Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем фотобиологии и биофизики является выявление фундаментальных основ чувствительности организмов к оптическому излучению различных диапазонов и интенсивности, в том числе к повреждающему действию света. В зависимости от спектрального состава свет может индуцировать протекание прямых и/или сенсибилизированных деструктивных процессов. Высокая биологическая активность коротковолнового (УФС, 200-290 нм) и средневолнового (УФВ, 290-320 нм) ультрафиолета определяется прямым поглощением квантов излучения этих диапазонов важнейшими клеточными компонентами, в первую очередь молекулами ДНК. Повреждающее действие длинноволнового ультрафиолетового (УФА, 320-380 нм) и видимого (380-750 нм) света на живые организмы обусловлено протеканием сенсибилизированных, главным образом кислородзависимых фотодинамических реакций. При этом в качестве фотосенсибилизаторов могут выступать как эндогенные природные клеточные метаболиты (например, НАДН, флавины, порфирины), так и различные экзогенные красители, применяющиеся в косметике, пищевой и легкой промышленности, лекарственные препараты и др. Генерируемые фотосенсибилизаторами активные формы кислорода (АФК) инициируют окислительные деструктивные реакции в биомолекулах и биоструктурах [Halliwell and Gutteridge, 1984; Ере et al., 1993; Davies, 2004. Girotti and Kriska. 2004], а также опосредуют сигнальные пути стрессовых воздействий на клеточную стенку [Levin, 2005]. Кроме того, АФК могут влиять на экспрессию генов, включая защитные механизмы в ответ на окислительный стресс [Storz et al., 1990; Gasch et al., 2000; Ziegelhoffer and Donohue, 2009].
В фотодинамических реакциях, относящихся к процессам II типа, первичным является взаимодействие возбужденных молекул фотосенсибилизаторов с кислородом [Foote, 1991]. Наибольший вклад в этот тип фотоокислительных реакций вносит синглетный кислород ( 02), который образуется в результате фотофизической активации [Красновский мл., 2007] путем переноса энергии с триплетного возбужденного состояния фотосенсибилизатора на молекулярный кислород. Фото динамические реакции все шире применяются в медицинской практике: лежат в основе противоопухолевой фотодинамической терапии (ФДТ) [Dougherty et al., 1998], фотодинамического обеззараживания препаратов крови от вирусных контаминации [Wainwrigh, 1998]. В последние годы все большее внимание привлекают исследования по фотодинамической инактивации бактерий и грибов [Hamblin and Hasan, 2003], которые имеют выраженную практическую направленность. Это обусловлено ростом устойчивости патогенных микроорганизмов к традиционной химиотерапии и необходимостью разработки альтернативных способов их инактивации.
В отличие от противоопухолевой ФДТ, основанной преимущественно на использовании тетрапиррольных фотосенсибилизаторов (порфирины, хлорины, фталоцианины), в антимикробной ФДТ до недавнего времени основной упор делался на сравнительно низкомолекулярные красители - фенотиазины [Usacheva et al., 2001] и акридины [Wainwright et al., 1997]. Несмотря на то, что фенотиазины (метиленовый синий, толуидиновый синий) обладают широким спектром антимикробного действия, их применение в целях ФДТ имеет ряд недостатков. В первую очередь, это недостаточная активность в отношении бактерий и грибов и необходимость применения высоких (до 200 мкМ на моделях in vivo [Zolfaghari et al., 2009]) токсичных для животных концентраций. Одно из основных преимуществ антимикробной ФДТ перед антибиотикотерапией заключается в множественном характере окислительной деструкции микробных клеток-мишеней, что затрудняет выработку устойчивости к последующим циклам фотодинамических воздействий [Jori and Brown, 2004]. Однако, в отношении фенотиазинов это преимущество может быть поставлено под сомнение, поскольку мутанты бактерий с повышенным уровнем экспрессии белков-помп, обусловливающих множественную лекарственную резистентность, проявляют более высокую устойчивость к фотосенсибилизации фенотиазинами по сравнению с дикими штаммами [Tegos and Hamblin, 2006]. Применение акридинов может сдерживаться наличием у этой группы красителей мутагенных свойств [Gasc and Sicard, 1978]. В этой связи несомненный интерес представляет изучение антимикробной активности других типов фотосенсибилизаторов, в том числе на основе тетрапиррольных структур.
