Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Морфогенетический потенциал органов и тканей растений в условиях in vitro 11
1.1. Морфогенез растений in vitro 11
1.1.1. Особенности протекания морфогенеза in vitro 13
1.1.2. Гистологический анализ в культуре органов и тканей 19
1.2. Факторы регуляции процессов морфогенеза 23
1.3. Основные методы регенерации растений in vitro 30
1.4. Ирис как объект биотехнологических исследований 48
Глава 2. Материалы и методы исследований 57
2.1. Исходный растительный материал 57
2.2. Условия асептики и стерилизация растительного материала 62
2.3. Методы исследования 63
Глава 3. Реализация морфогенетического потенциала органов и тканей ириса (Iris L.) в условиях in vitro путём прямого органогенеза 67
3.1. Регенерационная способность почек вегетативного побега ириса 67
3.2. Эмбриокультура ириса 75
3.3. Морфогенез и регенерация фрагментов цветка видов ириса 81
3.3.1 . I sibirica 84
3.3.2. I ensata 98
33.3.I.hybrida 100
Глава 4. Гистологический анализ этапов морфогенеза в эксплантах органов цветка ириса в условиях in vitro 103
4.1. Этапы морфогенеза в эксплантах органов цветка видов ириса 103
4.1.1. L. sibirica 103
4.1.2. L ensata 122
4.1.3. I. hybrida 131
4.2. Сравнительный анализ гистогенеза и органогенеза в эксплантах генеративных органов культиваров I hybrida, I. ensata, I. sibirica 141
4.3. Морфогенез и регенерационная способность эксплантов околоцветник-завязь сортов и гибридов I. sibirica. I. ensata и I. hybrida 147
Выводы 152
Практические рекомендации 154
Библиографический список 155
Приложение 181
- Факторы регуляции процессов морфогенеза
- Регенерационная способность почек вегетативного побега ириса
- . I sibirica
- Сравнительный анализ гистогенеза и органогенеза в эксплантах генеративных органов культиваров I hybrida, I. ensata, I. sibirica
Введение к работе
Актуальность темы. Нешотря на имеющиеся экспериментальные работы в области изучения процессов морфогенеза и регенерации растений в условиях in vitro, до сих пор остаются не разработанными системы получения in vitro для большинства многолетних садовых культур. Это обусловлено отсутствием четких хорошо воспроизводимых методик, их трудоемкостью, а также недостатком знаний о морфогенетическом потенциале органов и тканей этих культур и способах управления морфогенезом.
Род Iris L. самый большой и наиболее сложный из семейства Iridaceae Juss. (Родноненко, 1988, 1996). Проблеме сохранения и изучения видов рода Iris посвящены работы многих российских и зарубежных авторов (Родионенко, 1961; Yabuya, 2004; Алексеева, 2005; Доронькин, 2006; Долганова, 2008; Миронова, 2008).
Изучение регенерационной способности эксплантов генеративных органов ириса в культуре in vitro представляет собой теоретический и практический интерес. Большая часть работ проводится в области эмбриокультуры (Yabuya, 1981, 1985; Kawase et ah, 1995; Ишмуратова, 1999; Болтенков, 2002; Полковникова, 2000; Вечернина и др., 2004; Мамаева и др., 2005, 2007, 2008; Noland et al., 2006; Jevremovic et al., 2006). Анатомического описания процессов регенерации в динамике развития в доступной нам литературе не обнаружено.
В связи с этим изучаемая проблема является актуальной и практически значимой.
Цель работы - выявить морфогенетические особенности развития различных типов эксплантов в культуре in vitro и сравнить их регенерационную способность для культиваров ириса (/. sibirica L., /. ensata Thunb., I. hybrida hortj.
Задачи:
изучить регенерационную способность почек вегетативного побега ириса;
показать возможный способ устранения микробного загрязнения эксплантов;
усовершенствовать метод эмбриокультуры для данных видов ириса;
изучить особенности реализации морфогснетического потенциала эксплантов органов цветка через прямой органогенез;
провести анатомо-морфологический анализ тканей эксплантов репродуктивных органов интактных растений;
сравнить методами гистологического анализа особенности прохождения морфогенеза в динамике у различных типов эксплантов генеративных органов.
