Введение к работе
з
Актуальность проблемы. В настоящее время исследователями активно обсуждаются возможные механизмы взаимодействия молекул гемоглобина (НЬ) человека и животных с оксидом азота (II) (N0). Это обусловлено тем, что в 90-е годы прошлого века существовало противоречие, связанное с открытием функции эндогенного N0 как сигнальной молекулы в сердечно-сосудистой системе. Несмотря на присуждение за это Нобелевской премии, многие ученые продолжали утверждать, что весь N0 в кровеносном русле должен быть мгновенно связан молекулами НЬ. Это инициировало интерес к изучению механизмов взаимодействия НЬ и N0. Благодаря усилиям многочисленных исследователей стало ясно, что биохимия и биофизика взаимодействия НЬ и N0 гораздо сложней и далеко не ограничивается лишь теми реакциями, в которых N0 необратимо связывается, теряя способность выполнять вазодилататорную функцию и лишая гемоглобин кисло-родтранспортных свойств. Однако, несмотря на большое число публикаций, посвященных взаимодействию НЬ с N0, отмечается противоречивость поступающих данных, сложность их интерпретации, а также необходимость постоянного пересмотра существующих гипотез. Это связано, прежде всего, с высокой реакционной способностью свободнорадикальной молекулы N0 и широкими возможностями атома азота для образования различных NO-производных. Кроме того, при исследовании взаимодействия N0 и НЬ зачастую не учитывается аллостери-ческая природа гембелка. В связи с этим дискуссионными остаются вопросы взаимодействия различных лигандных форм НЬ с N0 и физиологическая значимость продуктов их реакции, роль мембраносвязанного НЬ в метаболизме N0, функции NO-производных НЬ в различных физиологических и патологических процессах и другие проблемы. Активно обсуждается возможность участия S-нитрозогемоглобина в регуляции тонуса кровеносных сосудов, однако механизмы образования молекул SNO-Hb, диссоциации из них N0 и экспорта вазоактивных молекул из эритроцитов еще не ясны. Ответы на эти и иные вопросы можно получить при дополнительных исследованиях структурно-функциональных модификаций молекулы НЬ, индуцированных N0 различных концентраций.
Достаточно глубоко изученная и методически легко доступная молекула НЬ является удобной моделью для исследования влияния различных агентов на ферменты, поскольку ее простетическую группу - гем - можно рассматривать как аналог активного центра. Кроме того, на примере НЬ можно проследить роль отдельных компонентов (белкового и неорганического) в ходе ответной реакции на воздействие физико-химических факторов и их взаимовлияние друг на друга. С другой стороны, получение новых знаний по указанным проблемам важно для медицины и экологии, поскольку фармакологическое действие ряда нитрит- и нитратсодержащих препаратов основано на их способности генерировать NO, а повышенные концентрации N0 в атмосферном воздухе, помимо острых и хронических отравлений, способствуют развитию заболеваний дыхательной, сердечнососудистой, нервной и др. систем, особенно у лиц, постоянно подвергающихся воздействию оксидов азота (водители автотранспорта, работники химической промышленности, автостоянок, автозаправок и сотрудники ГИБДД). Транспорт такого экзогенного N0 также осуществляется гемоглобином.
Таким образом, исследование структурно-функциональных модификаций НЬ, индуцированных N0, имеет важное теоретическое и практическое значение.
Цель и задачи диссертационной работы. Основной целью данной работы явилось изучение структурно-функциональных модификаций НЬ, индуцированных N0.
Задачи работы предусматривали:
Исследование спектральных характеристик растворов гемнитрозилгемог-лобина в диапазоне длин волн 240-900 нм.
Отработку подхода, позволяющего анализировать тонкую структуру спектра растворов гемнитрозилгемоглобина в диапазоне поглощения энергии квантов апобелком.
Изучение влияния оксида азота (II) различных концентраций на спектральные и кислородсвязывающие характеристики окси-, дезокси- и метгемогло-бина.
Регистрацию и анализ спектров поглощения мембраносвязанного гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-600 нм.
Исследование спектральных и кислородсвязывающих характеристик молекул полигемоглобина с различным содержанием NO-производных гембелка.