Эффективное применение красителей в медицинских целях невозможно без глубокого понимания механизмов фотосенсибилизации биологических объектов различного уровня организации. В этой области исследований существуют две основные группы проблем. Первая связана с изучением природы действующих фотосенсибилизаторов, механизмов их взаимодействия с клетками и субклеточными структурами; вторая - с исследованием фотоиндуцированных повреждений клеточных мишеней, приводящих к развитию сенсибилизированных поражений. Направленная доставка фотосенсибилизиторов к таким мишеням, например, к ядру раковой клетки [Sobolev, 2008], позволяет на порядки увеличить эффективность фото инактивации.
В фундаментальном аспекте одной из основных задач при изучении механизмов фотосенсибилизации бактерий является установление причин низкой чувствительности объектов, относящихся к грамотрицательным видам. Важнейшей структурой, отвечающей за общую устойчивость грамотрицательных бактерий к различным внешним агентам (антибиотикам, детергентам, красителям), является наружная мембрана, входящая в состав клеточной оболочки. Перспективным подходом к повышению чувствительности грамотрицательных бактерий является их обработка с помощью заряженных поликатионных структур. Под воздействием
поликатионов происходит высвобождение отрицательно заряженных
липополисахаридов наружной мембраны и ее дезинтеграция. Поликатионы могут
быть также использованы как наноносители фотосенсибилизаторов, повышающие
избирательность их действия за счет электростатического взаимодействия с
клеточной стенкой бактерий. В то же время и сами молекулы красителей могут
выступать в качестве носителей положительно заряженных групп, повышающих
эффективность их взаимодействия с бактериальной клеткой, и представляют
значительный интерес в качестве фотосенсибилизаторов для антимикробной
фотодинамической терапии. Однако практическое использование
фотосенсибилизаторов в этом направлении требует разработки систем скрининга красителей, изучения закономерностей проявления активности красителей в зависимости от знака заряда и количества заряженных заместителей в молекулах, определения спектров антимикробного действия.
Механизмы фотодинамической инактивации дрожжевых грибов изучены недостаточно, на ограниченном круге красителей. Мало внимания уделялось исследованию процессов взаимодействия красителей с клеточной стенкой и плазматической мембраной, целостность которых играет важнейшую роль в жизнеспособности дрожжей.
Исходная внутриклеточная локализация и отсутствие необходимости преодолевать клеточные барьеры проницаемости составляют важное преимущество эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов. У микроорганизмов деструктивные реакции, сенсибилизированные эндогенными порфиринами, изучались, в первую очередь, на объектах бактериальной природы. Результаты фундаментальных исследований в этой области нашли практическое применение. Так, препараты на основе низкомолекулярного предшественника эндогенных порфиринов - 5'-аминолевулиновой кислоты (АЛК), в настоящее время успешно применяются для лечения бактериальных кожных инфекций. На грибах деструктивное действие видимого света, опосредованное эндогенными порфиринами, изучалось крайне мало. В основном, работы касались исследований фоточувствительности клеток и фотоингибирования митохондриального дыхания дрожжей Saccharomyces cerevisiae, мутантных по различным стадиям биосинтеза гема. Однако, как было показано Фрайкиным с соавт. [1986-1991], свет видимого диапазона способен оказывать летальное действие и на клетки диких штаммов дрожжей. Особенностью эффектов инактивации видимым светом является сильная кислородная зависимость, что свидетельствует о фотодинамическом характере наблюдаемых эффектов. Структура спектра действия фотоинактивации позволила предположить, что процесс опосредуется эндогенными соединениями порфириновой природы. Несмотря на возможное участие эндогенных порфиринов в летальных эффектах видимого света у дрожжей, способов, направленных на создание их
повышенной внутриклеточной концентрации, аналогично действию АЛК у бактерий, не разработано.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании фотодинамической активности эндогенных и экзогенных тетрапиррольных соединений при действии видимого света на дрожжевые грибы и бактерии. Основным направлением работы было изучение факторов, способствующих увеличению локальной концентрации фотосенсибилизаторов в микробных клетках-мишенях и достижению высокой эффективности фотоинактивации, для расширения сферы применения фотосенсибилизаторов, развития методов фотодинамической терапии локальных микробных заражений и фотообеззараживания.