Предмет исследования. Пути реализации морфогенетического потенциала различных эксплантов изучаемой культуры, особенности получения растений в условиях in vitro.
Методы исследования. Морфологические, гистологические, микробиологические методы, методы культуры органов и тканей.
Основные положения, выносимые на защиту:
- формированию очага меристематической активности в эксплантах органов
цветка ириса (трубка околоцветника, ось соцветий) предшествует изоляция ини
циальной клетки и образование полиады;
трубка околоцветника - идеальный тип экспланта для клонального микроразмножения сортов и гибридов /. sibirica, I. ensata, I. hybrida;
применение гистологического анализа позволит контролировать процессы на тканевом уровне, для того чтобы направлять морфогенез в нужном для исследователя русле.
Научная новизна. Впервые проведен микробиологический контроль эксплан-тов почек вегетативного побега ириса, введённых в культуру in vitro, и определена чувствительность к антибиотикам выделенных микроорганизмов. Доказана необходимость введения малотоксичного антибиотика в состав питательных сред до тех пор, пока инфекция не перестанет проявлять себя, чередуя среды с антибиотиком и без него.
Доказан позитивный эффект от введения в питательную среду L-глутамина и аденин сульфата на адвентивное побегообразование у зародышей ириса. Показано, что органы, развивающиеся у зародышей ириса в культуре in vitro, по своему анатомическому строению сходны с корневищем ириса, с несколько активизированными зонами эндогенного геммогенеза и ризогенеза.
Впервые показаны различные пути реализации морфогенетического потенциала (геммогенез, гемморизогенез, ризогенез) у соматических тканей органов цветка ириса в процессе прямой регенерации in vitro. Установлена высокая регенерационная способность трубки околоцветника в культуре in vitro у всех изученных культива-ров. Показано влияние расположения экспланта на питательной среде, концентрации фитогормонов на процесс прямой регенерации растений ириса.
Впервые проведён сравнительный анализ анатомического строения разных типов эксплантов у /. sibirica, I. ensata, I. hybrida, а также гистологический анализ динамики процессов органогенеза в культуре in vitro органов цветка. Выявлено, что формированию очага меристематической активности в эксплантах органов цветка ириса (трубка околоцветника, ось соцветий) предшествует изоляция инициальной клетки и образование полиады. Побеги образующиеся de novo эндогенного происхождения. Для /. hybrida характерно формирование гидроцитной системы.
Анатомически доказано, что адаксиальная и абаксиальная стороны трубки околоцветника у /. sibirica, 1. ensata, I. hybrida отличаются по своему строению. Адаксиальная сторона содержит адаксиальную меристему, благодаря активности которой, побеги регенерируют только на данной стороне экспланта. Побеги, сформированные у эксплантов трубки околоцветника изученных видов ириса, имеют типичное строение для вегетативных побегов однодольных растений, а флоральные элементы развиваются на месте примордиев первых листьев.
Методами гистологического анализа выявлены сходства и различия в динамике прохождения этапов морфогенеза у разных видов ириса (/. sibirica, I.ensata, I. hybrida) и разных типов экспланта (ось соцветия и трубка околоцветника).
Практическое значение полученных результатов. Впервые разработан способ прямой регенерации из разных типов эксплантов I. sibirica, 1. ensata, I. hybrida, позволяющий получать активно пролиферирующую культуру ириса.
Разработан метод введения в культуру in vitro почек вегетативного побега ириса, позволяющий получить стерильный материал, на основе микробиологического контроля, определения чувствительности выделенных микроорганизмов к
антибиотикам и введения малотоксичного антибиотика, из списка предложенных, в питательную среду для культивирования эксплантов.
Усовершенствован метод эмбриокультуры ириса: определён срок изоляции зародыша, подобраны питательные среды, проведено анатомо-морфологическое изучение регенерантов.
Усовершенствованна методика приготовления гистологических препаратов. Полученные данные анатомо-морфологических исследований предоставляют возможность целенаправленно изменять определённые факторы: гормональный состав питательной среды, тип экспланта, время культивирования для контроля морфогенеза в культуре in vitro.
Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены соискателем в лаборатории биотехнологии и цитологии ГНУ НИИСС им. М.А. Лисавенко (НИИСС). Микробиологические исследования и приготовление гистологических препаратов проведено совместно с сотрудниками лабораторий бактериологии и гистологии Краевой клинической больницы г. Барнаула.
Апробация работы.
Основные положения и результаты исследований были представлены на Восьмой международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010); V Международной научно-практической конференции «Аграрная наука сельскому хозяйству» (Барнаул, 2010); Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения З.И. Лучник «Декоративное садоводство Сибири: проблемы и перспективы» (Барнаул, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Ботанические сады. Проблемы интродукции» (Томск, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 научных статей, в том числе 3 статьи в рецензируемых изданиях, 5 - в сборниках материалов и тезисов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах; состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, 21 таблицы, 69 рисунков и приложения. Библиографический список включает 256 источников, в том числе 100 - на иностранных языках.
Факторы регуляции процессов морфогенеза
Оптимальная питательная среда, физические факторы, баланс экзогенных гормонов, стимуляторы, а также присутствие сигнальных белков и белков-акцепторов - условия, обязательные условия для получения клеток, способных к морфогенезу.
Процесс морфогенеза in vitro зависит от многих факторов. Использование экзогенных гормональных препаратов является сейчас одним из основных подходов для получения растений-регенерантов in vitro. При этом! диапазон варьирования концентрации ауксинов и их аналогов, цитокининов, абсцизовой и гиббереловой кислот, этилена, а также ингибиторов их синтеза достаточно широк (Бутенко, 1999).
Первыми исследователями условий органогенеза были известные учёные F. Skoog, S. Miller и Т. Murasshige. Работая с экзогенными гормональными факторами, F. Skoog, и S. Miller изучили сначала влияние ауксина, а затем ими был получен новый стимулятор роста растений, названный кинетином — 6-фурфуриламинопурин. Экспериментируя с экзогенными ауксином и кинетином, учёные пришли к выводу, что примерно равные концентрации их в среде вызывают каллусогенез у паренхимного экспланта. При этом наблюдалась быстрая пролиферация клеток и значительное (в 31 раз) увеличение массы каллуса. Преобладание ауксина над цитокинином приводило к появлению зачатков корней и развитию корневой системы на поверхности среды. Увеличение дозы кинетина или уменьшение концентрации ауксина приводило к дифференциации клеток в зачатки побегов и растения-регенеранты (Skoog, Miller, 1957).
F. Skoog, S. Miller доказали, что морфогенез присущ не только первичному каллусу. Оказалось, что после нескольких субкультивирований у табака также можно вызвать органогенез при той же схеме концентрации ауксина и кинетина (Бутенко, 1999).
Фитогормоны - органические сравнительно низкомолекулярные соединения, с помощью которых осуществляется взаимодействие клеток, тканей и органов, которые в малых количествах необходимы для запуска и реализации физиологических программ (Полевой, 1982;Чайлахян, 1982).
Выделяют пять групп классических фитогормонов: ауксины (производные индола, основной природный ауксин - гетероауксин; в эту группу также входят ИУК - 3-индолилуксусная кислота, НУК - а-нафтилуксусная кислота, 2,4-Д -дихлорфеноуксусная кислота), цитокинины (производные б-аминопурина, основной природный цитокинин - зеатин; в эту группу также входят кинетин и 6-бензиламинопурин), гибберилины (тетрациклические карбоновые кислоты класса дитерпеноидов, наиболее распространён гиббереллин A3, или гиббереловая кислота), абсцизины (абсцизовая кислота (АБК) - оптически активный сесквитерпиноид) и этилен (бесцветный газ, ненасыщенный углеводород с двойной связью) и другие (Полевой, 1982; Кулаева, 1962, 1973, 1982, 1995; Чуб, 2003).
Ауксины, гиббереллины, цитокинины оцениваются в целом как гормоны стимулирующего действия, абсцизины и этилен ингибирующего действия. Постулировано общее свойство классических фитогормонов: синтезируясь в одних частях растения и транспортируясь в другие его части, они оказывают влияние на многие процессы, в том числе морфогенетического характера. Установлено, что между фитогормонами существуют многообразные связи. Действие всех фитогормонов на растение поливалентно: все они действуют на рост и деление клеток, на процессы старения и адаптации, на транспорт веществ, дыхание, синтез нуклеиновых кислот и белков и на многие другие процессы. Показано, что существенными факторами для эффективного действия гормонов являются, с одной стороны, концентрация гормона, достигшего клеток -«мишеней», с другой - компетентность растительной клетки (Чуб, 2003; Романов, Медведев, 2006).
