Содержание к диссертации
Введение
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1. Структура нейромышечного соединения 8
2.2. Структурные изменения области НМС в условиях воздействия некоторых экзо- и эндогенных факторов 30
III. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 45
4.1. Конструкция ферментоактивных зон нейромышечных синапсов различных мышц таза и бедра белой крысы в постнатальном развитии 45
4.2. Гистохимическая характеристика ФАЗ НМС некоторых мышц таза и бедра белой крысы 58
4.3. Гистохимическая оценка метаболического профиля некоторых мышц таза и бедра белой крысы 99
V. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 105
ВЫВОДЫ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
- Структура нейромышечного соединения
- МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Конструкция ферментоактивных зон нейромышечных синапсов различных мышц таза и бедра белой крысы в постнатальном развитии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования двигательного окончания
скелетной мышцы насчитывают более чем полугора вековую историю. Результаты световой и электронной микроскопии, полученные в прошлом столетии, составляют основу современных представлений о конструкции нейромышечного синапса (НМС) (Robertis Е. de., 1959; Couteaux R., 1960; Женевская Р.П., 1974; Загребин А.М. с соавт., 1985; Радзюкевич Т.Л., 1994; Waerhaug О., Lomo Т., 1994). Установлены структурные различия эффекторных окончаний поперечнополосатой мускулатуры в ряду позвоночных (Мавринская Л.Ф., 1962; Teravainen Н., 1971; Grinell A.D., Trussel L.O., 1983; Bone Q., Ono D., 1984). Исследования морфологии двигательного окончания в аспекте метаболической либо функциональной принадлежности мышц определенных групп представлены в работах Н.М. Шамариной (1965), RabergerE. (1971), Kerneliussen Н., Waerhaug О. (1973), Д.В.Баженова (1979), Н.В.Томилина с соавт. (1990).
Гистохимические изыскания, направленные на выявление активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ), позволяют достоверно отразить структурно-функциональное состояние НМС (Манолов С, 1965; Miledi R. и др., 1968; Поздняков О.М., 1968; Teravainen Н, 1969; Николаев Г.М., Шилкин В.В., 1983; Tabuchi М. и др., 1991). Энзимохимические свойства системы «двигательное окончание - мышечное волокно» изучались в ходе постнатального онтогенеза (Шилкин В.В., Филимонов В.И., 1996, 1997; Огнетов С.Ю., 2003), в условиях воздействия ряда экзогенных факторов (Аккуратов ВТ. с соавт., 1995; Сабельников Н.Е., 2000; Ковригина Т.Р., 2001; Ардашев А.Е., 2002).
Бесспорный интерес вызывает вопрос гистохимической организации
НМС Групп МЫШЦ, участвующих В работе тду^йя пр-чирг^ р кгррнялт
гас НАЦИОНАЛЬНАЯ] БИБЛИОТЕКА 1
суставов. Продолжает оставаться неисследованной динамика преобразований количественных и качественных характеристик конструкций ферментоактивных зон (ФАЗ) НМС мышц таза и бедра в течение постнатального развития. В данных литературы отсутствуют сведения о функциональном и метаболическом профиле вышеозначенных мышц.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление закономерностей в преобразованиях ферментоактивных зон нейромышечных синапсов и количественного состава определенных типов мышечных волокон некоторых мышц таза и бедра белой крысы в постнатальном онтогенезе.
В ходе исследования в соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
-
Изучить гистохимическую характеристику области нейромышечных синапсов мышц таза (большая, поясничная, средняя ягодичная) и бедра (прямая, двуглавая, длинная приводящая мышцы) на протяжении постнатальной жизни животного.
-
Определить морфометрические показатели, ферментоактивной зоны нейромышечных синапсов исследуемых мышц в постнатальном онтогенезе.
-
Установить закономерности качественных и количественных преобразований ферментоактивной зоны нейромышечных синапсов мышц таза и бедра в разные периоды внеутробного развития.
-
Исследовать метаболический профиль мышц таза и бедра белой крысы.
-
Выявить зависимость гистохимической организации ферментоактивных зон нейромышечных синапсов от типовой принадлежности исследуемых мышц.
