Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 10
1.1 Влияние ионизирующего излучения на мужские половые клетки 10
1.2 Радиационно-индуцированная нестабильность генома 18
1.2.1 Механизмы формирования радиационно-индуцированной нестабильности генома 20
1.2.2 Выявление радиационно-индуцированной нестабильности генома 25
1.2.3 Дозовые характеристики индукции РИНГ 32
1.2.4 Трансгенерационный феномен радиационно-индуцированной нестабильности генома 34
1.3 Здоровье потомков облученных людей 43
ГЛАВА 2 Материалы и методы 50
2.1. Характеристика обследованных групп 50
2.2 Методы исследования 62
2.2.1 Описание микроядерного анализа 62
2.2.2 Схема метода 65
2.2.3 Методы статистической обработки 67
ГЛАВА III Результаты исследования 69
3.1 Частота лимфоцитов периферической крови с микроядрами в обследованных группах отцов и их потомков первого поколения 69
3.2 Реакция лимфоцитов на адаптирующее воздействие в дозе 0,05 Гр 74
3.3 Анализ влияния радиационных и нерадиационных факторов на частоту лимфоцитов периферической крови с микроядрами 77
3.3.1 Анализ влияния радиационных факторов на частоту лимфоцитов с микроядрами 77
3.3.2 Анализ влияния нерадиационных факторов на частоту лимфоцитов с микроядрами 84
3.3.3 Анализ сочетанного влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на частоту лимфоцитов с микроядрами 97
Обсуждение результатов 100
Выводы 111
Список использованной литературы: 113
- Радиационно-индуцированная нестабильность генома
- Выявление радиационно-индуцированной нестабильности генома
- Описание микроядерного анализа
- Анализ влияния радиационных и нерадиационных факторов на частоту лимфоцитов периферической крови с микроядрами
Введение к работе
Актуальность исследования. Клеточная мембрана является одним из основных компонентов живой клетки. Мембраны, отделяя внутреннее содержимое от внешней среды, обеспечивают целостность клетки и ее органелл, а также участвуют во множестве жизненно важных процессов, включая фотосинтез, дыхание, транспорт питательных веществ, передачу сигналов, проведение ферментативных реакций, генерацию и поддержание трансмембранного (ТМ1) электрического потенциала и т.д. За большинство из этих функций ответственны специальные молекулы – интегральные и периферические мембранные белки (МБ) и мембраноактивные пептиды (МП). Гены интегральных МБ составляют до трети всех белковых последовательностей, закодированных в геномах прокариот и эукариот, и именно МБ (такие как рецепторы, транспортеры, ионные каналы и т.д.) являются мишенями для действия свыше половины известных в настоящее время лекарственных препаратов. Несмотря на высокую научную и практическую значимость, структура и механизмы функционирования МБ и МП в настоящее время остаются малоизученными. Так, например, из более чем 90,000 известных к 2014 году белковых структур менее 2% относятся к интегральным МБ.
Как и в случае водорастворимых глобулярных белков основную роль в стабилизации пространственной структуры и функционировании мембранных биомолекул играют нековалентные взаимодействия: электростатические, ван-дер-ваальсовые и имеющие энтропийную природу гидрофобные взаимодействия. Однако, для стабилизации «нативной/активной» структуры МБ и МП требуется присутствие биологической мембраны или подходящей мембраномоделирующей среды (миметика мембраны). В мембранах пространственная структура и функция МБ и МП во многом определяются межмолекулярными взаимодействиями с компонентами липидного бислоя (фосфолипидами, стеринами и т.д.). Для описания механизмов работы МБ и МП на молекулярном уровне необходимо также учитывать внутримолекулярную динамику (конформационную подвижность), которая может играть большую роль во взаимодействии лигандов с рецепторными МБ, в работе ионных каналов и в антибиотическом действии МП. При этом динамика и конформация молекул МБ и МП могут значительно зависеть от свойств мембранного окружения.