На сегодняшний день существует много работ доказывающих то, что комбинация НУК и БАП усиливают регенерацию побегов из соматических клеток Zingiber officinalis Rose, Dianthus chinensis L., Curcuma zedoaria Rose, и др. (Marcia et al, 2001).
Ауксины являются обязательными участниками координации процессов морфогенеза, оказывающие влияние на деление, рост и дифференциацию клеток. Эти фитогормоны необходимы, прежде всего, для инициации репликации ДНК. Под влиянием ауксинов продолжительность различных периодов митотического цикла уменьшается. Что приводит к значительному ускорению темпов размножения клеток (Полевой, 1982; Кулаева, 1973, 1982, 1995; Чуб, 2003).
Самый первый физиологический эффект ауксинов - аттрагирующий (от лат. attractio - привлечение). Клетки меристемы «привлекают» к себе питательные вещества. В субапикальной зоне ауксин вызывает растяжение клеток. Ниже зоны растяжения начинается дифференцировка проводящей системы и механических тканей. В связи с тем, что стеблю необходим приток питательных веществ от корня, под действием ауксина и Сахаров формируются проводящие пучки, в основном ксилема. Ауксины вызывают эффект апикального доминирования -подавления роста боковых почек в пользу апикальной меристемы. Большое количество ауксинов — это сигнал о росте побегов: растению требуется больше воды и минеральных веществ, т. е. оно должно образовывать большее число корней. Ауксины стимулируют ризогенез - закладку придаточных корней на стебле и боковых корней на главном корне (Чуб, 2003).
Ауксины считаются одними из основных гормонов растений. Это привлекает к исследованию их роли и механизма действия. К настоящему времени уже имеется детальная картина начальных этапов сигнализации ауксина. На Втором международном симпозиуме (2007) в докладе R. Napier (Великобритания) было проведено сравнение основных методов, используемых для оценки концентраций ауксинов в тканях растений, таких как применение генетических репортёров, иммунохимия и масс-спектрометрия. Согласно R. Napier, именно последний метод является количественным и наиболее надёжным (Кравец и др., 2008).
Главное отличие от ауксинов - у цитокининов иная точка синтеза. Если ауксины синтезируются .в апексе побега, то цитокинины - биохимический маркёр апекса корня. Ауксин транспортируется по растению сверху вниз и активно, а цитокинин - снизу вверх и пассивно. Также как и ауксинам, цитокининам присущ аттрагирующий эффект. Апекс корня для своего роста нуждается в питательных веществах. Минеральных солей и воды у корня в достатке, поэтому необходимо «притягивать» органические вещества. Этот эффект проявляется в зоне деления корня. В зоне дифференцировки корня цитокинины отвечают за образование проводящей системы. Так как корень нуждается в продуктах фотосинтеза, транспортируемых флоэмой, цитокинины стимулируют закладку элементов флоэмы. Повышенная концентрация цитокининов «говорит» растению о благополучном развитии корневой системы. Это означает, что нет необходимости в новых корнях. Цитокинины подавляют рост боковых корней. Вместе с тем нужны побеги, которые образуют новые листья и позволяют лучше снабжать растущие корни. Под действием цитокининов развивают боковые почки на побегах. Таким образом, цитокинины снимают апикальное доминирование, вызванное ауксинами (Чуб, 2003; Романов, Медведев, 2008).
Исследования последних лет ознаменовали значительный прогресс в понимании процессов сигнализации и биосинтеза цитокининов. Эти достижения стали возможны благодаря полной расшифровке первого растительного геномов (у Arabidopsis thaliana L., или резушки Таля) и получению мутантов с подавленными эффектами цитокининов. Функциональный анализ геномов позволил идентифицировать гены биосинтеза, инактивации и сигнализации фитогормонов этого класса. Исследователями Т. Schmulling et al. (2007) и Г. А. Романовым и С.С. Медведевым (2006) у трансгенных растений, активно экспрессирующих цитокининоксидазу и дефицитных по цитокининам, установлено усиление роста и ветвление корней, что свидетельствует о негативной роли этих гормонов в регуляции корнеобразования. Цитокинины стимулируют переход клеток корня от деления к растяжению с выходом из основной меристемы. Однако в побегах цитокининдефицитных растений, наоборот апикальные меристемы более мелкие, что указывает на раннюю дифференциацию тканей. Это означает, что цитокинины позитивно влияют на активность апикальных меристем побега, формирование примордиев листьев и развитие сосудов побега (Кравец и др., 2008).
