Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор. Окислительно-восстановительные свойства нитроксильных радикалов 7
1.1. Типы нитроксильных радикалов 7
1.2. Спиновые зонды на N0 8
1.3. Окислительно-восстановительные реакции нитроксильных радикалов 13
1.3.1. Электрохимическое окисление и восстановление нитроксильных радикалов 13
1.3.2. Восстановление нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой 15
1.3.3. Окислительно-восстановительные превращения нитроксильных радикалов в биологических системах in vitro и in vivo IS
1.3.3.1. Окисление нитроксильных радикалов и их гидроксиламинов супероксидным радикалом in vitro 18
1.3.3.2. Восстановление нитроксильных радикалов тполсодержащими соединениями in vitro (на примере глутатиона) 21
1.3.3.3. Применение нитроксильных радикалов in vivo как зондов на окислительно-восстановительный статус среды 22
1.4. ЯМР спиновых ловушек как метод исследования диамагнитных продуктов метаболизма нитроксильных радикалов 27
Глава 2. Сравнительное исследование реакций восстановления нитроксильных радикалов нирролидинового, имидазолинового и имидазолидинового типов 29
2.1. Исследование механизма реакции восстановления нитроксильных радикалов нирролидинового, имидазолинового и имидазолидинового типов аскорбиновой кислотой 31
2.1.1. Обратимость реакции восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой 31
2.1.2. Окисление гндроксиламинов HP радикалом аскорбата 36
2.1.3. Окисление гндроксиламинов ИР дегидроаскорбиновой кислотой 37
2.1.4. Схема реакции и математическое моделирование 39
2.1.5. Изучение влиянин глутатиона на восстановление ннтроксильных радикалов аскорбиновой кислотой 45
2.2. Сравнительное исследование стабильности к восстановлению радикалов имидазолинового, имидазолидинового и пирролидинового типов
2.3. Сравнительное исследование стабильности к восстановлению тетраметил- и тетраэтилзамещёнпых иитроксидов 51
Глава 3. Исследование механизма реакции между нитронилнитроксильпыми радикалами и оксидом азота ввосстановительной среде 56
3.1. Использование липо сом с целью увеличения стабильности нитроиилнитроксильных NO-зондов в восстановительной среде 56
3.2. Изучение реакции фтор содержащих нитроиилнитроксильных радикалов с N0 в восстановительной среде методом F ЯМР и ЭПР спектроскопии 60
3.2.1. Изучение магниторезопансных свойств фторсодержащих ННР 61
3.2.2. Исследование реакции фторзамещё'нных ННР с оксидом азота 64
3.2.3. Проверка возможности реакции гидроксиламипа ННР с оксидом азота 66
3,2,4, Изучение механизма реакции ННР с NO в восстановительной среде 67
3.3. Использование l9F ЯМР спектроскопии и фторсодержащих
нитроиилнитроксильных радикалов для детектирования NO ex vivo 73
Глава 4. Материалы и методы 78
Выводы 85
Благодарности 86
Список литературы
- Электрохимическое окисление и восстановление нитроксильных радикалов
- Восстановление нитроксильных радикалов тполсодержащими соединениями in vitro (на примере глутатиона)
- Окисление гндроксиламинов ИР дегидроаскорбиновой кислотой
- Изучение реакции фтор содержащих нитроиилнитроксильных радикалов с N0 в восстановительной среде методом F ЯМР и ЭПР спектроскопии
Введение к работе
Нитроксильные радикалы (HP) широко применяются во многих областях физико-химических и биологических исследований, в качестве контрастирующих добавок в процессах полимеризации и структурных единиц при конструировании органических ферромагнетиков. HP, будучи парамагнитными соединениями, используются в качестве спиновых зондов и меток для определения параметров микроокружения среды (полярность [1-3], вязкость [4-6], рН [7-9], концентрация кислорода [10-12]) с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). HP позволяют получать уникальную информацию при исследовании структурных характеристик биологических макромолекул и биомембран, в первую очередь на основе метода спиновых зондов [13]. Биомедицинское применение HP включает в себя их использование в качестве контрастирующих соединений в томографии [14-16] и физиологически активных соединений [17, 18].
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что исследование биологических систем с помощью HP проводится уже в течение 50 лет, до сих пор остаётся много нерешённых вопросов, что обусловленно как сложным характером биологических образцов, так и далеко не полным пониманием механизмов реакций HP с различными биологическими молекулами. Наиболее важными являются реакции окисления и восстановления, поскольку они не только отображают важную характеристику среды, так называемый окислительно-восстановительный статус, но и оказывают непосредственное влияние на интенсивность и даже на саму возможность детектирования сигнала ЭПР нитроксильных радикалов. Среди физиологически активных низкомолекулярных восстановителей аскорбиновая кислота (АК) и глутатион (ГЛ, GSH) в первую очередь отвественны за восстановление HP в различных тканях. Механизмы реакций HP с данными соединениями, как оказалось, были изучены недостаточно, несмотря на многочисленные публикации.