Исследование структуры и динамики МБ и МП, а также установление связи между структурой, динамикой и функцией этих молекул является актуальной задачей современной биофизики. Структурные исследования МБ и МП важны для решения ряда прикладных задач биотехнологии, фармакологии и медицины, в том числе для разработки новых лекарственных препаратов. Одним из наиболее мощных методов структурного анализа является ЯМР-спектроскопия высокого разрешения, которая позволяет изучать пространственную структуру и внутримолекулярную динамику МБ в мембраноподобном окружении. В настоящее время ЯМР-спектроскопия является практически единственным методом, который позволяет определять пространственную структуру небольших гидрофобных или амфифильных пептидных молекул, неподдающихся кристаллизации.
Основные трудности в изучении МБ и МП методами ЯМР-спектроскопии связаны с подбором оптимальной мембраномоделирующей среды, способной сохранять «нативную» пространственную структуру и агрегационное состояние мембранной
Полный список использованных сокращений и обозначений приведен в конце автореферата.
биомолекулы, а также обеспечивать достаточное качество ЯМР-спектров, необходимое для структурных исследований. Существующие среды, основанные на органических растворителях или мицеллах детергентов, во многих случаях не отвечают этим требованиям. Среды, содержащие бислойные мембраны, например, липидные везикулы, обладают слишком большими размерами и не могут напрямую использоваться в ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Расширение арсенала мембраномоделирующих сред, а также решение проблемы рационального выбора оптимального миметика мембраны необходимо для проведения корректных структурно-функциональных исследований МБ и МП методами ЯМР-спектроскопии.
Целью работы являлось изучение принципов структурной организации и механизмов функционирования мембраноактивных пептидов и интегральных спиральных мембранных белков. В работе были поставлены следующие задачи:
-
Разработать подходы применения для ЯМР-исследований МБ и МП липид-белковых нанодисков (ЛБН), – новой мембраномоделирующей среды, содержащей стабилизированные в растворе фрагменты бислойной мембраны.
-
Исследовать структуру и динамику ряда модельных МБ и МП в различных мембраномоделирующих средах. Изучить роль ковалентных взаимодействий (внутримолекулярная циклизация) и различных нековалентных взаимодействий (электростатические, гидрофобные), включая взаимодействия с липидной мембраной, в формировании «нативной/активной» пространственной структуры МБ и МП.
-
Изучить механизмы формирования пространственной структуры интегральных МБ в мембраномоделирующем окружении (процессы фолдинга in vitro).
-
Установить молекулярные механизмы мембранной активности ряда МП и роль динамики и специфических межмолекулярных взаимодействий (взаимодействий с участием конкретных функциональных групп) в их функционировании.
-
Изучить роль внутримолекулярной динамики в функционировании мембранных рецепторов. Изучить механизмы регуляции их работы мембраноактивными пептидными лигандами.
В качестве модельных объектов использовали МП трех групп: мембраноактивные гидрофобные антибиотики, водорастворимые мембраноактивные антимикробные пептиды и мембраноактивные нейротоксины.2 Исследованные молекулы отличались по основным структурно-функциональным параметрам: типу пространственной структуры (спиральные, -структурные и т.д.), содержанию дисульфидных связей или других внутримолекулярных циклов, заряду (от нейтрального до +6), а также степенью
2 Двухкомпонентный лантибиотик лихеницидин (Lch/Lch) из грамположительной бактерии Bacillus licheniformis; (поро)каналообразующие антибиотики пептаиболы антиамебин I (Aam-I) и зервамицин IIB (Zrv-IIB), продуцируемые грибами рода Emericellopsis; циклотиды Kalata B1 и B7 (KB1 и KB7) из растения Oldenlandia affinis; антимикробные пептиды аурелин из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita и ареницин-2 (Ar2) из целомоцитов морского многощетинкового червя Arenicola marina; токсин VSTx1 из яда паука Grammostola spatulata; нейротоксин II (NTII) из яда кобры Naja oxiana; бактериальный K+-канал KcsA (Streptomyces lividans); бактериородопсин грамположительной психрофильной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR); потенциалочувствительный домен К+-канала KvAP (ПЧД-KvAP, архея Aeropyrum pernix); ТМ домен тирозинкиназы ErbB3 человека (TM-ErbB3). Образцы МП любезно предоставлены сотрудниками учебно-научного центра ИБХ РАН, руководитель д.х.н. Овчинникова Т.В., кроме KB1 и KB7 (предоставлены проф. Л. Скжелдалом, Норвежский институт наук о живом, г. Аас). Образцы токсинов NTII и VSTx1, а также все образцы интегральных МБ получены в отделе биоинженерии ИБХ РАН, руководитель академик Кирпичников М.П.