Регенерационная способность почек вегетативного побега ириса
Экспланты корневищного и луковичного происхождения имеют высокую степень инфицированности, так как вегетативные почки находятся в почве и их стерилизация представляет определённую трудность (Миронова, 2004; Мошкин, Лукаткин, 2005).
Для поверхностной стерилизации растительных тканей имеется большой набор химических соединений. В основном используются вещества двух групп: содержащие активный хлор (хлорамин, гипохлорид натрия и калиция и др.) и содержащие ртуть (хлорид ртути - сулема, диоцид и др.). Вторая группа препаратов обладает наибольшим дезинфицирующим эффектом, но являясь сильными ядами, эти вещества токсичны для растений. Кроме выше названных стерилизующих средств, используют так же перекись водорода, этиловый спирт, спиртовой раствор иода и т. д. (Губарева и др., 2004).
Для почек вегетативных побегов ириса были использованы дезинфицирующие средства из разных групп отдельно и в сочетании в пяти вариантах. Жизнеспособность эксплантов была высокая при всех испытанных способах стерилизации (рис. 1). Исключением явились вегетативные почки I. hybrida при использовании хлоргексидина и раствора этанола 70% в сочетании с 3% перекисью водорода. В данных вариантах опыта гибель экспланта наступала очень быстро по причине загнивания почки. Инфицированность эксплантов I. ensata, I. sibirica в течение первых 7-10 дней была невысокая, что говорит о качественной поверхностной стерилизации, но в последующем времени достигала больших величин, вероятно за счет внутренней инфекции. Предстерилизационная обработка 0,3% раствором фундазола в течение 16 часов положительных результатов не дала (табл. 3). Увеличение времени стерилизации больше 20 минут приводило к массовой гибели эксплантов.
Совместно с бактериологической лабораторией краевой клинической больницы г. Барнаула проведено изучение состава микроорганизмов, выделенных из инфицированных эксплантов культиваров /. hybrida, I. ensata, I. sibirica, в сравнении с составом микрофлоры тканей корневищ интактных растений этих видов ириса. Для /. hybrida в качестве инфекционной микрофлоры эксплантов чаще всего выделялась Ervinia spp. Наличие данной бактерии в тканях корневищ интактных растений и периода их проявления в культуре in vitro (через 7-10 дней) говорит о том, что данная инфекция является внутренней и даже самые жесткие способы стерилизации эксплантов для неё не эффективны. Для /. ensata, I. sibirica в качестве внутренней проявила себя грибная инфекция (табл. 4).
Для выделенных бактерий из рода Ervinia и Pseudomonas подобрана была чувствительность к антибиотикам методом дисков. Выбор антибиотиков определялся их спектром действия. Так как бактерии из рода Ervinia и Pseudomonas являются гр.(-) палочковой микрофлорой, все 20 антибиотиков, к которым определялась чувствительность, обладают бактерицидным и бактериостатическим действием в отношении этих форм микроорганизмов. Из предложенного списка антибактериальных средств, Ervinia spp. была устойчива только к ампициллину, a Pseudomonas spp. проявила устойчивость к ряду антибиотиков: доксициклину, тетрациклину, цефотаксиму, цефтриаксону. Тем не менее, к большей части лекарственных средств эти бактерии проявляли высокую чувствительность. Это позволило для введения в питательную среду выбрать из предложенного списка менее токсичные препараты, которые не подавляли рост эксплантов вегетативных почек ириса (табл. 5).
