Введение к работе
Актуальность темы. Задачей системы гемостаза является предотвращение потери крови при нарушении целостности кровеносной системы. Плазменное звено свертывания – одна из важных составляющих этой системы, задачей которого является формирование геля в месте повреждения сосуда для предотвращения просачивания жидкости. В свертывании плазмы крови участвует более 30 белков, которые взаимодействуют друг с другом, образуя огромную сеть биохимических реакций. Такая сложная система требует соответствующей регуляции. Это приводит к тому, что даже небольшие нарушения в деликатном балансе про- и антикоагулянтных реакций могут приводить к тяжелым последствиям для организма: тромбозам и кровотечениям.
Одним из важных регуляторных белков в системе свертывания является ингибитор пути тканевого фактора (TFPI). Он функционирует на стадии активации свертывания крови. На данный момент не известны случаи дефицита TFPI у людей. Кроме того, известно, что гомозиготные по отношению к дефициту TFPI мыши погибают внутриутробно, а люди со сниженным уровнем TFPI имеют повышенную склонность к тромбозам. Это говорит о критически важной роли TFPI в организме.
Относительно недавно была высказана новая идея, как улучшить свертывание в гемофилии: инактивировать ингибитор, регулирующий запуск реакций свертывания крови (TFPI). В последнее время появились работы, посвященные разработке ингибиторов к TFPI и их тестированию. В общем, данные подтверждают их положительный эффект на гемостаз в случаях гипокоагуляции. Однако эксперименты in vivo описывают слишком общие эффекты TFPI на свертывание и не способны четко выделить закономерности процессов в связи со многими неопределенностями экспериментальных условий. Все исследования in vitro проводились в гомогенных экспериментах, которые принимают во внимание активности белков свертывания, но не учитывают процессы диффузии. Однако in vivo свертывание активируется на поверхности с тканевым фактором (ТФ), а пространственный рост сгустка происходит во многом за счет диффузии активных факторов. Как было ранее показано, в таких условиях роль некоторых белков в гемостазе может поменяться. Таким образом, пока нет данных о роли TFPI в пространственной
динамике свертывания. Не ясно подавляет ли TFPI пространственный рост сгустка и способно ли ингибирование TFPI его улучшить. В свете активного развития идеи ингибирования TFPI у больных гемофилиями полезно было бы знать последствия такой терапии. Для этого требуется понимать механизм, степень влияния TFPI и условия, при которых ингибиторы TFPI будут оказывать положительное действие на пространственный рост сгустка. На сегодняшний день этот аспект остается не изученным. Кроме того, не известно, как будут взаимодействовать лекарственные препараты ингибиторов TFPI и концентрата фактора VIII при одновременном назначении больному гемофилией А.
Для того чтобы разобраться в этих вопросах в данной работе использовали пространственно-неоднородную экспериментальную модель свертывания (тест Тромбодинамики). Ее ключевая особенность состоит в том, что свертывание плазмы крови запускается поверхностью с иммобилизованным тканевым фактором (ТФ) и затем распространяется в объем плазмы. Наблюдение за ростом фибринового сгустка производили оптически по светорассеянию методом темного поля. Эта экспериментальная модель имитирует условия протекания процесса свертывания in vivo, так как отражает как биохимические реакции каскада свертывания, так и процессы диффузии. Для выбора условий эксперимента, предсказания поведения системы гемостаза и выяснения механизмов влияния TFPI на пространственный рост сгустка в данной работе было проведено математическое моделирование.
Цель работы: Исследовать роль TFPI в пространственном формировании фибринового сгустка в норме и при гемофилии А.
Задачи исследования:
-
Определить диапазон плотностей ТФ на поверхности активатора, при которых пространственное свертывание в свободной от тромбоцитов плазме оказывается чувствительным к изменениям концентраций TFPI.
-
В плазме здоровых доноров и больных гемофилией А определить параметры пространственного роста сгустка, на которые оказывает влияние TFPI. Сравнить эффективность усиления внешнего пути свертывания при ингибировании TFPI в плазме нормальных доноров и больных гемофилией А.
