Введение к работе
Актуальность исследования.
Синаптическая модуляторная функция макроэргической молекулы аденозин-5'- трифосфата (АТФ) была открыта лишь в конце прошлого века, причем первоначально ей предпосылалось значение только как предшественника синаптически активного аденозина [Redman, Silinsky, 1996]. В последующем, работами других исследователей было доказано собственное модуляционное действие АТФ по принципу отрицательной обратной связи в синапсах фазных мышц амфибий [Гиниатуллин, Соколова, 1998]. Выделяясь из синаптических везикул нервного окончания мотонейрона совместно с основным медиатором ацетилхолином (АХ), АТФ угнетает секрецию АХ [Ziganshin et al., 2005].
АТФ угнетает квантовую [Giniatullin & Sokolova, 1998] и неквантовую [Galkin et al., 2001; Маломуж, Никольский, 2010] секрецию медиатора из пресинаптических окончаний мотонейронов, действуя на Р2-рецепторы, в то время как конечный продукт ее распада - аденозин реализует свое действие через аденозиновые рецепторы. Аденозиновые рецепторы являются по структуре метаботропными. Различают А1, А2А, A2b и А3 подтипы аденозиновых рецепторов. Р2-рецепторы, агонистом которых является АТФ, делятся на ионотропные - Р2Х(1-7) и метаботропные - P2Y(1,2,4,6,11-14) подтипы [Зиганшин, Зиганшина, 2009]. Выявление конкретных подтипов задействованных аденозиновых и Р2-рецепторов, их фармакологическая характеристика являются начальными этапами изучения эффекторных механизмов синаптической регуляции пуринами функции различных типов скелетных мышц.
Пресинаптическое ингибиторное действие АТФ и аденозина в нервно-мышечном синапсе было описано, в основном, на препаратах холоднокровных животных, при этом исследования были проведены лишь на быстрых фазных скелетных мышцах [Ribeiro & Sebastio, 1987; Fu, 1995; Sokolova et al., 2003]. В тех немногих работах [Salgado et al., 2000], где опыты ставились на теплокровных животных, эксперименты проводились, руководствуясь удобством препарирования, на синапсах диафрагмы, что не может быть экстраполировано как типичное воздействие пуринов на все фазные скелетные мышцы теплокровных. Кроме того, в упомянутых исследованиях синаптические эффекты пуринов не сопоставлялись с изменениями параметров сократительной активности самой мышцы. Также нет данных о роли АТФ и ее производных в аккумуляции мышечных усилий позвоночных, скрадывающей до двух третьих от абсолютных силовых возможностей [Hettinger, 1961]. Остается обойденной вниманием такая важная, пусть и не столь распространенная, тоническая мускулатура теплокровных, например, мышцы внутреннего уха и мышцы, приводящие глазное яблоко. Не изучена пуринергическая синаптическая регуляция тонических мышц холоднокровных животных, представленных в большем количестве в их организме.
Решению этих проблем и посвящено наше исследование. В нем мы представили результаты изучения механизмов пуринергической регуляции синапсов разных мышечных систем, имеющих разные условия функционирования. При этом мы исследовали и медленные фазные мышцы позвоночных в сравнении с быстрыми мышцами, чтобы выявить особенности их пуринергической регуляции и оценить задействованные рецепторные и метаболические системы.
Цель и основные задачи исследования.
Целью работы является исследование механизмов действия АТФ и аденозина на синаптическую передачу и параметры мышечного сокращения быстрых и медленных фазных, а также тонических мышц теплокровных и холоднокровных животных.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
-
Сравнить эффекты АТФ и аденозина на параметры сокращения скелетных мышц различных типов.
-
Выявить подтип Р2-рецептора, опосредующего ингибиторный эффект АТФ на амплитуду токов концевой пластинки фазной мышцы озерной лягушки.
-
Определить подтипы аденозиновых рецепторов, участвующих в угнетающем действии аденозина на амплитуду токов концевой пластинки фазной мышцы озерной лягушки.
-
Выявить механизмы внутриклеточного опосредования эффектов АТФ и аденозина на амплитуду токов концевой пластинки фазной мышцы озерной лягушки.
-
Исследовать влияние агонистов пуриновых рецепторов на амплитуду токов концевой пластинки и параметры пресинаптических токов нервного окончания мотонейронов, иннервирующих фазные мышечные волокна озерной лягушки.
-
Сравнить действие АТФ на силу сокращения медленных и быстрых фазных и тонических мышц холоднокровных и теплокровных.
-
Оценить действие аденозина на параметры сокращения медленных и быстрых фазных мышц, а также тонических мышц холоднокровных и теплокровных.
-
Исследовать действие АТФ и аденозина на уровень неквантовой секреции в синапсах медленных и быстрых фазных мышц, а также тонических мышц крысы.
Научная новизна.
В результате проведенных исследований впервые были выявлены различия в синаптическом механизме, ответственные за специфику функционирования фазных и тонических скелетных мышц, а также отличие в степени угнетающего действия АТФ на силу сокращения быстрой и медленной фазных мышц теплокровных.
Были определены подтипы аденозиновых и Р2-рецепторов, вовлеченных в модуляцию мионевральной передачи синапсов фазных мышц позвоночных. Изучена задействованная в ингибиторном эффекте АТФ цепь внутриклеточных вторичных посредников. Выявлены ее последовательные и параллельные звенья. Обнаружено, что конечным последовательным метаболическим звеном является протеинкиназа С, после которой эффекторная линия внутриклеточных вторичных посредников раздваивается. При этом за ингибиторный эффект активаторов этого фермента (АТФ и РМА) на кальциевый ток ответственна циклооксигеназная ветвь метаболизма арахидоновой кислоты. Кальцийнезависимое снижение квантового состава связано с синтезом перекиси водорода.
