Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Морфология и функции миелинового нервного волокна 10
1.2. Роль липидного состава и упорядоченности жирнокислотных «хвостов» липидов мембран миелинового нервного волокна в функциональных процессах 13
1.2.1. Роль липидного состава миелинового нервного волокна 13
1.2.2. Упорядоченность жирнокислотных «хвостов» липидов мембраны и поверхностный заряд 14
1.2.3. Изменения фосфолипидного и жирнокислотного состава липидов миелинового нервного волокна при изменениях структуры белков аксо-глиального комплекса .15
1.3. Проведение серии потенциалов действия миелиновым нервным волокном 16
1.4. Роль холестерина в функционировании клеток 17
1.5. Механизм действия метил--циклодекстрина 21
1.6. Действие метил--циклодекстрина на клетки 28
1.7. Перераспределение и транспорт Са2+ в нервном волокне 29
1.7.1. Гомеостаз Са2+ в нервном волокне 29
1.7.2. Роль Са2+ в формировании поверхностного заряда нервной клетки 30
1.7.3. Роль Са2+ в регуляции упорядоченности жирнокислотных «хвостов» мембран .31
1.7.4. Роль Са2+ в процессах проведения возбуждения миелиновым нервным волокном 31
1.8. Демиелинизация миелинового нервного волокна. Действие лизолецитина на клетки 34
Глава 2. Цели и задачи исследования 35
Глава 3. Материалы и методы 36
3.1. Приготовление препаратов. Растворы и реактивы 36
3.1.1. Приготовление препаратов миелиновых нервных волокон 36
3.1.2. Культура гиппокампальных нейронов 37
3.2. Методы исследования 37
3.2.1. Метод экстраклеточной регистрации амплитуды потенциалов действия нервного волокна 37
3.2.2 Флуоресцентная микроскопия 38
3.2.3.1. Принцип метода и зонды 38
3.2.3.2. Протокол экспериментов 40
3.2.3.3. Обработка полученных данных 42
3.2.3 Лазерная интерференционная микроскопия 43
3.2.3.1. Принцип метода и зонды 43
3.2.3.2. Протокол экспериментов 54
3.2.3.3. Обработка полученных данных 57
3.2.3.4. Анализ динамики оптической разности хода 57
3.2.3.5. Протокол экспериментов 58
3.2.4 Спектроскопия комбинационного рассеяния нервного волокна 61
3.2.4.1. Принцип метода 61
3.2.4.2. КР-спектроскопия молекул каротиноидов 63
3.2.4.3. Протокол экспериментов 66
3.2.4.4. КР-спектроскопия молекул фосфолипидов 71
3.2.4.5. Протокол экспериментов 73
3.2.4.3. Обработка полученных данных 76
3.2.5 Метод электронного парамагнитного резонанса 77
3.2.5.1. Принцип метода и зонды 77
3.2.5.2. Протокол экспериментов 77
3.2.5.3. Обработка полученных данных 78
Глава 4. Результаты исследования и их обсуждение .81
4.1. Исследование состояния липидного бислоя мембран, цитоплазмы и
морфологии миелинового нервного волокна при выполнении функций 81
4.1.1. Исследование изменения упорядоченности жирнокислотных «хвостов» липидов мембран миелина и перехвата Ранвье при проведении серии потенциалов действия миелиновым нервным волокном 81
4.1.2. Перераспределение Са2+ при проведении серии потенциалов действия миелиновым нервным волокном 91
4.1.3. Исследование роли структуры миелина в функционировании нервного волокна 98
4.2. Исследование состояния липидных бислоев мембраны, цитоплазмы и
морфологии миелинового нервного волокна при инкубации с холестерин экстрагирующим агентом метил--циклодекстрином 101
4.2.1. Исследование изменений упорядоченности жирнокислотных «хвостов» липидного бислоя мембран перехвата Ранвье и миелина нервных волокон при действии метил--циклодекстрина 101
4.2.2. Исследование перераспределения ионов Са2+ в нервном волокне при действии метил--циклодекстрина 112
4.2.3. Исследование структуры миелина, цитоплазмы и морфологии миелинового нервного волокна при инкубации с холестерин-экстрагирующим агентом метил--циклодекстрином 117
4.2.4. Исследование динамики оптической разности хода лучей в различных участках миелинового нервного волокна при экстракции холестерина с помощью метил--циклодекстрина 120
4.2.5. Исследование морфологии и структуры цитоплазмы нейрона при инкубации с холестерин-экстрагирующим агентом метил--циклодекстрином 121
4.2.6. Исследование динамики оптической разности хода лучей в различных участках нейрона при инкубации с холестерин-экстрагирующим агентом метил--циклодекстрином 123