Научная новизна. Впервые проводится изучение возрастных преобразований мышц таза и бедра с использованием гистохимической методики Николаева - Шилкина (1983) с последующей морфометрической оценкой данных. В результате проведенного исследования получены новые сведения о преобразованиях качественных и количественных характеристик ФАЗ НМС исследованных мышц на всем протяжении постнатального развития. Впервые описаны изменения конструкций ФАЗ НМС в зависимости от метаболической принадлежности мышц таза и бедра. Установлены основные этапы в возрастных преобразованиях двигательных окончаний скелетных мышц.
Научно-практическая ценность. Настоящее исследование имеет отчетливую теоретическую направленность и расширяет представления о морфологии опорно-двигательного аппарата и периферической нервной системы. Полученные сведения позволят детально описать возрастную динамику преобразований качественных и количественных параметров ФАЗ НМС, их гистотопографию в ряде мышц таза и бедра. Это может быть использовано в клинической (травматология, ортопедия, неврология, спортивная медицина) и экспериментальной медицине, а также в лекциях, посвященных морфологии периферической нервной системы и скелетных мышц. Возрастные изменения, приводящие к частичной или полной потере трудоспособности, сложно понять без установления процессов, протекающих на уровне системы «двигательное окончание — мышечное волокно». Изучение активности АХЭ в области НМС, а также определение количественного состава типов мышечных волокон (MB) в исследованных мышцах позволят получить сведения, важные в плане раскрытия этиопатогенеза ряда нейромышечных заболеваний. Положения, выносимые на защиту.
-
В течение постнатального онтогенеза область нейромышечного синапса исчерченных мышц претерпевает ряд определенных качественных изменений.
-
Качественные и морфометрические изменения ферментоактивных зон нейромышечных синапсов определяются степенью функциональной зрелости мышцы.
-
Гистохимическая организация ферментоактивных зон нейромышечных синапсов коррелирует с метаболическим профилем исследованных мышц.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на заседаниях Удмуртского отделения ВНОАГЭ (Ижевск, 2001, 2002); Межкафедральной конференции Ижевской государственной медицинской академии кафедр анатомии человека, гистологии и эмбриологии, биологии, топографической анатомии и оперативной хирургии (2002,2003,2004).
Реализация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 143 страницы, состоит из введения, главы материалы и методы, четырех тематических глав, включающих обзор литературы, результаты собственных исследований, заключения и выводов. Указатель литературы содержит 326 работ. Работа иллюстрирована 89 рисунками, 18 таблицами. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Структура нейромышечного соединения
История изучения иннервации скелетной мускулатуры берет начало с середины девятнадцатого столетия, когда Дуаер в 1841 году обнаружил двигательный бугорок на поверхности мышечного волокна тихоходок (Tardigrada). Ранние исследования строения нейромышечных синапсов, основанные на методах интерстициальной инъекции осмиевой кислоты, импрегнацией хлорным золотом, с последующей прижизненной окраской метиленовой синью, привели к возникновению двух концепций о строении двигательного окончания. Представители первой (Gerlah I., 1874; Langley J. N., 1905; Boecke J., 1932; Stohr Ph., 1928) развивали теорию континуитета -непрерывного строения нервной ткани. Герлах (1874) утверждал, что вещество миофибрилл имеет нервную природу и является «концевым органом мышечных нервов». Позднее Буке (1932) выдвинул предположение о существовании особой перитерминальной сети, тесно связанной с нейро-фибриллами, пронизывающей все мышечное волокно.
Однако, большинство авторов придерживались мнения об анатомической обособленности нервных и мышечных структур в зоне их сочленения. М.Д. Лавдовский (1884, 1885) определял нервно-мышечное соединение как «нервное окончание на мышечном волокне, в подошве, под сарколеммой», и отмечал, что внутримышечные сети Герлаха в действительности есть протоплазматический остов внутри мышцы. Подобных взглядов о дискретности нервно-мышечных отношений придерживались П. Митрофанов (1888), К.А. Арнштейн (1898, 1900). Б.И. Лаврентьев (1928, 1934, 1935) подверг критике концепцию Буке (1932), утверждая, что перитерми-нальные сети есть «искусственные образования, вызванные деформацией шванновского симпласта при фиксации концентрированными растворами формалина». Ноэль Р. (1932), К.А. Лавров (1941), В.В. Португалов (1955), Б.И. Лаврентьев, Е.К. Плечкова (1959) пришли к заключению, что связь нервов с иннервируемым ими субстратом представляет собой непрямые соединения, так как всегда осуществляется с участием элементов глиального происхождения. В дальнейшем, при использовании электронной микроскопии (Couteaux R., 1955, 1960; Robertis Е. de., 1959) была детально изучена ультраструктура НМС, выявлена синоптическая щель, расположенная между пре- и постсинаптической мембранами.
