЛДА и проведение теоретических и экспериментальных исследований сигналов ЛДА с учетом указанных факторов для повышения достоверности выводов на базе экспериментальных данных.
Основной целью работы явилось исследование процессов, определяющих автоколебательный характер подвижности плазмодия мик-сомицета методами стационарных и быстропеременных температурных воздействий, лазерного зондирования и математического моделирования.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
Разработана и создана специализированная экспериментальная установка, включающая двухсекционный быстродействующий управляемый термостат, лазерный доплеровский анемометр, автоматическую систему регистрации.
Предложена эффективная методика регистрации интенсивности массопереноса протоплазмы в тяжах плазмодия миксомицета по изменениям мощности сигнала ЛДА, обеспечивающая возможность проведения длительных (от I до 12 часов) измерений челночных колебаний потока протоплазмы и высокую точность регистрации их периода.
Впервые исследованы статистические характеристики периода пульсаций скорости течения протоплазмы при стационарных тепловых условиях в диапазоне температур 15-30С.
Проведены эксперименты по скачкообразному (на 2 и более градусов) температурному воздействию на плазмодий, а также впервые осуществлены эксперименты по синхронизации внутриклеточных ритмов периодическим изменением температуры окружающей среды.
Теоретически и экспериментально показано, что нарушение пространственной когерентности лазерного пучка, зондирующего поток жидкости в канале с оптически неоднородными стенками, приводит к уширению спектров сигналов ЛДА. Полученные результаты использованы для оценки скорости течения протоплазмы в плазмодии миксомицета с учетом оптической неоднородности стенок тяжей.
Предложены математические модели сократительной активности плазмодия миксомицета, учитывающие частичные структурные перестройки сократительного аппарата и триггерный механизм вы- свобождения регулятора сократительной деятельности в результате деформаций стенок тяжей.
Материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах, докладывались и обсуждались на X Всесоюзной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Киев,1980), III Всесоюзном совещании по нёмышечной подвижности (Цущино,І98І), ІУ Всесоюзном совещании по немышечной подвижности (Чернигов,1984), Всесоюзном симпозиуме "Механизмы временной организации клетки и их регуляция на различных уровнях" (Пущино,1983), I Всесоюзном биологическом съезде (Москва,1982), научно-технической конференции "Метрологическое обеспечение измерений в медицине и биологии" (Таллин, 1983), Московской городской конференции "Информатика, вычислительная техника, автоматизация в науке, технике и народном хозяйстве" (Москва,1983).
Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы.
В первой главе,на основании имеющихся в литературе данных, обсуждаются возможные механизмы организации и регулирования ритмической сократительной активности и челночного транспорта протоплазмы в плазмодии миксомицета. Дан обзор основных сведений о морфологии тяжей, о структуре и молекулярном механизме работы сократительного аппарата, роли золь-гель преобразований протоплазмы в обеспечении ритмической активности и миграции плазмодия. Суммируются данные по внешним воздействиям на ритмику сокращений.
Во второй главе проведено теоретическое и экспериментальное исследование зависимости спектра сигнала однолучевого ЛДА от рассеивающих свойств стенок плоского стеклянного канала, моделирующего биологический объект. Сделан вывод, что спектр сигнала .-8-.
ЛДА от плазмодия миксомицета определяется нарушением пространственной когерентности зондирующего лазерного пучка, приводящего к сильному уширению наблюдаемых спектров и подавлению их доплеровских составляющих. Обсуждаются проблемы, связанные с использованием ЛДА в биофизическом эксперименте.
В третьей главе представлены результаты температурных экспериментов, в которых плазмодий, мигрирующий по агаровой пленке в чашке Петри, подвергался стационарным и резко нестационарным тепловым воздействиям. Получены температурные зависимости периода челночных колебаний протоплазмы в диапазоне 1(К30оС, исследованы статистические характеристики периода этих колебаний, выявлены закономерности, связанные с медленными модуляциями периода во времени. Проведены эксперименты по скачкообразному температурному воздействию на плазмодий. Обнаружено существенное различие его реакции на понижение и повышение температуры. Высказано предположение о влияние золь-гель преобразований протоплазмы на частоту клеточного ритма. Впервые осуществлена синхронизация внутриклеточной сократительной активности периодическим тепловым воздействием.