4.3. Изучение электрофизиологических свойств миелиновых нервных волокон при экстракции холестерина 124
4.3.1. Потенциал действия миелиновых нервных волокон при инкубации с метил--циклодекстрином 124
4.3.2. Упорядоченность жирнокислотных «хвостов» липидных бислоев мембран миелиновых нервных волокон при электрической стимуляции на фоне инкубации с метил--циклодекстрином 125
4.3.3. Изучение перераспределения ионов Са2+ в нервном волокне при проведении возбуждения на фоне инкубации с метил--циклодекстрина 128
4.4. Изменение свойств мембраны миелинового нервного волокна при демиелинизации с помощью лизоформ. 137
4.4.1. Исследование упорядоченности жирнокислотных «хвостов» липидных бислоев мембран перехвата Ранвье и миелина нервных волокон при действии лизолецитина. 137
4.4.2. Исследование распределения ионов Са2+ в нервном волокне при инкубации с лизолецитином 139
4.4.3. Изучение морфологии и структуры цитоплазмы миелинового нервного волокна при инкубации с лизолецитином 143
4.4.4. Исследование потенциала действия миелиновых нервных волокон при инкубации с лизолецитином 143
Заключение .147
Выводы 154
Список литературы .156
- Упорядоченность жирнокислотных «хвостов» липидов мембраны и поверхностный заряд
- Культура гиппокампальных нейронов
- Метод электронного парамагнитного резонанса
- Исследование динамики оптической разности хода лучей в различных участках миелинового нервного волокна при экстракции холестерина с помощью метил--циклодекстрина
Упорядоченность жирнокислотных «хвостов» липидов мембраны и поверхностный заряд
Для нашей работы особенно важна роль Са2+ в формировании поверхностного заряда на экстраклеточной и цитоплазматической поверхности мембраны клетки, его участие в процессах возбуждения МНВ (изменение активности К+- и других каналов и возможность осуществлять регуляцию упорядоченности ЖК).
Концентрация ионов Са2+ снаружи клетки примерно 10-3 М, а в цитоплазме 10-7 М. Концентрация ионов Са2+ в нервном волокне может изменяться во время электрической активности, под действием различных веществ, при повреждении и др. В норме она быстро возвращается к нормальному уровню с помощью трансмембранного транспорта (Са2+-каналы, кальциевые насосы, кальциевые обменники) или связыванием Са2+ с внутриклеточными депо. Связывание ионов Са2+ осуществляется например специальными белками цитоплазмы (кальмодулин, парвальбумин, кальциунеурин и др.) или Са2+-связывающими клеточными органеллами. Молекулы АТФ также способны связывать значительное количество ионов Са2+. Однако основная часть cвязанного Са2+ связана с плазматическими мембранами клетки, митохондриями и ЭПР [223].
Известно, что головки липидов, образующих плазматическую мембрану имеют заряды, в основном отрицательные (фосфо-, гликолипиды и гликопротеины). Заряды в мембране распределены не равномерно. Можно утверждать, что вблизи Na+- и K+- каналов сосредоточены отрицательные фиксированные заряды [224]. Мембранные заряды удерживают вблизи мембраны ионную оболочку, в т.ч. ионы Са2+, частично нейтрализующие отрицательный заряд. Высокий уровень наружной концентрации Са2+ уменьшает общий наружный отрицательный заряд, разность потенциалов на мембране, действующая на мембранные белки увеличивается. Таким образом могут например, осуществляться конформационные изменения ионных каналов и их функциональности при проведении СПД в зависимости от уровня Са2+. В МНВ наиболее богаты Са2+ компактные слои миелина [76]. Поверхностный заряд мембраны может оказывать влияние на связывание и активность заряженных веществ, действие которых будет зависеть от [Са2+].
Роль Са2+ в регуляции упорядоченности жирнокислотных «хвостов» липидов мембран В некоторых работах показано, что при обработке липидных мембран раствором ионов Са2+ наблюдается увеличение упорядоченности ЖК хвостов липидов мембраны [225]. Механизм действия – связывание ионов Са2+ с отрицательно заряженными группами фосфатов и др полярных головок молекул липидов. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ также может увеличивать упорядоченность липидов мембран [226]. Предполагается, что при этом ионы напрямую связываются с внутренней стороной мембраны.