гидрофобности (от практически нерастворимых гидрофобных антибиотиков до хорошо растворимых нейротоксинов). В качестве модельных интегральных мембранных белков использовали потенциалочувствительный домен K+-канала KvAP (ПЧД, архея Aeropyrum pernix), а также ряд спиральных МБ, имеющих различную топологию и олигомеризационное состояние в мембране и содержащих от 2-х до 8-и ТМ спиралей.2
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Для структурно-динамических ЯМР-исследований МБ и МП предложена новая мембраномоделирующая среда, – липид-белковые нанодиски. Разработан новый метод ренатурации (фолдинга) рекомбинантных интегральных МБ, основанный на инкапсуляции денатурированных мембранных белков в нанодиски.
-
Определен относительный вклад гидрофобных и электростатических взаимодействий с липидным бислоем, а также конформационной подвижности молекул МП в образование комплексов пептид-мембрана, и установлена их роль в молекулярных механизмах действия МП.
-
Предложены механизмы образования пептид-пептидных и пептид-липидных пор в мембране антибиотическими мембраноактивными пептидами с разным типом пространственной укладки (спиральные Aam-I/Zrv-IIB и -структурный ареницин-2).
-
В молекуле потенциалочувствительного домена К+-канала KvAP (ПЧД-KvAP) обнаружены «медленные» (мкс-мс) межспиральные движения, – предшественники конформационных перестроек, происходящих при потенциалозависимой активации. Показано, что стабильность «нативной» конформации ПЧД зависит от внутримолекулярных электростатических взаимодействий и двумерной упаковки липидного бислоя, окружающего домен.
-
Обнаружено состояние МБ, сходное с состоянием «расплавленной глобулы» водорастворимых белков и являющееся одним из возможных интермедиатов процесса фолдинга МБ in vitro. Показано, что в отличие от водорастворимых белков фолдинг МБ может сопровождаться одновременным увеличением энтальпии и энтропии системы.
-
Предложен молекулярный механизм действия нейротоксина VSTx1, согласно которому токсин связывается с интерфейсным регионом липидного бислоя и образует комплекс с участками ПЧД, погруженными в мембрану. Молекула токсина блокирует движения ПЧД, необходимые для потенциалозависимой активации K+-канала.
Научная новизна:
Показано, что в отличие от сред на основе детергентов ЛБН хорошо моделируют гидрофобную и электростатическую компоненту взаимодействия МБ(МП)/мембрана. Предложен оригинальный метод «скрининга» мембраномоделирующих сред для ЯМР-исследований, основанный на использовании ЛБН в качестве среды сравнения. Разработан новый метод фолдинга политопных (состоящих из нескольких ТМ спиралей) и субъединичных интегральных МБ в средах на основе ЛБН, и выявлена зависимость эффективности процесса фолдинга от липидного состава нанодисков.
В работе впервые описано влияние конформационной подвижности на активность порообразующих пептидов различных структурных семейств и показано, что повышенная подвижность может ослаблять как начальное присоединение пептидов к мембране, так и последующие процессы порообразования. Установлено, что конформация и динамика -структурных МП, стабилизированных дисульфидными связями, может значительно
меняться при взаимодействии с липидной мембраной.
Результаты исследования антибиотических МП, принадлежащих различным семействам, выявили структурные детерминанты, ответственные за биологическую активность пептидов, что позволило предложить новые молекулярные модели их действия на мембраны.
Исследование ПЧД-KvAP и его взаимодействия с токсином VSTx1 позволило впервые наблюдать функционально важные мкс-мс межспиральные движения в рецепторном МБ, а также предложить новую модель действия «вольт-сенсорных» токсинов, которая меняет существующую концепцию, предполагающую прямое взаимодействие токсина с «датчиком потенциала» спиралью S4 ПЧД.