В четвертой главе рассмотрены математические модели автоколебательной активности плазмодия миксомицета. В рамках "двухкамерной" модели плазмодия показана возможность возникновения автоколебательной активности при запаздывающих структурных перестройках сократительного аппарата и триггерном механизме высвобождения регулятора сокращений (ионов Са .) вследствие деформаций стенок тяжей. Подучены численные оценки параметров автоколебаний близкие к наблюдаемым величинам.
В заключении перечислены основные выводы из проделанной работы, которые выносятся на защиту.
class1 СВЯЗЬ ДИНАМИКИ ПРОТОПЛАЗМЫ С СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВ
НОСТЬЮ ПЛАЗМОДИЯ МИКСОМИЦЕТА class1
Взаимодействие сократительной активности плазмодия миксомицета с переносом протоплазмы
Плазмодий миксомицета Physapum po vcepKM-um представляет собой многоядерный цитоплазматический синцитий, растущий напитательном субстрате в виде пленки. Он может достигать гигант-ских размеров (площадью до I м6 л толщиной до I мм), оставаясь единой клеткой, способной к перемещению при истощении в субстрате питательных веществ. Миграция плазмодия реализуется преимущественным переносом массы протоплазмы в направлении перемещения и сопровождается непрерывным воссозданием характерной миграционной формы (рис.1). Фронтальная область имеет вид утолщенной по кромке пленки, пронизанной сетью каналов текущей протоплазмы. По мере удаления от фронта диаметр каналов увеличвается, они отчетливо выделяются на фоне пленки (зона каналов), постепенно переходя в разветвленную сеть анастомозирующих тяжей, уже не связанных между собой пленкой (зона тяжей).
В плазмодии можно различить два состояния протоплазмы. Непосредственно под мембраной находится стационарная, обладающая упругостью гелеобразная эктоплазма, формирующая стенки каналов и тяжей. Она ограничивает более жидкую, золеподобную эндоплазму, которая движется относительно стенок, ритмически меняя величину скорости и ее направление с периодом 1-3 мин Скорость потока в крупных тяжах может превышать I мм/сек [Д] . Возвратно-поступательное (челночное) движение эндоплазмы связано с периодической сократительной активностью эктоплазматических стенок тяжей и пленки в фронтальной области. Многочисленные эксперименты показывают, что течение эндоплазмы представляет собой пассивный перенос жидкой фазы протоплазмы по градиенту внутриклеточного давления, генерируемого сокращениями стенок [l»4]
Характеристики гетеродинной схемы ЛДА
Достоинства методов лазерной доплеровской анемометрии применительно к исследованию внутриклеточной подвижности обсуждаются в литературе [48,49] . В ряде задач они являются незаменимым средством для получения экспериментальных данных о потоках биологических жидкостей, таких как протоплазма, кровь, лимфа [бО,5і] К наиболее существенным достоинствам лазерной анемометрии относят : бесконтактность, потенциально высокую точность и локальность измерений, относительную простоту оптической схемы лазерного доплеровского анемометра (ЛДА). Вместе с тем, необходимо учитывать, что сигнал ЛДА содержит информацию о скорости движения жидкости в объеме конечных размеров и отражает все особенности потока в пределах этого объема. В связи с этим возникает необходимость в расшифровке сигнала ЛДА с целью получения достоверной информации о характере потока. В настоящее время разработаны методы, позволяющие определять скорость течения в лами- . нарных безградиентных потоках [52] , в простейших случаях восстанавливать профиль скорости потока по спектру сигнала ЛДА, измерять ряд параметров турбулентных потоков [бз] . Однако, на сигнал ЛДА могут оказывать влияние не только особенности исследуемых течений, но и оптические характеристики изучаемого объекта. Трудности интерпретации результатов измерений в каждом конкретном эксперименте состоят в выяснении того, какие параметры рассматриваемой системы наиболее существенным образом влияют на сигнал анемометра.