Са2+ принимает активное участие в процессах проведения возбуждения МНВ. Показано, что при деполяризации плазматической мембраны открываются потенциал-зависимые Са2+-каналы и возникает входящий Са2+-ток. Этот ток (вместе с Na+ током) усиливает деполяризацию мембраны. Для аксолеммы проницаемость ионов Са2+, меньше проницаемости ионов Na+, поэтому этой величиной пренебрегают при анализе ПД. Однако, входящий Са2+-ток может играть роль в энергетических процессах при проведении возбуждения [236]. Кроме того, показано стабилизирующее влияние концентрации ионов внеклеточного Са2+ на потенциал покоя. Уменьшение внеклеточной концентрации ионов Са2+ способствует генерированию ПД во время деполяризации, а увеличение – наоборот. Проницаемость плазматической мембраны для Na+ также зависит от уровня внеклеточной концентрации ионов Са2+. [227]
Са2+ управляет работой Са2+ -зависимых калиевых каналов. Во время проведения СПД поступающий внутрь Са2+ активирует данные каналы и вызывает увеличение выхода ионов К+. При этом усиливается реполяризация, и могут прекращаться разряды импульсов [227].
Са2+ влияет на изменение формы волокна, а также объема и продольного движения аксолеммы во время ПД. При понижении концентрации ионов Са2+ в наружной среде удлиняется ПР, увеличивается пространсто между паранодальными петлями, и периаксональное пространство [228]. Такие изменения морфологии могут быть связаны с регуляцией ионами Са2+ степени связывания Е-кадгеринов, белков, участвующих в соединении слоев миелина в паранодальных петлях и насечках миелина. Е-кадгерин связан с актиновым цитоскелетом и изменения его конформации могут передаваться внутрь клетки [229].
При проведении ПД по нервному волокну распространяется волна деформации (продольной и поперечной), сопровождающаяся набуханием возбужденного участка мембраны. Предполагается, что Са2+ в данном процессе задействован в движении мембран и примембранных структур [75], т.к. от его концентрации (внутри- и экстраклеточной) зависит величина деформации аксолеммы. Возможно изменение концентрации ионов Са2+ приводит к изменению осмотического давления, создаваемого ионами внутри и снаружи коллоидного геля клеточных полимеров (это давление изменяется при изменении концентрации различных ионов), вследствие этого происходит расширение или сжатие этих гелей, что и приводит к движению цитоплазмы аксона.
Культура гиппокампальных нейронов
При помощи зонда осуществляли разрушение спинного и головного мозга лягушки. Затем отделяли пояс задних конечностей, удаляли кожный покров и уростиль и разделяли хрящевые соединения костей таза. Привязывали смоченную в растворе Рингера лигатуру к проксимальному концу седалищного нерва. С помощью пинцета и ножниц отделяли седалищный нерв от окружающих тканей и помещали в раствор Рингера на 20 мин. Для некоторых экспериментов отдельные волокна отделяли от общего ствола седалищного нерва с помощью иголок и маленьких ножниц.
В работе использовалась первичная культура гиппокампальных нейронов, которые выделялись из мозга 1 – 3 дневных крысят [235] и переносились на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином (10 мг/мл). Среда в которой содержали культуру – среда Б (NBM), содержащая 2% Supplement B 27 и 0.5 мМ L-глютамина. Рост глиальных клеток подавлялся арабинозидом (ARAC, 10-5М на сутки 3-4 дня).
Экстраклеточный потенциал действия (ПД) миелинового нервного волокна регистрировали при помощи биполярного внеклеточного отведения [84, 236]. Выделенное нервное волокно размещали в специальной камере из пенопласта, заполненной средой А. Стимуляцию волокна осуществляли прямоугольными импульсами переменного электрического тока с помощью электростимулятора ЭСЛ-1 (частота 50 Гц, длительность импульса – 0.3мс, амплитуда 1.0 – 1,2В).
В контрольном эксперименте регистрация ПД производилась 60 – 70мин. Для регистрации изменений амплитуды ПД при действии МБЦ или лизолецитина, соответствующий раствор веществ вносили через 1 мин после начала стимуляции.