Были поставлены следующие экспериментальные задачи.
1. Выявить эндогенные порфириновые фотосенсибилизаторы, определяющие
чувствительность дрожжей к видимому свету.
2. Разработать способы модификации метаболизма митохондриальных
порфиринов у дрожжей с целью повышения их локальной внутриклеточной
концентрации.
3. Изучить механизмы фотоинактивации клеток дрожжей в условиях накопления
эндогенных порфиринов.
-
Определить типы внутриклеточных повреждений при фото динамической инактивации дрожжей, опосредованной хлоринами и фталоцианинами.
-
Исследовать связывание замещенных катионных металлофталоцианинов с клетками энтеробактерий как представителей группы грамотрицательных видов и определить влияние этого процесса на эффективность фотосенсибилизации.
-
Разработать лабораторную бактериальную тест-систему для отбора перспективных красителей, обладающих фотобактерицидной активностью.
-
Оценить спектр антимикробного действия наиболее перспективного фотосенсибилизатора в системах in vitro на различных видах микроорганизмов, в том числе антибиотикоустойчивых штаммах, а также испытать его эффективность in vivo на животной модели.
Научная новизна. Разработан способ индукции «протопорфирии» у дрожжей и повышения фоточувствительности клеток за счет увеличения внутриклеточного содержания фотоактивного предшественника гема - протопорфирина в результате нарушения биосинтеза гема при введении хелатора железа 2,2'-дипиридила.
Установлено, что увеличение содержания эндогенного протопорфирина в митохондриях и плазматических мембранах дрожжей приводит к интенсификации в этих структурах фотоокислительных деструктивных процессов.
Впервые выявлена высокая фотосенсибилизирующая активность хлоринов в отношении дрожжевых грибов, при действии которых наблюдается высокая степень везикуляризации и потеря барьерных функций плазматическими мембранами клеток.
Обнаружена фотофунгицидная активность катионных фталоцианинов, проявляющаяся как на клеточных культурах, так и на животной модели (кератомикоз кроликов). Методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлено нарушение структурной организации фотосенсибилизированных катионными фталоцианинами дрожжевых клеток, проявляющееся в потере ригидности клеточных стенок.
С использованием бактериальной биолюминесцентной тест-системы доказано увеличение бактерицидной активности фотосенсибилизаторов при переходе от анионных к катионным красителям, а также при возрастании в молекулах количества положительно заряженных заместителей.
Обнаружено, что наличие и количество положительно заряженных заместителей в молекулах фталоцианинов определяет эффективность их связывания с клетками грамотрицательных бактерий и фотобактерицидную активность. Для изучения связывания красителей с бактериальными клетками впервые применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Показано, что внутриклеточная концентрация эндогенных порфириновых соединений является важнейшим фактором, определяющим чувствительность дрожжей к оптическому излучению видимого диапазона спектра.
Получены данные о структурно-функциональных повреждениях в клетках дрожжей при действии эндогенного протопорфирина, а также экзогенных фотосенсибилизаторов - хлоринов и фталоцианинов.
Обосновано применение бактериальной биолюминесцентной тест-системы на основе генно-инженерного штамма Escherichia coli рХеп7 для скрининга красителей на фотобактерицидную активность. С использованием этой тест-системы исследован широкий круга сенсибилизаторов - фенотиазинов, порфиринов, хлоринов и фталоцианинов с зарядом молекул от (-8) до (+16).
Высокая эффективность и широкий спектр действия октакатионного фталоцианина цинка подтверждены на типовых и клинических штаммах микроорганизмов, в том числе устойчивых к антибиотикотерапии.
Разработаны новые методы фотодинамической инактивации микроорганизмов, включая патогенные бактерии, дрожжевые грибы рода Candida и вирус «птичьего гриппа» подтипа H5N1.
Разработана система, включающая фотосенсибилизатор из ряда катионных металлофталоцианинов и светодиодный источник красного излучения с соответствующими спектральными характеристиками, которая позволяет эффективно инактивировать широкий спектр патогенных микроорганизмов и может использоваться в фотодинамической терапии грибковых и бактериальных заболеваний.