Другой важной физиологически активной молекулой, вступающей в многочисленные окислительно-восстановительные реакции в биологических системах, является оксид азота (N0). Специфическая реакция восстановления иитронилнитроксильного радикала (ННР) оксидом азота в иминонитроксильный радикал (ИНР) используется для детектирования N0 в отсутствии других восстановителей. Более того, в биологических средах ННР успешно используются как
антагонисты NO несмотря на их быстрое восстановление до гидроксиламшюв. Вопрос о механизме такого действия остаётся открытым.
Основными целями работы являлись:
исследование механизмов реакций восстановления нитроксильных радикалов различных типов биологически важными восстановителями - аскорбиновой кислотой, глутатионом и оксидом азота;
исследование механизма реакции ННР и N0 в восстановительной среде и разработка нового метода определения оксида азота ex vivo с использованием фторзамещё'нных ННР и 19F ЯМР спектроскопии на основе изученного механизма реакции.
Научная новизна работы. Изучен механизм восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой. Впервые было показано, что этот процесс характеризуется равновесием между нитроксильным радикалом и аскорбиновой кислотой с одной стороны, и гидрокс ил амином и радикалом аскорбата с другой стороны. Были обнаружены новые реакции, дающие существенный вклад в наблюдаемые кинетические кривые восстановления HP, а именно: окисление гидроксиламина радикалом аскорбата и дегидроаскорбиновой кислотой. Также было показано, что нитроксильные радикалы восстанавливаются продуктами разложения дегидроаскорбиновой кислоты, предположительно 2,3-дикетогулоновой кислотой. Впервые предложена и подтверждена математическим моделированием полная реакционная схема восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой.
Впервые показана роль глутатиона в восстановлении HP аскорбиновой кислотой. Хотя GSH не восстанавливает HP, но оказывает сильное влияние на их восстановление аскорбатом через восстановление продуктов окисления АК (радикал аскорбата и дегидроаскорбиновая кислота) обратно в аскорбиновую кислоту. Впервые измерена константа скорости реакции GSH с радикалом аскорбата (АР).
Проведено сравнительное исследование стабильности нитроксильных радикалов различных типов по отношению к восстановлению аскорбиновой кислотой. Показано, что стабильность HP уменьшается в ряду радикалов: пирролидин > имидазолидин > 3-имидазолина > 2-имидазолин-З-оксида (ННР). Было обнаружено, что замена метальных групп вблизи радикального центра нитроксида на этильные группы ведёт к увеличению стабильности соединений к восстановлению в присутствии как аскорбиновой кислоты, так и крови крыс.
Проведено исследование механизма реакции оксида азота и иитронилнитроксильных радикалов в восстановительной среде. Было показано, что ННР быстро восстанавливаются как в присутствии аскорбиновой кислоты, так и в биологической среде (гомогенат мозжечка крыс). Восстановленные формы (гидроксиламины) фторзамещённых ННР превращаются в соответствующие восстановленные формы (гидроксиламины) ЙНР в присутствии оксида азота. Было показано, что гидроксиламины ННР не реагируют с оксидом азота с образованием гндроксиламннов ИНР. Для осуществления такого процесса необходимо реокисление гидроксиламинов ННР обратно в радикал с последующей реакцией между ННР и оксидом азота. Образующийся ИНР, в свою очередь, восстанавливается до соответствующего гидроксиламина. На основе экспериментальных данных впервые была предложена реакционная схема взаимодействия питронилнитроксильных радикалов и оксида азота в восстановительной среде.
Был предложен новый метод регистрации оксида азота ex vivo основанный на методе F ЯМР спиновых ловушек с использованием фторзамещённых ННР.
Практическая ценность. В данной работе проведено детальное исследование механизма восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой, показана роль глутатиона в этом процессе. Полученные данные представляют несомненный интерес для исследователей, использующих HP как в качестве спиновых зондов, так и в качестве терапевтических соединений в биологических системах.
Предложен механизм нитронилнитроксильных радикалов с оксидом азота в восстановительных средах. На основе изученного механизма реакции предложен и апробирован метод регистрации оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых нитронилнитроксильных радикалов и спектроскопии ' F-ЯМР.