ПД записывали на ПК, используя программу OriginPro7.5, находили значение амплитуды ПД в определенные моменты времени (каждые 10 мин после 1 мин стимуляции), и строили графики зависимости амплитуды ПД от времени. Результаты нормировали на величину амплитуды ПД в нулевой момент времени (1 мин стимуляции). Для выбранных моментов времени (каждые 10 мин после 1 мин стимуляции) находили средние значения величины амплитуды для всех повторов эксперимента (повторы осуществлялись на разных нервных волокнах) и погрешность. Для выявления наличия различий между контролем и опытом использовали программу Statistica 6.0.
Флуоресцентные методы исследования клеток основаны на регистрации интенсивности флуоресценции зондов, изменяющих свои оптические свойства при взаимодействии с исследуемым объектом (мембраной или другой гидрофобной областью, ионами Са2+ H+ и др.). В данной работе с помощью зондовой флуоресцентной микроскопии исследовали изменение концентрации ионов свободного внутриклеточного Са2+, связанного на мембранах Са2+ и изменения разности потенциалов плазматической и митохондриальных мембран нерва.
В ходе эксперимента нервные волокна прикрепляли микроиголками к подложке из силгарда, и выдерживали в среде с флуоресцентными зондами: fluo-3AM, ХТЦ. 1-[2-Амино-5-(2,7-дихлоро-6-гидрокси-3-оксо-9-ксантенил) фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси) этан-N,N,N ,N -тетрауксусной кислоты, фентаацетоксиметиловый эфир (C51H50Cl2N2O23). Изменение концентрации ионов свободного внутриклеточного Са2+ определяли с помощью зонда fluo-3AM. Максимум поглощения этого зонда – 506 нм, максимум флуоресценции – 526нм. МНВ инкубировали с зондом в течение 10 минут, затем отмывали зонд. Fluo-3AM не связывает Са2+ в наружном растворе, но проникая в клетку гидролизируется эндогенными эстеразами с образованием продукта высокоафинного к ионам Са2+.
Изменение концентрации ионов мембран-связанного Са2+ исследовалили с помощью зонда ХТЦ. Препараты инкубировали с зондом 20 минут, затем отмывали зонд. Максимум поглощения зонда ХТЦ составляет 380 – 400 нм, максимум излучения 520 – 530 нм. Применение этого зонда для определения изменения концентрации мембранно-связанного Са2+ основано на его свойствах увеличивать интенсивность флуоресценции в 200 – 400 раз при связывании с ионом Са2+ в гидрофобной среде. Практически весь ХТЦ в присутствии Са2+ локализован в мембране. В растворе молекулы воды могут являться причиной тушения флуоресценции комплекса ХТЦ-Са2+, в мембране данные комплексы становятся недоступными молекулам воды и происходит увеличение квантового выхода флуоресценции. [237].
Исследования проводили с помощью люминесцентного микроскопа Люмам И-3 (ЛОМО). Флуоресценция возбуждалась галогеновой лампой накаливания КГМ 12–100. В работе использовалась фотометрическая насадка ФМЭЛ-1А с использованием интерференционных светофильтров с максимумом пропускания в области 520 нм. Сигнал от ФМЭЛ-1А передавался на вольтметр МЕТЕХ. Регистрация флуоресценции производилась с частотой 0,2 Гц. Запись результатов на компьютер осуществлялась при помощи программ METEX и dmmg (http://bitbucket.org/alexeybrazhe/dmmg/).
В некоторых экспериментах использовался флуориметрический микроскоп Axioplan2 (Zeiss). Флуоресценция возбуждалась ртутной лампой OSRAM HBO 50/AC. Для регистрации изображений использовалась камера Axio Cam MRc. Изображения снимались и сохранялись на компьютере с помощью программы Axio Vision 3.0 каждые 5 минут.
В контрольных экспериментах сигнал с окрашенного волокна (выбранного участка ПР или ИО) регистрировали в течение 60 мин с частотой 0.2 Гц (на Люмам И-3) или каждые 2 мин (на Axioplan2).
