Введение к работе
Актуальность- темы.
Факт образования в организме опухоли означает неэффективность работы специфических механизмов отслеживания и уничтожения трансформированных клеток. Следовательно, возрастает роль неспецифических механизмов защиты организма [Ackermann et al.,1989; Kessel ICP.M.van, Verhoef J. 1990], которая до конца неясна. Рост опухоли сопровождается распространением сигналов, которые активируют компоненты врожденного иммунитета, клеточной составляющей которого, помимо натуральных киллерных клеток, являются полиморфноядерные лейкоциты (в основном, это нейтрофилы и моноциты), а также тканевые макрофаги. Активация данного типа клеток, относящихся к фагоцитам, сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК) и активных форм азота (АФА). При действии иммунных комплексов, активаторов рецепторов, микрочастиц на плазматической мембране фагоцитов происходит сборка и активация НАДФН-оксидазы, работа которой превращает От в супероксид анион (Ог""). Дальнейшие превращения (Ог""") образуют ряд АФК, таких как гидроксил радикал, перекись водорода и т.д. Индукция другой ферментной системы фагоцитов - iNO-синтазы приводит к продукции оксида азота (N0), который является важным регуляторным фактором во многих системах организма, а также обеспечивает цитотокси-ческую активность данного типа клеток [Lepoivre et al.,1991]. Бактерицидное и цитотоксическое действие NO и АФК во многом зависит от продуктов их взаимодействия [Paulluy О, 1996]. Возникающие в таких реакциях активные метаболиты - пероксинитрит, диоксид азота, и др. обладают высокой реакционной способностью и могут повреждать различные клеточные структуры, изменяя их функциональную активность. Так процесс нитрозилирования белков под действием активных форм азота является одним из механизмов регуляции активности некоторых ферментных систем [Kozlov, А.V., Staniek, К., and Nohl, Н.(1999) FEBS Lett., 454, 127-130]. Следует отметить, что некоторые метаболиты N0, такие как S-нитрозотиолы и сам N0, при определённых условиях могут проявлять антиоксидантную активность [Hogg, N., 1993]. Например, оксид азота может связываться с ионами железа, которые катализируют реакции свободно-радикального окисления. Связывание железа вызывает тем самым ингибирование процесса разветвления свободно-радикальной цепи.
Таким образом, для понимания роли реакций неспецифического иммунитета при росте в организме злокачественных опухолей, актуальным является исследование состояния АФК - и N0-генерирующих систем, а также процесса их взаимовлияния в ходе роста опухоли. Активность этих систем определяет баланс антиоксидантных и прооксидантных реакций, как в зоне патологии, так и в кровеносном русле. В частности, это исследование динамики основных внеклеточных метаболитов оксида азота, таких как нитраты/нитриты, пероксинитрит (продукт взаимодействия оксида азота и супероксид аниона) и нитрозотиолы в организме опухоленосителя. Изменение количественного и качественного состава продуцируемых организмом АФК и активных форм азота (АФА) могут выразиться в качественных изменениях поведения системы в целом. При этом с ростом концентрации этих метаболитов растет число потенциальных мишеней - от передачи сигналов до регуляции активности отдельных систем и цитотоксического эффекта.
г .J
В настоящее время одновременного исследования уровня метаболитов оксида азота и АФК в двух компартментах опухоленосителя - в плазме крови и в зоне роста опухоли не проводилось. Не выявлены временные параметры образования метаболитов N0 с разными функциональными свойствами. Недостаточно исследовано влияние соотношения между активными формами кислорода и азота на интенсивность опухолевого роста. В связи с этим является актуальным детальное исследование основных метаболитов оксида азота в плазме и асцитной жидкости опухоленосителя, исследование влияния экзо- и эндогенного оксида азота на АФК-генерирующую активность фагоцитирующих клеток (нейтрофилов и макрофагов) и использование модуляторов уровня оксида азота и АФК с целью снижения интенсивности опухолевого роста в организме опухоленосителя.
Цель работы
Исследование временных и количественных характеристик метаболитов оксида азота в крови и асците опухоленосителя, а также возможности их коррекции с целью подавления опухолевого роста.
Задачи исследования
1. Изучить динамику следующих внеклеточных метаболитов оксида азота в крови и асцит
ной жидкости при развитии гепатомы Зайделя:
а) нитратов/нитритов как конечных продуктов метаболизма короткоживущего соединения
N0;
б) нитротирозина — продукта NO-зависимого окисления тирозина в присутствии 02-;
в) нитрозилированных SH- групп белков как важнейшего маркера нитрозилирующего
стресса;
-
Исследовать роль оксида азота в регулировании АФК-генерирующей активности фагоцитирующих клеток крови и асцита в процессе роста опухоли;
-
В опытах in vivo изучить действие NO- и АФК-модулирующих веществ на развитие нитрозилирующего и окислительного стресса и рост опухоли в организме.
Научная новизна.
В рамках диссертации впервые проведено одновременное исследование динамических параметров крови и асцита, характеризующих поведение неспецифического иммунитета в ответ на развитие асцитной гепатомы Зайделя. Впервые наряду с окислительным стрессом в плазме опухоленосителя показано развитие «нитрозилирующего стресса». Показано, что максимальная концентрация различных метаболитов оксида азота (пероксинитрит, NO-модифицированные белки и нитриты/нитраты) связана с различными фазами роста опухоли и имеет разную кинетику Впервые исследовано влияние эндо и экзогенного донора оксид азота, а также ингибитора NO-синтазы на АФК-генерирующую активность перитониальных макрофагов и лейкоцитов крови в процессе развития опухоли. Впервые проведены исследования по модификации уровня нитрозилирующего стресса в организме опухоленосителя с помощью инъекций доноров N0, ингибитора NO-синтазы и флавоноидов с целью подавления роста опухоли в организме животного.
Практическая ценность.
Представленные в диссертации экспериментальные данные способствуют выявлению закономерностей формирования неспецифического иммунного ответа организма на образование злокачественных опухолей с целью поиска способов управления ими. Показана значительная роль оксида азота и его метаболитов в патогенезе асцитной опухоли, что говорит о необходимости контроля параметров нитрозилирующего стресса при лечении злокачественных процессов с целью улучшения качества терапевтического воздействия. Результаты могут быть использованы для разработки протоколов терапии патологических процессов, связанных с развитием окислительного и нитрозилирующих стрессов с использованием флавоноидов и регуляторов продукции N0.
Апробация работы.
Результаты работы в качестве докладов были представлены на международных конференциях: «Биология-наука XXI века» 2006, 2007, 20011гг. «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» 2009, «Рецепция и Внутриклеточная сигнализация», 2011.
Публикации.
Работа и опубликованные по ней материалы: 6 статей в рецензируемых журналах^ 3 статьи в трудах конференций и 17 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит Ї0 рисунков и / таблиц. Диссертация изложена на Mi страницах.