В первой главе работы приведён обзор литературы, в котором рассмотрена реакционная способность нитроксильных радикалов как одноэлектронных окислителей и восстановителей по отношению к некоторым важнейшим биологически активным молекулам. В обзоре приведены примеры использования HP в качестве зондов на окислительно-восстановительный статус среды биологической системы. В последнем параграфе описан метод ЯМР спиновых ловушек, который был с успехом использован для детектирования ненаблюдаемых методом ЭПР диамагнитных продуктов окислительно-восстановительных реакций спиновых аддуктов.
Во второй главе приведены результаты исследования механизма восстановления HP аскорбиновой кислотой. Восстановление HP аскорбиновой
кислотой сопровождается образованием гидроксиламина питроксильного радикала (ГАН). Впервые было обнаружено, что ГАН реокисляется как радикалом аскорбата, так и дегидроаскорбшювой кислотой обратно в HP. Были определены соответствующие константы скоростей. В работе исследована роль глутатиона (важнейший восстановитель в биологических системах) в процессе восстановления HP аскорбиновой кислотой. Было показано, что глутатион сам не восстанавливает HP, но повышает эффективность восстановления HP аскорбиновой кислотой вследствие реакции радикала аскорбата с глутатионом. Интересные данные получены при исследовании сравнительной стабильности HP различных типов к восстановлению аскорбиновой кислотой. Показано, что стабильность радикалов уменьшается в ряду: пирролидин, имидазолидин, имидазолин и 2-имидазол-З-оксид. Изучено влияние введения этильных заместителей (вместо метильных) во второе и пятое положения гетероцикла HP на скорость восстановления аскорбиновой кислотой. Показано, что введение этильных заместителей вблизи радикального центра HP приводит к увеличению стабильности соединений.
В третьей главе приведены результаты исследования реакции нитронилнитроксильных радикалов с оксидом азота. Впервые предложен и экспериментально подтверждён механизм данной реакции в восстановительной среде. Показано, что, несмотря на быстрое восстановление, ННР реагирует с N0 с образованием гидроксиламина нминонитроксильного радикала. Продемонстрировано, что гидроксиламин ИНР образуется вследствие реакции между ННР и N0. При этом радикал ННР получается при реокисления соответствующего гидроксиламина. Применение фторзамещённых ННР позволило регистрировать превращение диамагнитного гидроксиламина ННР в гидроксиламин ИНР методом ,9F ЯМР. В то же время, образование парамагнитного радикала ННР и его трансформацию под действием оксида азота в ИНР регистрировали методом ЭПР. На основе полученных результатов предложен метод определения количества оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых ННР и ' F-ЯМР спектроскопии. Метод апробирован на животных на примере нескольких линий крыс, предположительно отличающихся уровнем генерации оксида азота. Наблюдалось хорошее согласие с результатами, полученными по измерению накопления нитритов и нитратов в крови животных.
Список использованных сокращений, реагентов и методик приведён в четвёртой главе данной работы.
Электрохимическое окисление и восстановление нитроксильных радикалов
Взаимодействие ННР и оксида азота высоко специфично [55]. Так, спектр электронного парамагнитного резонанса, характерный для иминонитроксильных радикалов, не был получен в результате взаимодействия нитронилнитроксильных радикалов с N02, 02 , ОН-радикалами [55, 56].
Стехиометрия реакции ННР и N0 различна при варьировании концентрации реагентов. В результате взаимодействия нитронилнитроксилыюго радикала и оксида азота в системе также протекают побочные реакции, показанные в схеме 1.3.
При концентрации ННР 1мМ и скорости генерации N0 1нМ/с из одной молекулы оксида азота получается одна молекула ИНР, то есть стехиометрия реакции (1.2) составляет 1:1 [71]. При более высоких скоростях генерации N0 получающийся в реакции (1.2) диоксид азота реагирует с оксидом азота по реакции (1.3), тем самым понижая стехиометрию реакции до 1:2. То есть на образование одной молекулы ИНР расходуется две молекулы оксида азота [56]. Заметим, что оксид азота взаимодействует с кислородом в тримолекулярной реакции (1.6) с образованием диоксида азота. Вклад этой реакции по сравнению с реакцией взаимодействия N0 и ННР, при миллимолярных концентрациях ННР и в стандартных условиях незначителен [56]. Стоит отметить, что реакции (1.3) и (1.4), очевидно, обратимы. Однако вследствие быстрого гидролиза получающихся высших оксидов азота это равновесие сильно смещено влево, поэтому обратный процесс не оказывает существенного влияния на кинетику реакций в целом.