Впервые показано, что аденозин активирует сразу два подтипа аденозиновых рецепторов: Аі и А2А. Обнаружено, что второй подтип рецепторов чувствителен к селективному агонисту А2А рецепторов CGS21680 и ионам бария. Найдено, что селективный агонист А1 аденозиновых рецепторов ССРА обладает более выраженным угнетающим действием на амплитуду ТКП, чем аденозин, при этом его эффект устранялся блокадой калиевых каналов А типа. Установлено отсутствие участия в эффектах аденозина каких-либо известных внутриклеточных посредников и ионных каналов, кроме А типа калиевых каналов.
Впервые выявлена синаптическая пуринергическая регуляция тонических мышц теплокровных и холоднокровных. АТФ не снижала, а увеличивала силу сокращения тонических мышц. Получены данные о том, что только в синапсе тонических мышц АТФ, в отличие от аденозина, устраняет неквантовую секрецию ацетилхолина.
Положения, выносимые на защиту:
-
-
АТФ и аденозин участвуют в пресинаптической модуляции сократительной активности различных типов скелетной мускулатуры. АТФ и аденозин имеют сходное по эффекту пресинаптическое ингибиторное действие на функциональное состояние фазных скелетных мышц холоднокровных и теплокровных животных, при этом каждый из изученных пуринов имеет свои особенности в механизме реализации этого действия. Аденозин оказывает угнетающее действие и на двигательную единицу тонических мышц, а АТФ, напротив, обладает облегчающим эффектом для этой ткани.
-
В механизм реализации пресинаптического действия АТФ в фазных мышцах вовлекаются Р2Y рецепторы, PC-фосфолипаза C, протеинкиназа С, синтез перекиси водорода и простагландина E2. В тонических мышцах приводящий к устранению неквантовой секреции медиатора эффект АТФ опосредуется также пресинаптическими Р2Y рецепторами и протеинкиназой С.
-
Пресинаптическое действие аденозина в фазных мышцах, складывающееся из активации A1 аденозиновых рецепторов, сопряженных с А-типом калиевых каналов, и A2A. рецепторов, приводит к результирующему ингибиторному эффекту на амплитуду токов концевой пластинки (ТКП) и силу сокращения.
Научно-практическая ценность.
До настоящего времени не проводилось работ, посвящённых раскрытию механизмов влияния эндогенных пуринов, в частности АТФ и аденозина, на процесс секреции медиатора из нервного окончания тонических и медленных фазных двигательных единиц.
Полученные данные вскрывают новые аспекты функционирования нервно- мышечного синапса, свидетельствуя о важной роли, наряду с уже известными звеньями, пуриновых механизмов. Эти данные могут служить основой для понимания возможных взаимодействий пуринергических агентов с системами других первичных посредников.
Определение подтипов аденозиновых и Р2-рецепторов, задействованных в пресинаптической пуринергической регуляции, позволит направить работу по синтезу новых эффективных фармакологических агентов, модулирующих мионевральную передачу.
Выявленные эффекты отмены тонического ингибиторного действия АТФ и аденозина могут позволить использовать вскрытые механизмы для обеспечения потенциации мышечных усилий.
Особо важной представляется обнаружение потенцирующего действия АТФ в синапсах тонических мышц позвоночных, что может обеспечивать присущую только этому типу мускулатуры возможность долговременной контрактуры.
Результаты данной фундаментальной работы могут иметь практическую значимость как для биофизиков и физиологов, так и для биохимиков и фармакологов. Выявленные пуринергические механизмы выглядят очень привлекательными в качестве мишени для фармакологического воздействия и, следовательно, создания лекарств принципиально нового механизма действия.
Апробации работы.
Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговой конференции Казанского научного центра РАН (Казань, 2002); II научной конференции с Международным участием «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002); II международной научно-практической конференции «Дисфункция эндотелия: экспериментальные и клинические исследования» (Витебск, Беларусь, 2002); VI, VII и Х Всероссийских научных конференциях с международным участием «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2002, 2004, 2010); 6, 7, 8-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2004); II, III и VI Всероссийских с международным участием школах-конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2011); International synaptogenesis meeting (Вена, Австрия, 2003); Международном симпозиуме «Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals (Москва, 2003); Международных чтениях «Фундаментальные и клинические аспекты интегративной деятельности мозга: материалы» (Москва, 2003); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003); Всероссийской конференции с международным участием «Нейроэндокринология» (Санкт-Петербург, 2003); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XIX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004); Международных симпозиумах «Biological motility» (Пущино, 2004, 2006, 2008); Научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии; гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004); II международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004); conference «The world of the synapse: molecular basis, pathologies and drug discovery» (Жиф-сюр-Ивет, Франция, 2004); V общероссийский съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); Международном молодежном медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2005); Х Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 2005); Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005); IX Всероссийской школы «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 2005); III Международной конференции «Болезни цивилизации в аспекте учения В.И.Вернадского» (Москва, 2005); I конференции с международным участием «Качественное использование лекарств и фармаконадзор» (Казань, 2005); I и III Всероссийских с международным участием конференциях «Управление движением» (Великие Луки, 2006, 2010); PENS summer course (Казань, 2007); XX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).
Структура и объем диссертации.
Похожие диссертации на Пуринергическая синаптическая модуляция сокращения различных типов скелетных мышц
-
