Введение к работе
Актуальность проблемы. Колебания уровня цитозольного кальция являются важным параметром клеточной сигнализации, который запускает и регулирует секрецию межклеточных трансмиттеров и активирует экспрессию специфичных генов {Dolmetsch et ah, 1998). В нейронных сетях различных отделов мозга наблюдается спонтанная синхронная активность, которая также возникает в нейронах гиппокампа in vitro через несколько дней культивирования и обусловлена установлением синаптических контактов между нейронами.
Эта активность сопровождается кальциевыми осцилляциями и отражает функционирование целой сети, что позволяет исследовать механизмы передачи сигнала между нейронами и механизмы переключения информационных потоков в нейрональной сети. Физиологическое значение спонтанных синхронных кальциевых осцилляции (ССКО) состоит в синхронной секреции нейротрансмиттеров и гормонов для повышения их концентраций в обширных областях мозга, модуляции нейрональной пластичности в развивающихся нейронах {Spitzer et ah, 1995) и для синхронизации экспрессии генов в больших популяциях нейронов. Выявление механизмов контроля частоты и амплитуды колебаний Са в нейронах гиппокампа со стороны различных рецепторов открывает возможности управления отдельными популяциями клеток мозга с использованием лигандов этих рецепторов.
Основу синхронной спонтанной активности, наблюдаемой в культуре нейронов гиппокампа, составляет синаптическая передача возбуждения с участием глутамата, который действует на ионотропные и метаботропные глутаматные рецепторы. В настоящее время установлены механизмы участия NMDA-, AMP А- и ГАМК(А) рецепторов, а также потенциал-чувствительных кальциевых каналов в модуляции ССКО. Лиганды каинатных рецепторов также являются претендентами на роль регуляторов ССКО, однако об участии этих рецепторов в колебаниях в литературе существуют противоречивые данные.
В предварительных экспериментах нами было показано, что агонисты КА рецепторов подавляют ССКО. Также была обнаружена большая вариабельность ответов (по форме и амплитуде) индивидуальных нейронов на агонисты КА рецепторов.
Цель исследования. Исходя из этого, целью данной работы стало выявление и характеристика каинатных рецепторов нейронов гиппокампа, управляющих синхронной активностью популяции нейронов в культуре.
Основные задачи исследования.
Для выявления и характеристики каинатных рецепторов на основе систем анализа изображения и конфокальной микроскопии разработать методику количественного анализа взаимодействия агонистов/антагонистов с каинатными рецепторами.
Исследовать причины вариабельности ответов индивидуальных нейронов на агонисты КА рецепторов.
Изучить влияние каинатных рецепторов на синхронные спонтанные кальциевые осцилляции в популяции нейронов в культуре клеток гиппокампа.
По степени десенситизации и амплитуде Са ответа на агонисты КА рецептора выявить нейроны, управляющие синхронной активностью нейрональной сети.
Охарактеризовать по субъединичному составу КА рецепторы нейронов, управляющих синхронной активностью нейрональной сети.
Идентифицировать тип нейронов, управляющих синхронной активностью нейрональной сети.
Научная новизна работы. В работе разработаны новые методики выявления лигандов каинатных рецепторов и количественного анализа их активности.
Показано, что все нейроны отличаются по форме и АКО на агонисты КА глутаматных рецептов. Амплитуда и форма кальциевого ответа являются характерными параметрами индивидуальной клетки. Нейроны в основном равномерно распределены по амплитуде кальциевого ответа, однако небольшой процент клеток генерирует ступенчатый ответ большой амплитуды без десенситизации. Показано, что нейроны различаются по степени десенситизации КА рецепторов. Ингибитор десенситизации убирает эти различия и не действует на нейроны, генерирующие ступенчатый ответ большой амплитуды.
Выявлены новые механизмы регуляции каинатными рецепторами синхронных спонтанных кальциевых колебаний в нейронах гиппокампа крыс. Показано, что агонисты каинатных рецепторов ингибируют спонтанные синхронные кальциевые осцилляции в популяции нейронов, понижая базальный уровень концентрации ионов кальция в цитоплазме большинства клеток и сильно повышая его в единичных нейронах.
Обнаружены нейроны, управляющие через каинатные рецепторы без десенситизации синхронной активностью всей популяции. Эти нейроны подавляют колебания кальция в других нейронах, генерируя в ответ на агонисты КА-рецепторов кальциевый сигнал большой амплитуды без
десенситизации. Показано, что КА-рецепторы этих нейронов содержат субъединицу GluR5.
Методом иммуноцитохимии показано, что управляющие нейроны, отличающиеся большей амплитудой кальциевого ответа на агонисты КА-рецепторов без десенситизации и имеющие КА-рецепторы, содержащие субъединицу GluR5, являются ГАМКергическими интернейронами.
Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволят глубже понять процессы, связанные с регуляцией каинатными рецепторами синхронной активности целых популяций нейронов, а также предположить механизм избирательной гибели ГАМКергических нейронов при таких нейродегенеративных заболеваниях, как эпилепсия, болезнь Хантингтона и другие. Результаты данной работы могут расширить круг мишеней действия фармакологических препаратов при указанных расстройствах.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011), «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Клязьма, 2010 год), на международных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, г. Судак, 2010г., 2011г.), на всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010г.), на международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 16 печатных работах, из них 4 статьи в реферируемых журналах, 5 статей в сборниках и 7 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 99 страницах с использованием 39 рисунков и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 196 ссылок.