Применение ННР для определения скорости генерации N0 методом ЭПР в биологических образцах затруднено по причине восстановления нитронилнитроксильных радикалов до гидроксиламинов, и, вследствие этого, потерей ими парамагнитных свойств и активности по отношению к N0 [72, 73]. Чтобы защитить радикалы от восстановления ННР помещают в липидную плёнку (липосомы), что не препятствует проникновению к ним небольших гидрофобных молекул N0. Эта липидная плёнка приготовляется либо в виде многослойных, либо в виде однослойных бислоёв [74]. В первом случае гидрофобный радикал растворён в липидной фазе многослойных бислоёв. Во втором случае используется водорастворимый положительно заряженный ННР, который находится в водной фазе внутри липосом и не выходит наружу из внутреннего объёма. Чувствительность метода составляет 1мкМ N0 при измерении абсолютных концентраций или 0,3 нМ/с при измерении скоростей генерации N0 за время эксперимента 1 час и объеме образца 0,2 мл [68].
Недавно был опубликован оригинальный подход для измерения скорости генерации оксида азота гладким эпителием трахей морских свинок с использованием ННР, меченных молекулой флгоорофора (пирен). Комбинация ННР - специфической ловушки на оксид азота - и молекулы флюорофора позволило увеличить чувствительность определения N0 по сравнению с методом ЭПР на два порядка. Чтобы избежать восстановления ННР в тканях, образцы были предипкубированы в присутствии радикала пиперидинового ряда в течение нескольких минут, что позволило с успехом использовать специфичность ННР к оксиду азота [75].
Сообщалось, что ННР обладают физиологической активностью как антагонисты оксида азота в биологических системах. Было показано, что ННР понижают уровень оксида азота при внутривенном введении в организм крыс после эндотокеннового шока (метод стимуляции синтеза N0 в организме) и при этом превращаются в ИНР [73]. Однако механизм действия ННР не ясен в силу того, что они быстро восстанавливаются в биологических средах (время полужизни порядка нескольких секунд) и теряют реакционную способность по отношению к N0 [72]. Исследованию механизма реакции оксида азота с ННР в биологических (восстановительных) средах посвящена одна из глав данной работы.
Нитроксильныс радикалы проявляют свойства как одноэлектронных восстановителей, так и одноэлектронных окислителей (см. схему 1.4), образуя оксоаммониевый катион и анион гидрокс ил амина, соответственно.
Ннтроксильные радикалы не проявляют тенденцию к спариванию спина и не диспропорционируют в органических растворителях. Однако в присутствии кислот нитроксиды обратимо диспропорционируют в результате протонирования нитроксильной части молекулы. Способность к диспропорционированию нитроксильных радикалов зависит от многих факторов: силы кислоты, наличия более основных функциональных групп в радикале, основности нитроксильной группы.
Схема 1.5. Общий механизм диспропорционирования нитроксильных радикалов в водных растворах в присутствии сильных кислот [27]. Общий механизм диспропорционирования нитроксильных радикалов представлен в схеме 1.5. Электрохимическое окисление нитроксидов.
Как в органических растворителях, так и в водных растворах нитроксиды могут быть окислены в соответствующие оксоаммониевыс катионы. Процесс электрохимического окисления нитроксидов (пиперидинового и иирролидинового типов) характеризуется кривой вольтамперограммы обратимого типа с потенциалом полуволны в районе от 600 до 800 мВ (относительно хлор-серебря иного электрода с насыщенным раствором КО), в зависимости от типа радикала, заместителей в гетерокцикле и используемого растворителя [76, 77]. Окисление нитроксидов пиперидинового и пирролидинового рядов при переходе из кислых в щелочные растворы становится необратимым вследствие последующей химической реакции. Предполагается, что это реакция оксоаммониевого катиона с ионом гидроксила с последующим разрывом цикла [76, 77]. Константа скорости реакции лежит в диапазоне (2-4)-10-3 с"1 для всех нитроксидов этого типа, за исключением TEMPAMINE (NHb группа в четвертом положении пиперидинового кольца), для которого константа скорости в двадцать раз выше [76]. Заметим, что потенциал полуволны окисления нитроксидов на электроде не зависит от рН раствора [77].
Было показано, что оксоаммониевые катионы нитроксильных радикалов пирролидинового типа в водных растворах превращаются с течением времени (порядка нескольких часов) обратно в нитроксиды, что объясняется автовосстановлением этих соединений в водных растворах [77]. Процесс электрохимического окисления — автовосстановления нитроксильных радикалов может быть повторён несколько раз для радикалов пирролидинового типа без заметного разложения этих соединений [77]. Электрохимическое восстановление нитроксидов. Электрохимическое восстановление, также как и окисление, нитроксильных радикалов в водных растворах хорошо изучено в основном для нитроксидов пиперидинового и пирролидинового типов.