В экспериментах с МБЦ или лизолецитином после регистрации контрольного уровня интенсивности флуоресценции зонда (18 мин) в раствор образца добавляли МБЦ/лизолецитин и продолжали регистрировать интенсивность флуоресценции зонда еще 30– 40 мин. В экспериментрах с проведением СПД к подложке из силгарда прикреплялись электроды, на которых фиксировали нерв, один из концов, которого предварительно расщеплялся механическим способом (с помощью игл) на отдельные волокна. Препарат помещался под микроскоп так, чтобы можно было регистрировать сигнал от выбранного участка (ПР либо ИО) одиночного волокна и одновременно стимулировать весь нерв как описывалось в пункте 3.2.1. После регистрации исходного уровня интенсивности флуоресценции зонда (20 минут) включали электрический стимулятор и регистрировали изменения величины интенсивности флуоресценции зонда в течение 20 мин. Стимуляция проводилась с частотой 50 Гц, длительностью импульсов, 0.3 мс и амплитудой 1200 мВ. Через 20 мин стимуляция отключалась, а интенсивность флуоресценции зонда продолжала регистрироваться еще 10 – 25 мин.
В экспериментах с МБЦ и лизолецитином при проведении СПД нервные волокна, располагали на подложке с электродами как описано выше. После регистрации исходного уровня интенсивности флуоресценции зонда (18 мин) в покоящемся нервном волокне в раствор образца добавляли МБЦ/лизолецитин, регистрировали сигнал, включали электрический стимулятор в 20 мин от начала эксперимента и продолжали регистрировать интенсивность флуоресценции зонда в ПР и ИО в течение 40 мин.
Для определения роли потенциал-зависимых Са2+-каналов (в экспериментах с проведением СПД) были поставлены дополнительные опыты, в которых за 5 минут до включения электростимулятора добавлялся верапамил 2-(3,4-диметоксифенил)-5-{[2-(3,4-диметоксифенил)]-(метил)амино}-2-проп-2-улпентаненитрил (С27Н38N2O4), блокатор потенциал-зависимых Са2+ -каналов.
Метод электронного парамагнитного резонанса
Изменение упорядоченности жирнокислотных остатков молекул липидов (микровязкости) в мембране можно измерять непосредственно с помощью КР-спектроскории жирно-кислотных остатков (ЖК) фосфолипидов [249, 250]. Молекулы фосфолипидов также имеют характерный спектр КР, с тремя выраженными пиками 2845см-1, 2885см-1 и 2940см-1. Полоса 2845см-1 характеризует несимметричные колебания связи С-Н метиленовых групп жирной кислоты, полоса 2885см-1 – симметричные колебания этой же связи, а полоса 2940см-1 – симметричные колебания связи С-Н концевых метильных групп. Величина отношения интенсивностей полос 2940см-1 и 2885см-1 обратно пропорциональна упорядоченности ЖК в мембране [249, 250]. Фотография прибора представлена на рис 3.16, а характерный КР-спектр ФЛ МНВ в ИО и ПР представлен на рисунке 3.17.
Для регистрации спектров КР от нервного волокна использовали спектрометр “NTEGRA” (НТ-МДТ), монохроматическое возбуждение с длиной волны 532 нм, мощность возбуждающего лазера 290 мВт, спектральное разрешение не более 4 см-1. Рис 3.16. Фотография спектрометра “NTEGRA” (НТ-МДТ). 150
Типичные спектры комбинационного рассеяния фосфолипидов миелинового нервного волокна, 1 – миелин, 2 – перехват Ранвье. 3.2.4.5. Протокол экспериментов
В контрольных экспериментах одиночное нервное волокно помещали в специальную чашку Петри с тонким стеклянным дном, которую фиксировали в измерительном отсеке прибора, добиваясь такого расположения объекта, чтобы регистрировать сигнал с определенной области волокна (ПР или ИО) в течение 40 – 60 мин.
В экспериментах по исследованию воздействия температуры на упорядоченность ЖК-хвостов мембраны МНВ использовали специальную термокамеру (НТ-МДТ для спектрометра “NTEGRA”), что позволило увеличивать и поддерживать на нужном уровне температуру нервного волокна. После регистрации КР-спектра в ПР или ИО при контрольных условиях (температура 20С) камеру начинали медленно нагревать, продолжая регистрировать КР-спектры в моменты времени, когда температура объекта увеличивалась на 5С. Максимальная температура образца в эксперименте составила 40С. Время нагревания не превышало 40 мин.
В экспериментах с МБЦ после регистрации КР-спектров в контрольных условиях (0 мин) в ПР или ИО в раствор образца добавляли МБЦ и продолжали регистрировать КР-спектры каждые 5 – 10 мин в течение 40 мин.