-
Сравнить действие ингибитора TFPI и рекомбинантного фактора VIIa (rVIIa) на пространственное формирование сгустка в плазме больных гемофилией А.
-
В математической модели и экспериментах ex vivo исследовать лекарственное взаимодействие концентратов фактора VIII и ингибитора TFPI на пространственное свертывание.
Научная новизна. Впервые влияние TFPI исследовалось в пространственно-неоднородной системе in vitro. Определен диапазон плотностей ТФ на поверхности активатора, при котором влияние TFPI на пространственное свертывание оказывается существенным. Определены ключевые параметры пространственного роста, на которые оказывает действие TFPI. Впервые показано, что инактивация TFPI способна улучшить пространственный рост сгустка, сокращая время задержки свертывания и увеличивая скорость его пространственного роста. Показано, что влияние TFPI ограничено тонким приактиваторным слоем в 100-200 мкм, или 10 минутами после начала роста сгустка. Влияние TFPI на пространственную скорость роста вдали от активатора незначительно. Показано, что усиление внешнего пути свертывания через ингибирование TFPI и добавление rVIIa оказывают качественно и количественно разные эффекты на пространственный рост фибринового сгустка. Стимуляция гемостаза фактором rVIIa приводит к дозозависимому ускорению пространственного роста сгустка на всех расстояниях от активатора, а при концентрациях выше 10 нМ к свертыванию во всем объеме экспериментальной кюветы, в то время как инактивация TFPI ускоряет начальную фазу роста сгустка только вблизи активатора, и это действие обладает эффектом насыщения. Впервые дано предсказание взаимодействия лекарственных препаратов, ингибирующих действие TFPI, и концентратов фактора VIII: увеличение концентрации фактора VIII в крови снижает относительный эффект антагониста TFPI на размер сгустка.
Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о роли и вкладе TFPI в пространственное свертывание плазмы крови могут впоследствии быть применены в области лечения и создания новых лекарственных препаратов для пациентов больных гемофилией А или другими коагулопатиями. Предсказания относительно взаимодействий препаратов, ингибирующих TFPI, и концентратов фактора VIII могут быть полезными при планировании терапии у больных гемофилией А.
Положения, выносимые на защиту:
1. Установлено, что пространственное свертывание плазмы крови
чувствительно к изменениям концентрации TFPI в условиях активации
системы гемостаза ТФ с низкой плотностью распределения (1-4 пмоль/м2).
-
Показано, что при активации свертывания ТФ с низкой плотностью TFPI влияет на пространственный рост сгустка, главным образом, сокращая время задержки свертывания и увеличивая начальную скорость роста сгустка. Область ускорения формирования сгустка ограничивается тонким слоем вблизи активатора.
-
Показано, что ингибирование TFPI способно улучшить пространственное свертывание в плазме больных гемофилией А.
-
Показано, что rVII и антагонисты TFPI оказывают качественно разные эффекты на свертывание плазмы крови
Апробация работы состоялась 14 мая 2013г. на заседании семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.
Материалы диссертации докладывались на конференции "Математика, компьютер, образование" (Пущино, февраль 2011), 36th Federation of European Biochemical Societies Congress (Турин, Италия, июнь 2011), XXIIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Киото, Япония, июль 2011), Тромбоз, гемостаз и реология (Москва, Россия, 2011), 58th Аnnual meeting of the Scientific and Standartization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Ливерпуль, Великобритания, июнь 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья в рецензируемом журнале и 6 тезисов в сборниках трудов 5 конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания экспериментальных и теоретических результатов, и главы 4 — обсуждения результатов), выводов, приложения и библиографического указателя, включающего 264 источника. Текст диссертации иллюстрирован 11 таблицами и 36 рисунками. Работа выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории Молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией д.ф.-м.н. М.А. Пантелеев).