Процесс электрохимического восстановления нитроксильных радикалов (пиперидинового и пирролидинового типов) характеризуется кривой вольтамперограммы необратимого или квазиобратимого типа с потенциалами полуволны восстановления от -170 до -422 мВ (относительно хлор-серебрянного электрода с насыщенным раствором КС1, рН 6,8) в зависимости от типа радикала, заместителей в гетерокцикле, используемого растворителя [76]. Механизм восстановления HP на электроде не полностью ясен. Так в одной из пионерских работ по изучению восстановления HP на ртутном капельном электроде в водных растворах различных буферов было показано, что процессу переноса электрона предшествует протонирование радикала как в кислых, так и в щелочных средах [78]. Однако, другими авторами было показано, что процесс переноса электрона на молекулу радикала предшествует реакции протонирования [76].
Восстановление нитроксильных радикалов тполсодержащими соединениями in vitro (на примере глутатиона)
Тиолсодержащие соединения играют важную роль в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза в клетках и тканях [83]. Одним из важнейших тиолсодержащих соединений в организме является глутатион. ГЛ состоит из трёх аминокислот: цистеин (SH-содержащая аминокислота), глутаминовая кислота и глицин. Содержание глутатиона в организме млекопитающих велико и оценивается миллимолярными концентрациями. Таким образом, глутатион является основным соединением, поддерживающим восстановительный потенциал (статус) среды живых +c,+H Схема 1.11. Окислительно-восстановительные реакции тиолов на примере глутатиона [103, 104]. Примечание: GSH и 05 -протонированнаяи депротонированная форма глутатиона, соответственно.
Глутатион (как и цистеин) - двухэлектро іншії восстановитель. При физиологических (нейтральных, 7,0-7,5) рН тиоловые группы этих соединений протонированны (рКа = 9,2). При одноэлектронном окислении тиолов образуется высокореакционная частица, тиильныи радикал, которая, в свою очередь, может дисмутироваться, присоединять тиолы, кислород, окислять разнообразные соединения. При дисмутации тиильных радикалов образуется дисульфид - продукт двухэлектрошюго окисления тиолов (см. схему 1.1 1).
Низкомолекулярные тиолсодержащие соединения (глутатион и цистеин) не восстанавливают HP или эта скорость так мала, что не наблюдается сколько-нибудь значимого изменения интенсивности спектра ЭПР радикала в присутствии тиолов в течение нескольких часов [105, 106].
Однако исчезновение спектра ЭПР иитроксильных радикалов наблюдается в присутствии тиолов, если растворы содержат также примеси тяжёлых металов и кислород. В присутствие ионов тяжёлых металлов происходит каталитическое автоокисление тиолсодержащих соединений кислородом. Было показано, что основными продуктами реакции иитроксильных радикалов с тиолами в присутствии кислорода являются гидроксиламин и амин с одной стороны и дисульфид и сульфоновая кислота с другой стороны [107, 108].
Несмотря на всю многочисленность и многогранность химических и физических процессов, протекающих в биологических системах, в общем и целом все они направлены на поддержание так называемого гомеостаза, иными словами обеспечивают постоянство внутренней среды организмов. Главными параметрами биологических систем являются показатели кислотности (рН), осмотического давления, температуры и окислительно-восстановительного потенциала (окислительно-восстановительного статуса) среды. Нарушение или значительный сдвиг любого из этих параметров может приводить к необратимым изменениям в функционировании системы вплоть до гибели организма.
Заметим, что в течение всей жизни у нормально функционирующих и эволюционирующих клеток или организма в целом показатели рН, температуры или осмотического давления меняются мало [109]. Противоположная ситуация наблюдается с таким параметром как окислительно-восстановительный потенциал. В течение жизни клетки окислительно-восстановительный статус её среды изменяется от окислительного до восстановительного значения [ПО]. Это указывает на то, что окислительно-восстановительный потенциал регулирует направление химических реакций в организме, определяя количество и природу необходимых химических соединений в данный момент.
Одним из ярких примеров использования нитроксильных радикалов пирролидинового типа для оценки восстановительного статуса в опухолях является работа группы Куппусами [111]. Авторы при помощи ЭПР томографии смогли визуализировать скорость восстановления нитроксильного радикала пирролидинового типа (3-карбомоил-2,2,5,5-тетраметилпирролидин-Ы-оксид) в опухолях крыс. Были получены изображения опухолей крыс, для каждой точки которых была найдена константа скорости реакции восстановления нитроксильного радикала (см. рис. 1.4). В данной статье показано, что константа скорости восстановления нитроксильного радикала в опухолях, в которых остановлен синтез глутатиона, гораздо ниже, чем в опухолях, в которых ГЛ синтезируется.