Исследование ПЧД в различных средах позволило обнаружить новое «расплавленное» состояние МБ, которое характеризуется компактной упаковкой, небольшими изменениями вторичной структуры, частичным разрушением третичной структуры и увеличением подвижности основной цепи МБ в пс-нс временном диапазоне.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные дают новую информацию о принципах структурной организации молекул МБ и МП и о структурных аспектах их взаимодействия с мембраной. Раскрыта роль внутримолекулярной циклизации, гидрофобных и электростатических взаимодействий с липидами, конформационной подвижности, специфических взаимодействий с липидными мишенями и двухвалентными катионами в следующих процессах: формирование комплекса пептид-мембрана, олигомеризация МП и образование пор в мембране. Показано, что для описания конформации МП в липидном бислое и механизмов их действия требуется учитывать совокупность структурно-динамических факторов. Показано, что в стабилизации молекул МБ в отличие от водорастворимых глобулярных белков большую роль играют внутримолекулярные электростатические взаимодействия, а также упаковка окружающего липидного бислоя. В отличие от водорастворимых белков процессы фолдинга МБ in vitro могут быть эндотермическим и сопровождаться увеличением энтальпии и энтропии системы.
Результаты структурно-динамических исследований антибиотических МП могут использоваться при разработке новых антибиотиков, – задаче, которая приобрела особую важность в последнее время в связи с распространением патогенных микроорганизмов, резистентных к “классическим” антибактериальным препаратам. Данные о механизмах функционирования потенциалозависимых ионных каналов и их регуляции природными лигандами, а также данные о механизмах процесса фолдинга интегральных МБ in vitro, полученные в работе, будут полезны при рациональном дизайне новых лекарственных препаратов, действующих на мембранные рецепторы и ионные каналы. Разработанные в рамках диссертации новые подходы применения мембраномоделирующих сред на основе ЛБН открывают перспективы получения стабильных препаратов МБ для биотехнологии и биомедицины, а также для структурно-функциональных исследований мембранных биомолекул в нативном окружении.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы представлены на 43 конференциях и симпозиумах, основными из которых являются: 33-й, 36-й и 38-й Конгрессы FEBS (Афины, Греция, 2008, Турин, Италия, 2011 и Санкт-Петербург, 2013); Международные конференции по магнитному резонансу “EUROMAR-2009”, “EUROMAR-2010” и
“EUROMAR-2014” (Гётеборг, Швеция, 2009, Флоренция, Италия, 2010, Цюрих, Швейцария, 2014); 4-ая конференции Европейского нейрохимического общества (ESN, Лейпциг, Германия, 2009); 23-й Конгресс Международного нейрохимического общества (Афины, Греция, 2011); 2-й и 3-й Российско-греческий симпозиум «Biomaterials and nanobiomaterials: recent problems and safety issues» (Ираклион, Греция, 2011, 2012); 2-й и 4-й Международные симпозиумы «Nuclear magnetic resonance in condensed matter. NMR in life sciences» (Санкт-Петербург, 2005, 2007); VIII международный семинар по магнитному резонансу «спектроскопия, томография, и экология». (Ростов-на-Дону, 2006); II международная конференция «Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, Беларусь, 2006); Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); IV, V и VI Российские Симпозиумы «Белки и пептиды». (Казань, 2009, Петрозаводск, 2011, Уфа, 2013); 42, 48, 50, 53, 54, 55 Научные конференции МФТИ (Долгопрудный, 1999, 2005, 2007, 2010, 2011, 2012); VIII и X чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006, 2011); XVI, XIX-XXVI зимние молодежные научные школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004, 2007-2014 годы).
Публикации и патенты
По теме диссертации опубликовано 64 работы, в том числе 23 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах и 1 глава в книге. По результатам работы получено 3 патента на изобретение РФ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 351 странице, и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), обсуждения результатов (главы 2-5), заключения (глава 6), экспериментальной части (глава 7) и выводов. Работа иллюстрирована 108 рисунками и включает 17 таблиц. Библиографический указатель содержит 540 источников литературы.
