Введение к работе
Актуальность работы. Явление химического мутагенеза, связанное с
открытием мутагенной активности у химических соединений и совершенное
одновременно советским и немецким исследователями И.А. Рапопортом и Ш.
Ауэрбах, привело к развитию нового направления в исследованиях репарации ДНК с
использованием химических мутагенов различной природы (Рапопорт, 1946; Auerbach
and Robson, 1946). Значительную группу соединений с высокой мутагенной
активностью, составляют алкилирующие агенты, способные интенсивно
взаимодействовать со структурами клеточной ДНК, вызывая токсические, мутагенные и тератогенные эффекты. Учитывая указанные характеристики, алкилирующие соединения стали основой создания нового класса клинических лекарственных препаратов, высокоэффективных в химиотерапии злокачественных новообразований. Приоритетные работы по синтезу ряда алкилирующих «супермутагенов» из класса нитрозоалкилмочевин, изучению молекулярных механизмов их активности и разработке методов их применения в клинике, в селекции микроорганизмов и высших растений, а также в экологических исследованиях были инициированы и выполнены в Институте химической физики АН СССР (Рапопорт, 1962; Островская и др., 1964; Эмануэль и др., 1978) и продолжаются в ИБХФ РАН. Эти работы важны и актуальны и в настоящее время.
В Escherichia coli системы защиты ДНК от алкилированных повреждений включают гены ogf и tag, экспрессирующиеся конститутивно, и ada, alkB, alkA и aidB, экспрессия которых, в основном, индуцибельна и связана с развитием в клетке так называемого «адаптивного ответа». Феномен ДНК-репарационного «адаптивного ответа» (АО), был впервые описан в E.coli (Samson and Cairns, 1977), и он выражается в ингибировании цитотоксического и мутагенного эффектов алкилирующих агентов при их воздействии на клетки, предварительно обработанные сублетальными дозами этих же соединений.
Было установлено, что развитие АО в E.coli контролируется белком Ada, который регулирует экспрессию 4-х генов: ada, alkB, alkA и aidB (Ada-регулон) (Sedgwick and Lindahl, 2002). В литературе описаны механизмы регуляции экспрессии генов ada, alkB, alkA, их продукты и функции (Volkert, 1988; Landini and Volkert, 2000; Drablos et al., 2004; O'Brien and Ellenberger, 2004). Однако, очень долгое время оставался нерешенным вопрос о гене aidB, механизм регуляции которого уникален и значительно отличается от механизмов регуляции остальных генов Ada-регулона. В аэробных условиях активация транскрипции aidB контролируется метилированным белком Ada (meAda), однако в стационарной фазе роста и в анаэробных условиях экспрессия aidB позитивно регулируется как meAda, так и РНК-полимеразой as (продукт гена rpoS) (Volkert et аі., 1989; Volkert et аі., 1994; Taverna and Sedgwick,
1996). Структурный анализ белка AidB выявил его гомологию с белками семейства ацил-СоА-дегидрогеназ человека (Landini et al., 1994). Были получены доказательства функционирования гена aidB в качестве «гена опасности», который включается в процесс репарации при очень высоком уровне алкилирования ДНК, когда экспрессии остальных генов Ada-регулона недостаточно для сохранения жизнеспособности клеток. Это важно учитывать при работе с известными высокоэффективными в онкотерапии бифункциональными хлорнитрозоалкилмочевинами - ACNU, BCNU (Васильева и Мошковская, 2005).
В 2007 г. в работе (Crack et al., 2007) была опубликована структурная модель белка Fnr - единственного регулятора анаэробного метаболизма Е. coli. Установлено, что активная форма этого белка содержит железо-серный кластер [4Fe-4S]2+, обладающий функциями сенсора. При анаэробном метаболизме железо-серные белковые кластеры составляют основную мишень для оксида азота (NO), накопление которого в этих условиях было установлены в работе (Corker and Poole, 2003).
Суммируя вышеизложенное, в лаб. теоретической генетики ИБХФ РАН было выдвинуто предположение о белке Fnr как NO-сенсоре и регуляторе экспрессии гена aidB при анаэробном культивировании, и развернуты исследования для его экспериментального обоснования. В настоящей работе содержится теоретическое и экспериментальное обоснование новой сигнальной функции NO - регуляции экспрессии уникального гена aidB Ada-регулона у факультативного анаэроба E.coli. Развитие этого направления внесет вклад в понимание механизмов сигнальных функций NO и связанных с ними путей метаболизма в условиях анаэробиоза.
Целью работы является получение теоретических и экспериментальных доказательств новой сигнальной функции оксида азота, как регулятора активности гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях, и выявление молекулярно-генетических механизмов процесса регуляции.
Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:
-
Изучение кинетики экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli при культивировании в анаэробных условиях и получение молекулярно-генетических и биохимических доказательств регуляции процесса белком Fnr [4Fe-4S]2+.
-
Сравнительное изучение кинетики экспрессии гена aidB при обработке клеток различными донорами оксида азота и выявление зависимости процесса от структуры NO-доноров;
-
Изучение интенсивности и формы сигналов ЭПР-спектров клеток E.coli, обработанных различными NO-донорами и корреляции этих параметров с уровнем экспрессии гена aidB. Определение структуры NO-сигнальной молекулы.