Нитроксильные радикалы могут не только восстанавливаться, но и окисляться в биологических системах. Это свойство питроксильных радикалов успешно используют для оценки степени окислительного стресса при различных патологиях.
Интересным примером такого применения HP являются работы группы Утсуми. Авторы этих статей показали, что падение амплитуды сигнала спектра ЭПР нитроксильного радикала в организме крыс связано с окислительными процессами. Например, было показано, что скорость снижения концентрации радикала пирролидинового типа (AMC-PROXYL) возрастает в крысах с индуцированным
В другой работе этой же группы учёных было показано, что внутривенное введение крысам ионов железа (II) приводит к усилению окислительного стресса, что ускоряет гибель нитроксильного радикала (см. рис. 1.6) [113].
В некоторых случаях для определения окислительно-восстановительного статуса среды в биологических системах используются гидроксиламины (восстановленная форма HP), которые неспецифически окисляются в нитроксильные радикалы. Такой окисляющей частицей может служить супероксидный радикал, гидроксильный радикал и т.д. Замечательным примером исследования изменения окислительно-восстановительного статуса в мозге крыс после эпилептического шока (окислительного стресса) является работа группы Камада и др. [114].
Авторы показали, что при использовании ацилзамещённого аналога гидроксиламина HP пирролидинового ряда можно оценивать степень окислительного стресса в различных участках головного мозга крысы после эпилепсии (см. рис. 1.7). Так как нитроксильная группа защищена ацильной группой, данное соединение не окисляется. Однако при попадании его внутрь клетки, ацильная группа отщепляется эстеразами. Получившийся гидроксиламин окисляется до нитроксильного радикала, и его появление можно регистрировать методом ЭПР. Авторам данной работы удалось, несмотря на низкую чувствительность L-диапазона ЭПР спектрометра, визуализировать скорость генерации HP (скорость окислительных процессов) в каждой точке головного мозга. Таким образом, авторы смогли определить локализацию участка мозга, подвергшегося наибольшему окислительному стрессу вследствие эпилептического шока.
Окисление гндроксиламинов ИР дегидроаскорбиновой кислотой
Если предположенная нами схема верпа, то добавление различных концентраций гидроксиламина в реакционную смесь в самом начале реакции должно не только изменять квазистационарное значение концентрации HP, но и приводить к изменению скорости восстановления нитроксилыюго радикала в начале кинетической кривой.
На рисунке 2.3.Б приведены кинетические кривые восстановления HP 19 в присутствии избытка аскорбиновой кислоты и различных концентраций соответствующего гидроксиламина 19Г. Увеличение концентрации гидроксиламина приводит к снижению начальной скорости восстановления HP и увеличению квазистационарной концентрации нитроксильного радикала.
На рисунке 2.3.А приведены кинетические кривые восстановления HP 16 в присутствии избытка аскорбиновой кислоты и различных концентраций соответствующего гидроксиламина 16Г, Таким образом, можно видеть, что обратимость реакции восстановления ИР аскорбиновой кислотой наблюдается не только для отдельно взятого радикала пирролидинового типа, но и для одного из радикалов имидазолинового типа. Отсюда можно сделать предположение, что данный процесс не обусловлен особенностями отдельно взятой реакции, а связан с окислительно-восстановительными свойствами электрохимических пар нитроксильный радикал - гидроксиламин и аскорбиновая кислота - продукт окисления АК. 0.12-1
Кинетические кривые восстановления ннтроксильных радикалов 16 (А) и 19 (Б) аскорбиновой кислотой (50 мМ) в присутствии различных концентраций соответствующих гидроксиламинов 16Г и 19Г в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,6, ДТПА 0,1 мМ. Начальные концентрации радикалов 19 и 16 — I мМ и ОД мМ, соответственно. Концентрации гидроксиламинов 0, 2, 5 и 10 мМ для 19Г и 0, 0,1 и 0,5 мМ для 16Г снизу вверх, соответственно. Примечание: примесь радикальной формы в гидроксиламине 16Г составляла 7%, что и привело к повышению начальной концентрации радикала. Для соединения 19Г примесь радикальной формы составляла менее чем 0,1%. Кинетические кривые показаны кружочками, для рисунка Б линиями представлены аппроксимации кинетических данных согласно предложенной в работе кинетической схеме (см, 2,1.4). На рисунке 2.4 приведены кинетические кривые восстановления нитроксильных радикалов 15 и 19 в присутствии различных концентраций аскорбиновой кислоты. Ясно видно, что начальная скорость восстановления HP возрастает с увеличением концентрации аскорбиновой кислоты, а квазистационарный уровень нитроксильного радикала понижается. Причём как начальная скорость восстановления, так и уровень квазистационарной концентрации HP зависит от типа радикала.
