Введение к работе
Актуальность исследований
Исследование проблемы агрегации белков представляет собой одно из актуальных направлений современной биологии. Агрегация белков - процесс, постоянно происходящий в клетке. Каждый белок отличает только ему присущая трехмерная структура. И будучи в этой, называемой нативнои, конформации белок может правильно функционировать. Однако генетические мутации и ошибки при синтезе белков на рибосоме могут приводить к образованию неправильно свернутых белковых структур. Даже для нативных белков всегда существует вероятность частичного разворачивания, особенно в условиях стресса (например, теплового, окислительного или осмотического). При нарушении нативнои структуры белки становятся функционально неактивными, менее стабильными и склонны агрегировать, что может приводить к широкому спектру патологических состояний клетки и целого организма. Агрегации ненативных белков способствует содержание большого количества внутриклеточных макромолекул (белки, липиды, полисахариды), так называемые условия молекулярного краудинга (crowding). В совокупности макромолекулы, присутствующие в клетке, занимают значительную часть ее объема (до 40%), вследствие чего доступный объем в клетке (жидкая среда) сокращается. Показано, что условия молекулярного краудинга влияют на кинетику клеточных процессов, стимулируя реакции, приводящие к увеличению доступного объема, в том числе, процессы агрегации белков.
Согласно современным представлениям процесс агрегации белков в клетке не является неконтролируемым и потому не приводит к катастрофическим последствиям. Предотвращение агрегации или направление процесса агрегации белков по пути образования нетоксичных агрегатов осуществляет система белков шаперонов (chaperones), включающих малые белки теплового шока. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе антиагрегационнои активности шаперонов и малых белков теплового шока, чрезвычайно актуально, так как позволит объяснить патологические аспекты так называемых «конформационных» заболеваний человека, связанных с агрегацией белков (катаракта, сахарный диабет второго типа, нейродегенеративные заболевания).
В настоящее время все предположения о механизме действия шаперонов и малых белков теплового шока основаны на результатах исследований in vitro, проведенных на модельных системах в условиях, сильно отличающихся от условий молекулярного краудинга. Ставится под сомнение, насколько верно эти предположения отражают
реальное функционирование этих белков in vivo. Поэтому очень важно в модельных экспериментах имитировать условия краудинга, добавляя высокие концентрации краудинг-агентов к изучаемой системе. При этом для понимания детального механизма антиагрегационного действия шаперонов и малых белков теплового шока важно разрабатывать такие тест-системы, которые позволяют прямое наблюдение их влияния на процесс агрегации ненативных белков.
Кроме того, актуально сопоставление механизмов действия белковых шаперонов и так называемых «химических шаперонов», например пролина. Пролин - это низкомолекулярное соединение, для которого показано его стимулирующее действие на ренатурацию различных белков. Однако какой вклад в повышение ренатурации белков под действием пролина составляет ингибирование процесса агрегации пролином, остается невыясненным.
Цель и задачи исследований
Целью настоящей работы было изучение механизма защитного действия шаперонов на тепловую агрегацию мышечной гликогенфосфорилазы Ь и изучение влияния краудинга на агрегацию белков и антиагрегационную активность малых белков теплового шока (на примере а-кристаллина). В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
изучить влияние GroEL и пролина на тепловую денатурацию и агрегацию гликогенфосфорилазы Ь,
разработать на основе УФ-облученной гликогенфосфорилазы Ь тест-систему, с использованием которой можно изучать влияние различных агентов непосредственно на стадию агрегации белковых молекул,
с использованием тест-системы, основанной на агрегации УФ-облученной гликогенфосфорилазы Ь, изучить влияние пролина, а-кристаллина и краудинга на процесс агрегации и влияние краудинга на антиагрегационную активность а-кристаллина.
Для выполнения поставленных задач были использованы следующие экспериментальные методы: динамическое светорассеяние, дифференциальная сканирующая калориметрия, скоростная седиментация, гель-фильтрация и электрофорез.
Научная новизна
Предложена новая тест-система для испытания агентов, оказывающих влияние на агрегацию белков. Система основана на агрегации гликогенфосфорилазы Ь, денатурированной УФ излучением. В отличие от тест-систем, предложенных ранее в
литературе (тепловая агрегация; агрегация, сопровождающая рефолдинг; агрегация, индуцируемая низкими концентрациями гуанидингидрохлорида и мочевины, и др.), новая тест-система позволяет исследовать влияние изучаемых агентов непосредственно на стадию агрегации белковых молекул. С использованием тест-системы, основанной на агрегации УФ-облученной гликогенфосфорилазы Ь, впервые экспериментально продемонстрированы стимулирующее действие краудинга на стадии агрегации белков и способность пролина подавлять агрегацию белков. Экспериментально доказано образование в условиях краудинга двух типов комплексов а-кристаллина с белковым субстратом: высокомолекулярных комплексов, агрегация которых усиливается в условиях краудинга, что приводит к уменьшению антиагрегационной активности а-кристаллина в присутствии краудинг-агентов, и комплексов, которые включают диссоциированные формы а-кристаллина и проявляют меньшую склонность к агрегации в условиях краудинга.
Практическая значимость работы
Выполненные исследования имеют фундаментальное значение, поскольку при изучении закономерностей функционирования живых систем необходимо учитывать то обстоятельство, что все процессы в клетке протекают в условиях краудинга. Согласно современным представлениям малые белки теплового шока играют важную роль в регуляции внутриклеточных процессов, и это позволяет рассматривать их в качестве перспективных терапевтических агентов при лечении заболеваний, развитие которых сопровождается образованием белковых агрегатов (катаракта, нейродегенеративные и другие заболевания). Проведенные исследования особенностей функционирования малых белков теплового шока в условиях, приближенных к физиологическим, позволяют более детально охарактеризовать клеточные регуляторные механизмы, реализующиеся с участием малых белков теплового шока.
Разработанная на основе агрегации УФ-облученного белка тест-система представляет практическую ценность для поиска агентов, способных эффективно подавлять агрегацию белков. Агенты с подобными свойствами находят применение при решении биотехнологических задач, в частности, при разработке методов стабилизации белковых препаратов медицинского назначения.
Апробация результатов работы
Результаты работы были представлены на XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008», (Москва, 2008), 19-ом Международном симпозиуме по аналитическому ультрацентрифугированию
(Уппсала, 2009), VIII Международной конференции «Проблемы биологической физики» (Москва, 2009), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011) и Ежегодной научной конференции ИНБИ РАН (Москва, 2011).
По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 публикации в рецензируемых журналах из Перечня ВАК и 4 - тезисы в трудах российских и международных конференций.
Структура и объем диссертации