-
Изучение роли клеточного железа в трансдукции сигнала оксидом азота.
-
Получение доказательств обратимости процессов распада и сборки [4Fe-4S]2+ кластера белка-регулятора Fnr E.coli при нитрозилировании: идентификация in vivo продуктов распада кластера [4Fe-4S]2+, изучение вклада белков IscA и SufA в процесс сборки кластеров. Определение источников серы (S) для процесса сборки [Fe-S] кластеров in vivo и in vitro.
Научная новизна диссертации. Впервые доказана новая научная гипотеза и изучен молекулярно-генетический механизм регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона Е. соїі. В основе механизма регуляции - обратимая конверсия кластера белка анаэробиоза Fnr [4Fe-4S]2+, который является - NO-мишенью, сенсором и регулятором экспрессии гена Е. coli aidB.
Установлена позитивная корреляция между параметрами анизотропного ЭПР спектра с g-фактором 2,03, формирующегося в клетках при обработке NO-донорами, и уровнем ингибирования экспрессии aidB в клетках. Выявлены механизмы и закономерности формирования «широкого» тио сульфатного и «узкого» дисульфидного сигналов ЭПР g=2,03 в клетке, связанных с внутриклеточным формированием сигнальных молекул динитрозильных комплексов железа с тиоловыми либо персульфидными лигандами, соответственно. Впервые in vivo изучен механизм распада [Fe-S] кластеров в белке Fnr[4Fe-4S]2+ E.coli и рассмотрена гипотеза о функции фермента цистеин-десульфуразы IscS в реконструкции [Fe-S] кластеров. Впервые в экспериментах in vivo показано, что в качестве источников серы в процессе реконструкии [Fe-S] белковых кластеров в E.coli используется наряду с органическими источниками и неорганическая сера.
Практическая значимость работы. Представленные в диссертации собственные экспериментальные данные позволяют расширить понимание роли оксида азота в процессах клеточного метаболизма и репарации ДНК. На основе описанных ранее в литературе фактов о 1) структурной и функциональной гомологии белка AidB с СоА-дегидрогеназами животных и человека; 2) аналогии димерных структур и функций у универсальных регуляторов анаэробного метаболизма в клетках E.coli и млекопитающих - белков Fnr[4Fe-4S]2+ и фактора HIF-la; и 3) функции продукта гена aidB в повышении клеточной резистентности к генотоксической активности алкилирующих соединений - полученные нами результаты целесообразно использовать для оптимизации применения препаратов бифункциональных алкилирующих агентов (ACNU, BCNU) в клинике для лечения онкозаболеваний.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Селективное ингибирование N0 экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях культивирования клеток.
-
Зависимость экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях
культивирования от активной димерной структуры белка-регулятора Fnr[4Fe-4S]2+: избыток/недостаток внутриклеточного Fe2+, как фактор железо-серного кластера [4Fe-4S]2+, приводил, соответственно, к стимуляции/ингибированию экспрессии гена aidB.
-
Изучение in vivo продуктов распада кластера [4Fe-4S]2+ белка Fnr E.coli при его взаимодействии с N0.
-
Экспериментальное доказательство возможности использования клеткой E.coli, наряду с L-цистеином, других органических соединений (1,4-ДТТ, N-ацетил-Ь-цистеин) и неорганического Na2S в качестве источников серы при реконструкции белковых железо-серных кластеров.
-
Изучение механизмов формирования «широкого» тио сульфатного и «узкого» дисульфидного сигналов ЭПР ДНКЖ g=2,03 в клетке, как показателей распада либо реконструкции железо-серных белковых кластеров, соответственно.
-
Экспериментальное подтверждение гипотезы о [Fe-SJ-кластерах железо-серных белков как основном субстрате при внутриклеточном формировании сигнальной молекулы ДНКЖ.
Апробация результатов. Основные положения и результаты проведенных исследований были представлены автором на VIII Международной Молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Россия, г. Москва, 2009, 2013); V- VI- VII- VIII- IX- Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, г. Москва, 2009-2013); Конференции молодых ученых с международным участием «Симбиоз Россия» (Россия, г. Пермь, 2009); Международном симпозиуме «Биология - наука XXI века» (Россия, г. Пущино, 2010); XVII и XX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Россия, г. Моска, 2010, 2013); VI Съезде по радиационным исследованиям (Россия, г. Москва, 2010); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Россия, г. Пущино, 2011, 2013); 5th European Young Investigator Conference (Germany/Poland, Frankfurt-Oder/Slubice, 2011); Summer school of the Society for Free Radical Research - Europe (Greece, Spetses, 2012); V International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology «BioMicroWorld» (Spain, Madrid, 2013).
В рамках конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» работа отмечена дипломом 2-ой степени (2009) и присуждением медалей (2009-2012) за лучшую исследовательскую работу; работа отмечена дипломом 1-ой степени за лучшую исследовательскую работу в рамках симпозиума «Симбиоз Россия» (2009), а также грамотой за лучшую исследовательскую работу на конференции «Ломоносов» (2013).
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 08-04-00228-а, 11-04-003 99-а и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» 01-РАН-21.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 24
работы, из них 13 статей в журналах и сборниках научных трудов (в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК) и 11 тезисов докладов в сборниках материалов международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 106 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 174 источника. Диссертация иллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами.