Научная новизна. Зарегистрированы и проанализированы электронные спектры поглощения гемнитрозилгемоглобина (HbNO) в диапазоне длин волн 240-320 и 600-900 нм. В отношении HbNO применен разработанный нами метод анализа тонкой структуры спектров поглощения, позволивший идентифицировать 8 характеристических точек в его спектре в диапазоне длин волн 240-320 нм и установить вклад каждой из ароматических аминокислот в спектр поглощения НЬ.
Предложена гипотеза, согласно которой в НЬ связь между азотом проксимальных гистидинов апобелка (Ne HisF8) и железом гемов влияет на стабильность окислительно-восстановительного состояния Fe . Напряжение или разрыв этой связи, индуцированные лигандами, способствуют окислению Fez". На основании этой гипотезы предложен механизм реакции, согласно которому в частично нит-розилированном дезоксигемоглобине NO приводит к образованию a-Fe -NO-гемов с таким максимально низким сродством к лиганду, при котором возможна внутримолекулярная перегруппировка NO к SH-группам Cys/?93 с образованием S-нитрозогемоглобина (SNO-Hb).
Установлено, что присутствие в составе полигемоглобина (polyHb) NO-производных гембелка различных концентраций приводит к разнонаправленным изменениям кислородсвязывающих свойств образцов. На основании полученных экспериментальных данных предположено, что в качестве перспективного кисло-родтранспортного кровезаменителя с вазорегуляторной функцией можно использовать polyHb с низким содержанием NO-производных НЬ в составе ассоциата.
Получены данные о спектрах поглощения мембраносвязанного гемнитрозилгемоглобина человека в диапазоне длин волн 240-600 нм.
Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения работы сведения расширяют современные теоретические представления о модификации структуры и функций НЬ при взаимодействии с низкомолекулярными лигандами. Предложенный механизм образования SNO-Hb может стать практической основой для
5 разработки новых терапевтических методов лечения патологий, связанных с N0, а также методов регулирования кислородтранспортной функции НЬ.
Выводы, полученные при изучении структурно-функциональных свойств polyHb с различным числом NO-производных в составе образца, необходимо принимать во внимание при разработке кислородтранспортных кровезаменителей на основе химически модифицированного НЬ, не вызывающих гипертонию.
Данные, полученные при анализе электронных спектров поглощения HbNO в широком диапазоне длин волн (240-900 нм), могут быть использованы исследователями как справочные при изучении взаимодействия НЬ с N0.
Экспериментальные данные могут быть полезны при обсуждении вопросов экологической и медицинской биофизики, прогнозирования поведения белковых систем в условиях экологической нагрузки, в частности, при повышенном содержании оксидов азота в атмосфере, а также при использовании методов терапии, связанных с лекарственными препаратами - донорами оксида азота (II).
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета при проведении практических занятий, в ходе выполнения дипломных работ и магистерских диссертаций.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском конкурсном отборе инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); Федеральной школе-конференции «Инновационное малое предпринимательство в приоритетных направлениях науки и высоких технологий» (Москва, 2006); Международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего», проводимой в рамках международного форума Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе» (Санкт-Петербург, 2006); XX Съезде Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); 16-й Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); 1-ой Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Москва, 2009); 9-м Съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2010); научных сессиях Воронежского государственного университета (Воронеж, 2006, 2007, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
Оксид азота (II) является эффективным модулятором структурно-функциональных свойств окси-, дезокси- и метгемоглобина, проявляя как окислительно-восстановительные свойства, так и функции аллостерического эффектора.
В частично нитрозилированном гемоглобине (при концентрациях ли-ганда < Р50) NO модулирует связь железа гемов с азотом (Ne) проксимальных гис-тидинов апобелка таким образом, что становится возможной внутримолекулярная перегруппировка NO к SH-группам Cys/Ш.
Хромофорами гемнитрозилгемоглобина, ответственными за наличие идентифицированных нами максимумов поглощения в диапазоне длин волн 240-
6 320 нм являются: фенилаланин (256,5, 260,5, 265,0 и 268,5 нм), триптофан (273,0, 279,0 и 291,0 нм) и тирозин (285,0 нм).
4. Полигемоглобин с низким содержанием NO-производных гембелка, включающий, по-видимому, в качестве NO-производных в большей степени S-нитрозогемоглобин, рекомендован как образец для получения кровезаменителя, не вызывающего гипертонию.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из раздела «Введение», 5 глав, «Заключения» и «Выводов». Включает 179 страниц машинописного текста, 6 таблиц и 58 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 163 источников, из них 50 отечественных и 113 зарубежных.