Одновременно с развитием представлений о морфологии двигательного окончания исследовалась физиология НМС. Природа нервно-мышечной передачи рассматривалась с нескольких позиций. Сторонники электрической теории (Eccles J. С, 1937; Eccles J. С, O Connor W. J., 1939; Беритов И., 1947) полагали, что токи действия, идущие по нерву, непосредственно переходят на MB и являются для него раздражителем, основываясь на теории о непрерывности нервной ткани в модификации Воеске J.(1932)nStohrPh.(1932).
Однако еще Du-Bois Reymond Е. (1875) предположил, что на границе контрактильной субстанции должно секретироваться возбуждающее вещество. Позднее Langley J. N. (1906) выдвинул гипотезу о существовании специальной химически активной части на поверхности MB, которую он обозначил термином «рецептивная субстанция». Ему же принадлежат слова, что «нервный импульс передается с нерва на мышцу посредством секреции специального вещества в нервных окончаниях». Riesser О. (1921) открыл действие ацетилхолина на скелетную мышцу лягушки, которое проявлялось ацетилхолиновой контрактурой мышцы. Дальнейшие исследования (Frank Е. и др., 1923; Hess W. R., 1923; Shimidzu К., 1926) подтвердили ацетилхолиновую природу передачи импульса НМС. А.Ф. Самойлов (1924, 1929), основываясь на градиенте температурного коэффициента нервного и мышечного волокна, впервые экспериментально обосновал предположение, что в окончаниях соматических нервов выделяется вещество - возбудитель MB.
Материал и методы исследования
Объектом исследования служили скелетные мышцы таза и бедра белой беспородной крысы. Исследование проведено на 275 животных.
Сроки забоя животных соответствуют раннему молочному периоду (3, 7 сутки), среднему молочному (15 сутки), позднему молочному (21 сутки), предпубертатному (1 месяц), пубертатному (3 месяца), репродуктивному (6 месяцев), периоду первой зрелости (1 год), периоду второй зрелости (1,5 года), предстарческому (2 года) - по периодизации В.И. Махинько и В.Н. Никитина (1975).
Согласно данным литературы (Филимонов В.И., 1992, 1998) о влиянии способа умерщвления животного на выявление ХЭ-активности, предварительно наркотизированных гексеналом животных декапитировали.
Изучены конструкции ФАЗ НМС следующих 5-й мышц: 1) большая поясничная мышца (m. psoas major); 2) средняя ягодичная мышца (т. gluteus medius); 3) прямая мышца бедра (т. rectus femoris); 4) двуглавая мышца бедра (т. biceps femoris); 5) длинная приводящая мышца бедра (т. т. adductor longus femoris).
Для данного исследования использовалась методика выявления ХЭ в зоне НМС тиоуксусной кислотой в модификации Г.М. Николаева и В.В. Шилкина(1983).
После забоя животного мышцы забирались через 30 минут, это время обеспечивало необходимую миорелаксацию. Материал фиксировался в течение 18 -24 часов в охлажденном растворе 10% формалина (рН 6,8 -7,0). Срезы, толщиной в 40 мкм, изготовлялись на замораживающем микротоме. В дальнейшем срезы помещались на 15 - 18 минут в инкубационную среду, которая имела следующий состав:
0,1Мцитратный буфер рН 6,2 20 мл, 0,5% раствор нитрата свинца 0,5 мл, тиоуксусная кислота 0,03 мл.
После инкубации срезы промывались в дистиллированной воде в течение 1,0 - 1,5 часов, а затем заключались в глицерин-желатин.
Данная методика выявления активности специфической ХЭ в зоне НМС основана на гидролизе тиоуксусной кислоты АХЭ. Достаточная простота и высокая скорость проведения, воспроизводим ость эксперимента и четкие критерии оценки реакции, разработанные авторами, позволили использовать данный метод в нашей работе.