Таким образом, аскорбиновая кислота восстанавливает нитроксильные радикалы, причём увеличение концентрации АК повышает скорость восстановления радикала и понижает его квазистационарную концентрацию на равновесном участке кривой. И обратно, повышение концентрации гидроксиламина - продукта восстановления нитроксильного радикала - уменьшает скорость восстановления HP и повышает его квазистационарную концентрацию. В данной системе происходит не только процесс восстановления радикала в гидроксиламин аскорбиновой кислотой, но и процесс окисления гидроксиламина в радикал.
Какая же частица может исполнять роль окислителя? Как было сказано в Главе 1, аскорбиновая кислота окисляется сначала в радикал аскорбата (продукт одноэлектронного окисления), а затем в дегидроаскорбшювую кислоту (продукт двухэлектронного окисления). Обе эти частицы могут играть роль окислителя в системе. Начнём проверку гипотезы с радикала аскорбата.
Кривые восстановления іїитроксшіьпого радикала 16 (50 мкМ) аскорбиновой кислотой (1 мМ) в присутствии (о) и в отсутвие () аскорбат оксидазы (0,03 ед/мл).
Как было уже упомянуто в литературном обзоре, радикал аскорбата неустойчивая частица, которая быстро дисмутирует на аскорбиновую и дегидроаскорбиновуго кислоты. Генерацию радикала аскорбата проводили с использованием ферментативной реакции окисления АК в присутствии кислорода, катализируемой аскорбат оксидазои. При экспериментально используемых условиях скорость генерации АР постоянна в течении более, чем 10 минут [118]. Так как радикал аскорбата парамагнитная частица, то он обладает характерным спектром ЭПР, что позволяет оценить его равновесную концентрацию в растворе (см. 2.1.4).
На рисунке 2.5 приведены кинетические кривые восстановления радикала 16 в присутствии и в отсутствии аскорбат оксидазы. Как можно видеть, скорость восстановления в присутствии аскорбат оксидазы значительно замедляется. Это снижение скорости восстановления не связано с выводом аскорбиновой кислоты из системы вследствие ферментативной реакции, так как известно, что при данных условиях происходит менее, чем 10% истощение АК за 10 минут [118]. Поэтому замедление процесса восстановления может быть объяснено только повышением стационарной концентрации АР в растворе.
Время, мин Рисунок 2.6. Кинетические кривые окисления гидроксиламина 19Г (І мМ) в присутствии аскорбиновой кислоты и различных концентраций аскорбатоксидазы (0, 0,01, 0,02 и 0,03 ед/мл, снизу вверх). Линиями представлены аппроксимации кинетических данных согласно предложенной в работе кинетической схеме (см. 2.1.4).
На рисунке 2.6 представлены кинетические кривые окисления гидроксиламина HP 19Г радикалом аскорбата. Как видно, увеличение количества аскорбат оксидазы повышает скорость окисления гидроксиламина (вследствие увеличения стационарной концентрации радикала аскорбата). Кроме того, было показано, что увеличение концентрации гидроксиламина также повышает скорость генерации нитроксильного радикала.
Изучение реакции фтор содержащих нитроиилнитроксильных радикалов с N0 в восстановительной среде методом F ЯМР и ЭПР спектроскопии
Перейдём к детальному рассмотрению предложенной схемы реакций. Из экспериментальных данных видно, что прямая реакция I протекает в данной системе. Доказательство этого факта мы можем видеть из эксперимента па рисунке 2.3. Скорость реакции зависит от концентрации аскорбиновой кислоты и увеличивается с повышением её концентрации.
Наличие обратной реакции I было показано в эксперименте окисления ГАИ радикалом аскорбата (рис.2.6). Кроме того, скорость восстановления нитроксильного радикала в присутствии гидроксиламина уменьшается с увеличением концентрации ГАИ (рис 2.3). С другой стороны, увеличение стационарной концентрации радикала аскорбата также понижает скорость восстановления нитроксильного радикала (рис. 2.5).
В экспериментах не было показано существование прямой реакции П, однако такая реакция описана в литературе для радикалов пиперидинового ряда [89], что позволило принять её к рассмотрению. Реакции III и IV схемы также взяты из литературных источников [79, 87,119].