class3 ТЕПЛОВЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА РИТМИКУ ЧЕЛНОЧНОГО ТЕЧЕНИЯ
ПРОТОПЛАЗМЫ В ТЯЖАХ ПЛАЗМОДИЯ МИКСОМИЦЕТА class3
Экспериментальная установка и методика измерений
Экспериментальная установка для регистрации параметров пульсирующего течения протоплазмы в тяжах плазмодия миксомицета представляла собой типичный однолучевой ДДА .Световой пучок от гелий-неонового лазера ( = 0.63 мкм) ЛГ-44 (I) фокусировался линзой (3) на тяж плазмодия, помещенного в термостате (15). Мощность зондирующего пучка устанавливалась менее I мВт с помощью набора фильтров (2). Как показывает опыт, локальное облучение плазмодия красным светом такой мощности не оказывает на него заметного действия. Рассеянное излучение собиралось стандартной приемной оптической системой (4) и направлялось на фотоприемник (5) (ФЭУ-51). Сигнал с ФЭУ визуально контролировался по осциллографу (6) и поступал далее на ЭВМ (7), или на систему аналоговой обработки (8) в зависимости от характера эксперимента. Программное обеспечение ЭВМ JJ58] позволяло осуществлять быстрое преобразование Фурье (БШ) сигнала, визуализировать регистрируемый спектр с интервалом около I сек на графическом дисплее (9), накапливать поступающую информацию на магнитных дисках (Ю), сглаживать полученные спектры, производить их аппроксимацию и т.п. обработку, определять значение частоты - 0 , соответствующее высокочастотной границе области существования спектральной плотности сигнала и выводить необходимую информации.
class4 МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МОДЕМ ПОДВИЖНОСТИ ПЛАЗМОДИЯ МИКСО-
МИЦЕТА class4
Механическая модель тяжа плазмодия
Основной задачей рассматриваемых в настоящей главе математических моделей плазмодия миксомицета является оценка справедливости гипотез, касающихся роли различных структурных элементов протоплазматических тяжей, их динамики и взаимодействия друг с другом для обеспечения ритмической сократительной активности и челночного транспорта протоплазмы.
Экспериментальные данные о структуре тяжей и регуляции их сократительной деятельности в настоящее время ещё не позволяют выделить какой-либо механизм, играющий главную роль в организации ритмики сократительной активности. В связи с этим рассматриваются различные модели, преимущественно качественного характера, которые можно разделить на два класса. Первый - это модели, не учитывающие влияние механических параметров системы на ритм клеточных часов, который, как предполагается в этом случае, задается циклическими биохимическими процессами. Они обеспечивают периодическое изменение концентрации регуляторов сократительной активности цитоплазматического актомиозина и задают ритм сокращений протоплазматических тяжей. Второй класс моделей рассматривает механические свойства системы как составную часть клеточных часов, связывает деятельность регуляторной системы и сократительного аппарата с механическими параметрами тяжей, а именно, с изменениями их конфигурации и механическими напряжениями и деформациями. Экспериментальные результаты, полученные в последние годы, позволяют отдать предпочтение моделям второго типа.
В настоящей главе диссертации рассматриваются математические модели периодической сократительной активности плазмодия, основанные на двух наиболее твердо установленных фактах: наличии структурных перестроек сократительного аппарата, связанных с золь-гель преобразованиями протоплазмы, и роли ионов Са +, как регулятора сократительной активности актомиозинового геля, формирующего стенки тяжей.
Для описания взаимодействия регулирующих факторов, структурных изменений сократительного аппарата и механических свойств тяжей используется "двухкамерная" модель Г7і] , позволяющая рассматривать плазмодий как систему со сосредоточенными параметрами, что значительно упрощает учет вышеупомянутых факторов.