Полученные микропрепараты оценивали методами качественного и количественного анализа. Качественными критериями являлись: выраженность активности ХЭ; характер отложения продукта реакции и топография ФАЗ НМС; наличие или отсутствие околосинаптической активности фермента; количество ФАЗ, приходящееся на одно MB. Количественный анализ проводился согласно принципам непрямой морфометрии (Автандилов Г.Г., 1990). В исследовании использовался микроскоп МБИ-3 с бинокулярной насадкой (1,5х, объектив 40х, окуляр 7х). Для подсчета использовались две окулярные сетки с равноудаленными узлами пересечения. Первая сетка применялась для подсчета показателей с препаратов, полученных от животных младших возрастных групп (с 7-ми суток до 1-го месяца); вторая сетка - для старших возрастных групп (с 3-х месяцев до 2-х лет).
Конструкция ферментоактивных зон нейромышечных синапсов различных мышц таза и бедра белой крысы в постнатальном развитии
Проведенное исследование позволило выявить наряду с различиями в возрастной организации ФАЗ НМС изученных мышц некоторые общие детали строения и гистотопографии данных структур.
Было установлено, что совокупность НМС является неоднородной и состоит из простых АХЭ-позитивных форм с гомогенной локализацией мелкодисперсного конечного продукта реакции в относительно небольших по размерам конструкциях (рис. 1), либо сложных ФАЗ НМС, в которых топография конечного продукта реакции воспроизводит трабекулярную конструкцию с наружным контуром, ограничивающим ФНЗ (рис. 2). Простые ФАЗ имеют округлую, овальную или веретенообразную форму, иногда с отдельными выростами. Обнаруживаемые в ряде случаев глобусы ферментативной активности также относятся к простым формам. Более вариабельна популяция НМС со сложной ХЭ-позитивной зоной. Сложные конструкции имеют округлую, лентовидную, полигональную форму, с замкнутым или разорванным контуром, ФНЗ может занимать в них как центральное, так и периферическое положение.
Возрастные преобразования ФАЗ НМС затрагивают характер трабекулярного рисунка: трабекулы могут иметь равномерно утолщенный, четкообразный, глобулярный вид. В ряде случаев отмечается источение трабекул ФАЗ с увеличением ФНЗ. Во всех исследованных мышцах наблюдаются переходные формы ФАЗ НМС, возникающие в результате утолщения и слияния трабекул сложных конструкций, редукции ФНЗ с дальнейшей трансформацией в гомогенную форму (рис. 3). В другом случае переходные конструкции иллюстрируют трансформацию простых ФАЗ в сложные, при этом они представлены основной структурой с формирующимися боковыми выростами, которые ограничивают ФНЗ (рис. 4). В определенных возрастных группах отмечалось явление множественной иннервации, когда в пределах одного MB обнаруживается до 2 - 3 изолированных конструкций ФАЗ или присутствуют малые гомогенные глобулы вблизи основной АХЭ-позитивной зоны (рис. 5). Множественная иннервация MB двумя и более НМС свойственна всем исследованным мышцам, как правило, в ранние сроки наблюдения, до 30 суток постнатального развития.
Форма и характер трабекулярного рисунка АХЭ-позитивной зоны, насыщенность и равномерность окраски области НМС иллюстрируют тинкториальные свойства области нейромышечного соединения. Качественные изменения ФАЗ НМС, наблюдаемые начиная с репродуктивного периода, характеризуются фрагментацией сложных и простых конструкций (рис. 6, 7), в части ФАЗ НМС отмечается неравномерное снижение активности фермента (рис. 8).
Вышеперечисленные критерии оценки двух основных групп ХЭ-позитивных зон НМС — простых и сложных форм, позволяют дать им детальную качественную оценку на протяжении постнатального развития; охарактеризовать систему «двигательное окончание - мышечное волокно» в конкретном возрастном периоде. Гистотопография НМС в определенной мышце приобретает дефинитивные черты к 1 месяцу жизни животного. В последующие сроки, по мере роста мышцы, конструкции все более отдаляются друг от друга, однако структуры цепочек или полей ФАЗ НМС сохраняются.
