Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время особую актуальность имеют исследования по разработке методов сохранения растений, ареалы и численность которых резко снижаются, а также для уникальных форм, сортов и генотипов растений, расширяющих и улучшающих сортимент возделываемых растений. В связи с прогрессом селекции и появлением большого количества новых сортов, имеющих сложное генетическое происхождение, технологии выращивания посадочного материала требуют усовершенствования.
Одними из новых и перспективных ягодных культур для Западной Сибири являются смородина золотистая {Ribes aureum Pursh) и голубика топяная (Vaccinium uliginosum L.). Смородина золотистая представляет интерес в связи с поздним, по сравнению с другими видами смородины, созреванием ягод, жаро-, засухоустойчивостью, она практически не поражается болезнями и редко - вредителями (Ягу-дина, 1976). Голубика топяная, широко распространенная на территории Западной Сибири, хорошо зарекомендовала себя в условиях интродукции (Снакина, 2007). Сорта североамериканской голубики, созданные на основе голубики щитковой (V. corymbosum L.), имеющие огромный спрос на мировом потребительском рынке, в Сибири недостаточно зимостойки. Одной из особенностей многих перспективных сортов R. aureum и V uliginosum является их невысокая способность к воспроизводству при традиционных способах размножения. Применение современных методов вегетативного размножения, таких как клональное микроразмножение оправдано и экономически эффективно, особенно в отношении ягодных культур (Ruzic, Lazic, 2006). Использование методов размножения in vitro является оптимальным решением задачи как для размножения растений с нарушенным процессом воспроизводства, так и для массового размножения ценных генотипов растений (Высоцкий, 1998; Бутенко, 1999).
Считается, что все виды растений потенциально могут быть размножены через культуру тканей, но далеко не для всех видов эти методики разработаны (Мамаева и др., 2008). Широкому использованию методов клонального микроразмножения для многих видов, сортов и форм растений препятствует то, что морфогенетический потенциал и регенерационная способность культивируемых тканей часто строго зависят от генотипа и условий культивирования. В связи с этим, возникает необходимость идентификации растительного материала, отражающая происхождение и индивидуальные особенности генотипа, степень сходства и различия отдельных генотипов растений (Окунева, 1998).
Таким образом, при решении задачи сохранения, воспроизводства и рационального использования коллекционного фонда особое значение приобретает вопрос всестороннего изучения биологических особенностей растений как исходной базы для репродукции.
Цель и задачи исследований. Цель данной работы - выявить особенности размножения сортов Ribes aureum и Vaccinium uliginosum в культуре пазушных почек in vitro и дать оценку эффективности данного метода. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
провести идентификацию сортов Ribes aureum и Vaccinium uliginosum с помощью анализа водосолерастворимой фракции белков семян;
разработать эффективные методы получения стерильной культуры эксплантов;
- определить влияние возраста экспланта на микроразмножение Ribes
aureum;
оптимизировать состав питательных сред на всех этапах культивирования;
исследовать особенности влияния регуляторов роста и физиологически активных добавок питательной среды на процессы микроразмножения эксплантов на всех этапах культивирования;
разработать методы адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro;
дать экономическую оценку эффективности метода клонального микроразмножения.
Научная новизна. Впервые предложен метод выявления особенностей культивирования эксплантов в зависимости от генотипа растений с использованием метода белковых маркеров, и на основе этого предложен способ оптимизации процесса микроразмножения. Разработаны эффективные приемы получения асептической культуры первичных эксплантов. Показано, что в культуре in vitro почки от зрелых растений смородины золотистой реювенилизируются. Изучена реакция эксплантов на экзогенные регуляторы роста и физиологически активные добавки питательной среды. Показана возможность успешной адаптации расте-ний-регенерантов на гидропонной установке «Минивит». Проведена оценка экономической эффективности метода микроразмножения 4 сортов Ribes aureum и 4 сортов Vaccinium uliginosum, и показана его рентабельность.
Защищаемые положения:
1. Использование предварительной идентификации сортов Ribes aureum мето
дом белковых маркеров позволяет выявить специфику их культивирования in vitro.
2. Увеличение коэффициента размножения сортов Vaccinium uliginosum
достигается применением двухстадийного этапа собственно размножения.
Практическая и теоретическая ценность. На основании полученных результатов предложены технологии ускоренного размножения и адаптации смородины золотистой и голубики топяной, создана коллекция этих растений in vitro. Работа в лабораторных условиях дает возможность планировать выпуск посадочного материала к определенному сроку. Применение разработанных элементов технологий позволяет более успешно решать проблему ускоренного размножения ценных сортов и форм и сохранения ценного растительного материала.
Показана возможность использования метода белковых маркеров для выявления особенностей культивирования эксплантов в зависимости от генотипа растения.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II Научно-практической конференции в рамках 3-го Фестиваля науки в г. Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех» «Перспективы развития инноваций в биологии (г. Москва, 2008), на Молодежной Всероссийской школе-семинаре «Современные фундаментальные проблемы физиологии и биотехно-
логии растений и микроорганизмов» (г. Томск, 2008), на XXXV научной конференции студентов, магистрантов, аспирантов и учащихся лицейных классов «Дни молодежной науки в Алтайском государственном университете» (Барнаул, 2008), на форуме о биологических и экологических проблемах в лесном хозяйстве г. Хэйхэ, провинции Хэйлунцзян (г. Хэйхэ, 2009), на Всероссийской конференции с международным участием «Ботанические сады и актуальные проблемы интродукции растений на современном этапе» (Томск, 2010), экспонировались на 2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008» (г. Москва, 2008), на Международной выставке-конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции» (г. Санкт-Петербург, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, списка сокращений, 6 глав, выводов, списка литературы; содержит 33 рисунка и 18 таблиц. Список литературы включает 303 работы, в том числе 170 - на иностранных языках.
ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
На основе литературных данных рассмотрены вопросы использования методов биотехнологии в системе сохранения и воспроизводства ценных генотипов растений. В данной главе проанализированы основные факторы, влияющие на процесс микроразмножения: первичный эксплант, генотип растения, компоненты питательной среды, физические условия культивирования. Рассмотрены методы идентификация ягодных культур на основе молекулярно-генетических маркеров. Представлен обзор исследований, касающийся размножения in vitro представителей подсемейства Vaccinioideae Arnott и семейства Grossulariaceae DC.