В экспериментрах с проведением СПД использовали специальную подложку из парафильма и стекла с электродами, с помощью которых осуществляли электрическую стимуляцию МНВ. Один из концов нервного волокна предварительно механически расщеплялся на отдельные волокна. Волокно помещали в микроскоп и регистрировали КР с выбранного участка (ПР либо ИО) и одновременно стимулировали нерв как это описывалось в данной главе пункте 3.2.1. После регистрации спектра КР в контроле (0 мин), включали электростимулятор (в 5 мин) и продолжали регистрировать спектры каждые 5 мин (еще 20 мин). Затем стимуляцию отключали, а нервное волокно оставалось в покое 15 мин, после чего (в 40 мин) снимался еще один КР-спектр, чтобы определить восстанавливается ли значение
параметра КР после отключения электрической стимуляции. Стимуляция проводилась с частотой 50 Гц, длительностью импульсов, 0.3 мс и амплитудой 1200 мВ.
В опытах с МБЦ и проведением СПД нервные волокна, предварительно обработанные МБЦ (40 мин) и отмытые располагали на подложке с электродами как описано выше. После регистрации КР-спектров в контрольных условиях (0 мин) в покоящемся нервном волокне, включали электрический стимулятор (в 5 мин) и продолжали регистрировать спектры КР каждые 5 мин в течение 20 мин. Затем стимуляцию отключали и нервное волокно оставалось в покое 15 мин, после чего (в течение 40 мин) регистрировали еще один КР-спектр, чтобы выявить наличие процессов восстановления после прекращения проведения СПД. Спектры КР регистрировали в области ПР и ИО МНВ. Стимуляция проводилась с частотой 50 Гц, длительностью импульсов, 0.3 мс и амплитудой 1200 мВ. Данные записывались на ПК с помощью специального програмного обеспечения. 3.2.4.6. Обработка полученных данных
Данные экспортировались в программу OriginPro7.5. В OriginPro7.5 строились спектры КР липидов и каротиноидов, вычиталась базовая линия, определялись значения максимумов полос и находились отношения пиков, отражающих упорядоченность липидных ЖК-хвостов мембраны нервного волокна (1530 и 1160 см-1 для каротиноидов и 2940см-1 и 2885см-1 для липидов) в определенные моменты времени (c интервалом 5 – 15 мин). Далее строились графики зависимости соответствующих отношений от времени и нормировались на значение исследуемого отношения в 0 момент времени. По результатам серии аналогичных опытов получали среднее значение отношения интенсивностей соответствующих пиков в соответствующие значения времени и строили кривые с разбросами. Достоверность различий контроля и опыта оценивали с помощью Т-критерия, р 0,05 в программе Statistica 6.0.
Исследование динамики оптической разности хода лучей в различных участках миелинового нервного волокна при экстракции холестерина с помощью метил--циклодекстрина
Исследование изменений упорядоченности жирнокислотных «хвостов» липидных бислоев мембран в областях локализации каротиноидов миелинового нервного волокна при действии метил--циклодекстрина с использованием наночастиц серебра
Известно, что наночастицы серебра увеличивают интенсивность сигнала КР эритроцитов и, в связи с этим, используются для увеличения чувствительности метода. Для более глубокого изучения свойств УЖК БЛМ мембраны нервного волокна на основе КР, в данной серии экспериментов мы регистрировали спектры КР каротиноидов МНВ с добавлением наночастич серебра в различной концентрации - 5, 10, 20, 30 и 50%. Как известно, в основе увеличения КР сигнала наночастицами металла (золота, серебра) лежит явление поверхностного плазмонного резонанса. Эффект зависит от расстояния между наночастицей и тестируемой молекулой [260 - 263]. В наших экспериментах при добавлении наночастиц серебра к МНВ увеличения КР-сигнала каротиноидов не наблюдается (рис 4.14). Вероятно, в МНВ наночастицы серебра не могут подойти к молекулам каротиноидов на соответствующее расстояние, необходимое для появления плазмонного резонанса. Эти эксперименты показывают, что основная часть каротиноидов локализована в миелине, а наружный мезаксон ШК препятствует формированию оптимальных условий плазмонного резонанса и усилению Кр-каротиноидов.
Кинетика изменения интенсивности спектра комбинационного рассеяния каротиноидов миелинового нервного волокна при добавлении наночастиц серебра.