Научные положения, обоснованные в работе, используются в курсах лекций и практикумах по биофизике для студентов и аспирантов кафедр биофизики и биоинженерии биологического факультета МГУ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Инактивация дрожжевых грибов видимым светом опосредуется эндогенным
порфириновым фотосенсибилизатором(ами). Воздействия, приводящие к
внутриклеточному накоплению эндогенного протопорфирина IX, повышают
фоточувствительность дрожжевых клеток.
2. У дрожжевых грибов с высоким уровнем содержания эндогенного
протопорфирина IX наблюдаются множественные морфологические, а также
функциональные нарушения, затрагивающие митохондриальный и генетический
аппараты клеток, барьеры клеточной проницаемости.
3. Дрожжевые грибы, включая эталонный и клинические штаммы Candida
albicans, представляют собой новые объекты, чувствительные к фотосенсибилизации
с хлоринами и поликатионными замещенными фталоцианинами.
4. Бактериальная биолюминесцентная тест-система на основе генно-
инженерного штамма E.coli рХеп7 является эффективным инструментом для
качественного анализа фотобактерицидных свойств красителей.
-
Наибольшей фотобактерицидной активностью обладают красители, молекулы которых несут положительный заряд. Эффективность фотодинамической инактивации грамотрицательных бактерий возрастает с увеличением количества положительно заряженных заместителей в молекулах красителей.
-
Эффективность фото динамической инактивации грамотрицательных бактерий поликатионными замещенными фталоцианинами возрастает с увеличением количества связанного клетками красителя.
7. Поликатионные замещенные металлофталоцианины обладают широким
спектром антимикробной активности и являются перспективными соединениями для
фото динамической терапии и фотообеззараживания.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 12-м Международном конгрессе по фотобиологии, Вена (Австрия), 1996; 3-м Съезде по радиационным исследованиям, Пущино (Россия), 1997; Междунар. симпозиуме "Проблемы и направления фотобиохимии", Москва (Россия), 1997; 2-ой Междунар. биофизической конференции, Каир (Египет), 1998; 8-ой Междунар. конференции по спектроскопии и химии порфиринов и их аналогов, Минск (Беларусь), 1998; 2-м и 3-м Съездах биофизиков России, Москва (Россия), 1999 и Воронеж (Россия), 2004; 2-м и 3-м Европейских биофизических конгрессах: Орлеан (Франция), 1997 и Мюнхен (ФРГ), 2000; 1-м, 4-м и 5-м Всероссийских конгрессах по медицинской микологии, Москва (Россия), 2003, 2006, 2007; 11-м Всемирном конгрессе Международной фото динамической ассоциации (IP А), Шанхай (Китай), 2007; Научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и
склеры», Москва (Россия), 2007; Научно-практической конференции «Лазерные технологии в оториноларингологологии», Тула (Россия), 2007; 6-ой Научно-практической конференции «Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии», Москва (Россия), 2008; 5-м Съезде фотобиологов России, Пущино (России), 2008; 5-ой Международной конференции по порфиринам и фталоцианинам (ICCP-5), Москва (Россия), 2008; 1-ой Междунар. Рабочей Встрече «Применение редокс-технологий в окружающей среде», Стамбул (Турция), 2009; 5-м, 8-м, 10-м, 12-м и 13-м Конгрессах Европейского общества фотобиологов (ESP): Марбург (Германия), 1993, Гранада (Испания), 1999, Вена (Австрия), 2003; Бат (Англия), 2007; Вроцлав (Польша), 2009; 15-м Международном конгрессе по фотобиологии, Дюссельдорф (ФРГ), 2009; XXIII сессии Европейской группы по изучению Helicobacter, Роттердам (Нидерланды), 2010.
Основные результаты доложены и обсуждены на специализированном научном семинаре в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 печатная работа, в том числе 17 статей в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки; 22 тезисов докладов в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций; получено 8 патентов Российской Федерации на изобретение, подана 1 заявка на патент РФ на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 285 страницах, содержит 73 рисунка и 14 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей изложение и обсуждение результатов (5 глав), заключения, выводов, приложения, в котором дается описание объектов и методов исследования, и списка цитируемой литературы, насчитывающего 449 наименований, в том числе 48 отечественных и 401 зарубежных источников.
