Введение к работе
Актуальность проблемы. Тесное взаимодействие иммунной и нейроэндокринной систем осуществляется благодаря использованию общих сигнальных молекул и их рецепторов в качестве общего химического языка. р-Эндорфин - опиоидный нейропептид, является одной из таких молекул и способен регулировать основные функции организма, осуществляя тесное взаимодействие нервной, иммунной и эндокринной систем. Установлено, что молекула Р-эндорфина содержит три различных участка, ответственных за специфическое связывание с рецепторами. Концевые участки р-эндорфина отвечают за взаимодействие с и- и 8- опиоидными рецепторами (Li, 1976), а центральная часть - с неизвестным типом рецепторов Р-эндорфина (нечувствительными к специфическому блокатору опиоидных рецепторов налоксону) - неопиоидными рецепторами (Hazum et al., 1979). В настоящее время показано наличие неопиоидных рецепторов р-эндорфина в иммунной, нервной и эндокринной системах организма млекопитающих (Hazum et al., 1979; Наволоцкая и др., 2004; Ковалицкая и др., 2010; Nekrasova et al., 2010). Кроме того, известно, что Р-эндорфин способен синтезироваться тканями репродуктивной системы (Lim et al., 1983; Wahlstrom et al., 1985; Czaja et al., 1996; Okrasa et al., 2003). Несмотря на это, до сих пор остается неясным, существуют ли неопиоидные рецепторы р-эндорфина на ранних стадиях развития эмбрионов млекопитающих и если существуют, то какую роль они играют в доимплантационном развитии.
В репродуктивной системе также был обнаружен иммуноглобулин G (IgG), представляющий собой один из основных белков плазмы крови (Fahey, 1965; Oliphant et al., 1978; Parr et al., 1985). В отличие от других типов иммуноглобулинов (А, М и др.), иммуноглобулины класса G имеют относительно небольшой молекулярный вес (около 150 кДа) и поэтому могут проникать через плаценту от матери к плоду (Yasuhara et al., 2010). Предполагают, что таким образом обеспечивается пассивный иммунитет новорожденного ребенка к некоторым инфекционным заболеваниям (Awdeh et al., 1970; Rasheed et al., 1995; Maidji et al., 2006; Strunk et al., 2011;). Также было показано, что в жидкости яйцевода присутствуют протеазы, под действием которых IgG может расщепляться на короткие пептиды (Tauber et al., 1985; Gandolfi et al., 1995; Mugnier et al., 2009), и был обнаружен пептид, представляющий собой фрагмент 364-377 тяжелой цепи IgG (Julliard et al., 1980). Как оказалось, он имел 50% подобия с центральной частью
молекулы р-эндорфина (рис.1), и в последствии был назван иммунорфином (Zav'yalov et al., 1996).
Рисунок 1. Аминокислотная последовательность Р-эндорфина,
фрагмента тяжелой цепи IgG человека, иммунорфина, пентарфина и
циклопентарфина (жирным курсивом выделены совпадающие
аминокислоты).
Значение и функциональная роль этого пептида в репродуктивной системе в настоящее время не выявлены. Однако как было показано, пептид способен взаимодействовать только с неопиоидным рецептором р-эндорфина и для связывания достаточно последовательности VKGFY (рис.1) (Наволоцкая и др., 2004; Ковалицкая, 2010).
Таким образом, изучение с помощью Р-эндорфина и коротких фрагментов IgG ф-эндорфинподобных пептидов) роли неопиоидного рецептора Р-эндорфина в течении доимплантационного эмбриогенеза млекопитающих представляет научный и практический интерес. Для исследования неопиоидной рецепции на ранних эмбрионах мыши был синтезирован фрагмент 369-373 тяжелой цепи IgG - пентарфин и его циклическая форма -циклопентарфин (рис.1).
Цель работы
Целью настоящей работы является исследование неопиоидной рецепции р-эндорфина и фрагментов иммуноглобулина G в доимплантационном развитии эмбрионов мыши в условиях культивирования in vitro.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи исследования:
-
Изучить влияние Р-эндорфина, пентарфина и циклопентарфина на развитие 2-, 4-, и 8-клеточных эмбрионов мыши в условиях in vitro;
-
Определить пути передачи внутриклеточного сигнала при действии пентарфина и циклопентарфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы мыши;
-
Определить пути передачи внутриклеточного сигнала при действии р-эндорфина на 2- и 8-клеточные эмбрионы мыши;
-
Исследовать действие циклопентарфина на выживаемость 8-клеточных эмбрионов мыши при криоконсервации (витрификации);
-
Исследовать воздействие предварительной инкубации 8-клеточных эмбрионов мыши с циклопентарфином на их выживаемость при постимплантационном развитии.
Научная новизна работы. Результаты данной работы являются первым экспериментальным доказательством того, что у доимплантационных эмбрионов мыши присутствуют неопиоидные (не чувствительные к налоксону) рецепторы р-эндорфина. Показано, что Р-эндорфин и короткие фрагменты IgG 369-373 (Р-эндорфинподобные пептиды пентарфин и циклопентарфин) являются неспецифическими факторами роста ранних эмбрионов мыши и принимают непосредственное участие в доимплантационном развитии. Установлено, что стимулирующее действие гормона и синтетических пептидов на ранние эмбрионы мыши через неопиоидные рецепторы Р-эндорфина осуществляется при участии аденилатциклазной сигнальной системы. Исследуемые пептиды пентарфин и циклопентарфин имеют высокое сродство к неопиоидному рецептору р-эндорфина и поэтому любой из этих пептидов может быть использован в качестве специфического маркера для данного рецептора.
Практическая ценность результатов работы. Биологически-активные пептиды привлекают внимание ученых и фармакологов и активно используются в самых разных сферах медицины. Несомненными достоинствами Р-эндорфина и синтетических коротких фрагментов IgG при использовании их на практике являются эндогенное происхождение, отсутствие токсичности, простота расщепления молекул в организме и последующее
использование продуктов деградации - аминокислот в биохимических реакциях. Способность р-эндорфина и синтетических пептидов повышать жизнеспособность эмбрионов, улучшать их морфологическое состояние, снижать процент гибели ранних эмбрионов может найти применение как в экспериментальной эмбриологии (получение и сохранение редких видов животных, создание химер), так и в медицинской практике (технологии экстракорпорального оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида). Таким образом, проведенные исследования позволяют рекомендовать использование р-эндорфина и р-эндорфинподобных пептидов в качестве добавки в среды для культивирования ранних эмбрионов, что позволит оптимизировать условия культивирования in vitro и приблизить их к таковым in vivo.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007); на XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008); на XI Всероссийской конференции «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008); на международной конференции «Лазерно-информационные технологии в медицине, биологии и геоэкологии - 2009» (Абрау-Дюрсо, 2009); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2009); на международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2010» (Москва, 2010); на международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 2010); на XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); на «5* Congress of the world association of reproductive medicine WARM-2010» (Moscow, 2010).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 12 печатных работах, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, 1 - в сборнике и 9 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 127 страницах, иллюстрирован 29 рисунками и II таблицами. Список литературы содержит 173 цитируемых источника, из которых 13 на русском и 160 на иностранном языке.