Наличие обратной реакции II экспериментально доказано (см. рис. 2.7). На протекание реакции V предположительно указывают данные, приведённые на рисунке 2.8.
Отметим, что реакция диспропорционирования нитроксильных радикалов (см. 1.3) не учитывалась при моделировании полученных данных. Очевидно, что этот процесс вносит пренебрежительно малый вклад, вследствие очень низкой константы протонирования нитроксильного фрагмента (для радикалов пиперидинового типа она составляет -5,5±1,0 единиц [27]). Тем более, диспропорционирование имидазолиновых и имидазолидиновых радикалов под действием ионов водорода происходит ещё медленнее, чем для радикалов пиперидинового типа, вследствие наличия более основных (чем нитроксил) групп в гстероцикле. Так, радикалы 3-имидазолинового типа устойчивы в 0,1 N серной кислоте более 220 часов [27].
Математическое моделирование кинетических кривых восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой.
Математическое моделирование полученных кинетических данных было проведено с использованием математической среды MathCad. Для построения теоретических кинетических кривых записьшшгись дифференциальные уравнения, отображающие вышеприведённые реакционные уравнения Константы скоростей реакций подбирались эмпирически, путём сравнения экспериментальных кинетических кривых с результатами математического моделирования. Для этого в дифференциальные уравнения вводились начальные условия, состоящие из начальных концентраций реагентов и константы скорости дисмутации радикала аскорбата (реакция III, константа kj). Эта реакция хорошо изучена для водных буферных растворов, её значение вычислялось исходя из данных приведённых в литературе [79], принимая во внимание значение рН, концентрацию буфера и ионную силу раствора при котором проводился эксперимент.
Отметим также, что скорость реакции V мала по сравнению со скоростями всех остальных реакций, и эта реакция не принималась во внимание для моделирования всех экспериментов, кроме последнего (рис. 2,8). Расчитанные константы скоростей реакций для радикалов 15-1.9 приведены в таблице 2.1.
Перейдём к анализу получившихся значений констант скоростей реакций. На первой части кинетической кривой происходит быстрое восстановление HP. В выше приведённых экспериментах эта часть кривой отсутствует для кинетических кривых с высокой концентрацией аскорбиновой кислоты в силу экспериментальных трудностей, связанных с перемещением приготовленного образца в резонатор спектрометра ЭПР. Однако, как будет показано ниже (2.2), эта часть кривой хорошо описывается кривой экспоненциального вида. То есть на этом участке кинетической кривой восстановления HP преобладает вклад прямой реакции Обратная реакция I была обнаружена нами впервые. В таблице 2.1 приведены константы скорости этой реакции для различных нитроксилъных радикалов, вычисленные из аппроксимации их кинетических кривых восстановления (см. рис, 2.4). Для радикала 19 константа k_i была также получена из экспериментов по окислению гидроксиламина 19Г радикалом аскорбата, генерируемого в системе аскорбат/аскорбат оксидаза (см. рис. 2.6). Заметим, что значения этой константы, найденные разным способом, совпадают (для сравнения см. рис 2.6 и таблицу 2.1).
Реакция восстановления HP радикалом аскорбата не оказывает значительного влияния на вид кинетической кривой. Поэтому в таблице 2.1 для всех радикалов (кроме 19) приведены оценочные значения констант прямой реакции П. Для радикала 19 вид кинетических кривых восстановления HP в присутствии соответствующего гидроксиламина сильно зависил от значений констант реакций II восстановления HP радикалом аскорбата, что и позволило точно вычислить эту константу (см. рис. 2.3.Б).
Константа обратной реакции II, окисление гидроксиламина дегидроаскорбиновой кислотой, была вычислена нз аппроксимации кинетических кривых окисления гидроксиламина радикала 19Г ДГА (см. рис. 2.7), для радикалов 15 и 18 приведены оценочные значения. Однако оказалось, что в восстановлении радикала 16 эта реакция играет большую роль, значение этой константы приведено в таблице 2.1. Заметим, что для наиболее неустойчивого к восстановлению АК радикала 17, влияние реакций стадии II на вид кинетической кривой вообще не было обнаружено.
Скорости реакций III и IV зависят от параметров среды (кислотность, ионная сила, буферная ёмкость). Из таблицы 2.1 видно, что для использованных констант скорости дисмутации радикала аскорбата (kj, вычисленных исходя из литературных данных), мы получаем достаточно близкие по значению константы скорости конпропорционирования АК и ДГА (k.j) и гидролиза ДГА () для экспериментов с различными начальными условиями. Более того, значения этих констант скоростей реакций, полученные нами в результате математического моделирования, близки к литературным данным, что подтверждает корректность проведённых вычислений.