По оси ординат интенсивность пика 1524 см-1, отн. ед., по оси абсцисс время, мин. (среднее значение ±ошибка среднего). Наночастицы вносились в 5 мин. Исследование изменения упорядоченности жирнокислотных «хвостов» липидных бислоев мембран миелина и перехвата Ранвье при действии метил--циклодекстрина с помощью комбинационного рассеяния липидов
В данной серии экспериментов мы проводили исследование изменений УЖК липидов регистрируя непосредственно спектры КР жирнокислотных остатков липидов в области миелина и ПР. При инкубации нервного волокна с МБЦ УЖК БЛМ в миелине падает, а в области ПР практически не изменяется (рис 4.15, 4.16). Возможно, ПР и миелин различаются по уровню холестерина, и в ПР эффект действия МБЦ практически незаметен, либо область ПР недоступна для молекул МБЦ.
Отметим, что в отличие от результатов экспериментов, полученных с помощью КР-каротиноидов, изменения в спектре КР-липидов происходят примерно на 40 минуте после обработки нервного волокна МБЦ. Возможно, в мембранах миелина имеются участки или молекулы (белки в рафтах) более чувствительные к изменениям уровня холестерина, чем фосфолипиды БЛМ и изменение УЖК БЛМ молекулярного окружения каротиноидов, связанно именно с этими молекулами, а не с молекулами липидов. Вероятно, процесс осуществляется следующим образом: при добавлении МБЦ из мембран начинает постепенно экстрагироваться холестерин. Наличие сфигномиелина в рафтах, как известно, может препятствовать данному процессу, и холестерин может уходить не только из рафтов [25]. Экстракция холестерина из рафтов приводит к их разрушению. Молекулы из разрушенных рафтов попадают в окружающую мембрану с иной организацией, чем в рафтах, конформация и свойства этих молекул изменяются, а также постепенно изменяются и свойства самой мембраны, каротиноиды чувствуют изменение упорядоченности своего окружения возможно белков, тогда как изменение упорядоченности «хвостов» самих липидов происходит позднее.
Итак, при экстракции холестерина из МНВ показано, что уменьшение УЖК БЛМ происходит только в интернодальной области МНВ.
Кинетика изменений упорядоченности жирнокислотных хвостов липидов мембран миелина нервного волокна при экстракции холестерина. По оси ординат отношение пиков 2940 и 2885 см-1 спектра комбинационного рассеяния, отн. ед., по оси абсцисс время, мин. (среднее значение ±ошибка среднего). – достоверное различие (р 0,05) по сравнению с контролем (Т-критерий).
Кинетика изменений упорядоченности жирнокислотных хвостов липидов мембран перехвата Ранвье нервного волокна при экстракции холестерина.
По оси ординат отношение пиков 2940 и 2885 см-1 спектра комбинационного рассеяния, отн. ед., по оси абсцисс время, мин. (среднее значение ±ошибка среднего). – достоверное различие (р 0,05) по сравнению с контролем (Т-критерий). Исследование измениний упорядоченности жирнокислотных «хвостов» липидных бислоев мембран миелинового нервного волокна при действии метил--циклодекстрина с помощью электронного парамагнитного резонанса
В ряде исследований с помощью ЭПР было показано, что изменения УЖК БЛМ мембраны, происходящие в глубине бислоя или ближе к поверхности мембраны, могут происходить различным образом. Известно также, что при изменении температуры наблюдается корреляция между изменениями спектров КР и ЭПР спин-меток, локализованных в гидрофобной области мембран миелина [264].
В связи с этим, в данной серии экспериментов исследовали изменения УЖК БЛМ различных областей мембраны нервного волокна при действии МБЦ с помощью ЭПР-спектроскопии. Нами было показано, что экстракция холестерина из мембран приводит к уменьшению времени вращательной корреляции спинового зонда 16-ДС (рис. 4.17.), что соответствует разупорядочиванию липидных «хвостов» в глубине гидрофобной области бислоев мембран нервного волокна (2.2 нм), т.е. уменьшению УЖК БЛМ в глубине бислоев. По спектрам ЭПР спинового зонда 5-ДС удалось выявить уменьшение упорядоченности ЖК остатков фосфолипидов в составе мембраны нервного волокна при экстракции холестерина в области близкой к гидрофильным головкам липидов (0.6 нм) (рис. 4.18.).
Таким образом, при экстракции холестерина уменьшение УЖК БЛМ происходит в глубине гидрофобной области и в области близкой к головкам липидов бислоев мембран.