При введении в культуру in vitro гибридов 5-282-98 и 8-282-98 /. hybrida в питательные среды бьш добавлен антибиотик левомицетин в количестве 100 мг/л, контролем служила среда без антибиотиков. Для эксплантов /. ensata (гибрид 1-103-97) и /. sibirica (гибрид 5-282-98) процент инфицированности был на уровне контроля, что говорит о преобладании инфекции грибной этиологии. Для культиваров /. hybrida на средах с антибиотиком процент инфицированных эксплантов, снизился до 20. Вероятно, для данного вида ириса более характерно наличие бактериальной микрофлоры (рис. 2).
Антибиотики обладают рядом ценных преимуществ в борьбе с фитопатогенными микроорганизмами, по сравнению с другими используемыми для этой цели веществами: легко проникают в органы и ткани растений, обладают антибактериальным действием в тканях растений и сравнительно медленно инактивируются в них. Основные антибиотики, используемые в лечебных дозах, нетоксичны для растений. Таким образом, быстрое проникновение антибиотиков в растение и распространение в его тканях, при сравнительно медленном темпе инактивации, позволяют создавать определенное насыщение антибиотиком, необходимое для подавления фитопатогенной микрофлоры.
Многочисленные экспериментальные данные показывают, что биологическая активность антибиотиков проявляется в тканях растений значительно сильнее, чем в тканях животных. Основные применяемые антибиотики (тетрациклин, стрептомицин, неомицин, полимиксин и др.) подавляют большинство видов возбудителей заболеваний растений (http://academic/ru).
При работе с культурой тканей ириса, вероятность проявления скрытой инфекции очень велика на протяжении всех этапов культивирования. Патогенное действие микроорганизмов вызывало угнетение и гибель регенерантов. Но. в некоторых случаях растущие, внешне здоровые регенеранты не образовывали адвентивные побеги на средах размножения. В этом так же проявлялось их угнетение патогенном.
При выборе антибиотика необходимым условием является отсутствие токсичности. Некоторые антибиотики, такие, как мицетин, клавацин, субтилин, глиотоксин, токсичны для растений даже в сравнительно малых дозах. Стрептомицин, ауреомицин, террамицин, гризин могут накапливаться в тканях растений в концентрациях до 500—1000 ед/г без видимых признаков отравления. Пенициллин даже в дозе 3000 ед/г не оказывает токсического действия на растение.
В лабораторных условиях возможны случаи хронического отравления растений даже слаботоксичными антибиотиками, которые применялись длительно и бессистемно. Проявления токсического действия антибиотиков очень разнообразны: задержка роста и развития растения, угнетение роста корней или надземных частей растения, нарушение процесса образования хлорофилла и flp.(http://academic/ru).
. I sibirica
Завязь всех изученных культиваров /. sibirica на питательных средах с 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК способна регенерировать только корни. На средах с 1 или 20 мкМ БАП и 1 мкМ НУК регенерация отсутствовала (рис.6).
У тычиночной нити геммогенез наблюдался только на средах с 8 мкМ БАП 4 мкМ НУК (2:1) и 20 мкМ БАП 1 мкМ ИМК (20:1) (рис. 7). Так как это были единичные случаи, и побеги развивались на базальной части тычиночной нити, то вероятно, при эксплантации были срезаны ткани трубки околоцветника в месте их соединения, и побеги развивались именно из этих тканей.
У всех изученных культиваров /. sibirica при использовании в качестве эксплантов рьшец, столбиков и пьшьников никаких морфогенетических изменений на вышеописанных средах не отмечено в течение всего периода культивирования (70 суток). Эти экспланты в 0 пассаже увеличились в размерах, но в дальнейшем погибли в результате некроза тканей (табл. 10).
У сортов ириса сибирского Cambridge, Стерх, Berlin Rufles, Кассандра, King of King, Лаула процесс морфогенеза в культуре in vitro в наших опытах протекал аналогично. У сорта Стерх процесс морфогенеза был выражен также у столбика на среде с 20 мкм БАЛ и 1 мкМ ИМК. Часть эксплантов регенерировала побеги (рис. 8).
Морфогенез и регенерация оси соцветия культиваров /. sibirica.
Морфологически оси соцветий и ткани цветоложа являются органами осевой природы, еще не закончившими эмбриональное развитие и не утратившими морфогенетические способности (Батыгина, 1994). В размножении геофитов, таких как Allium ampeloprasum L., Dichelostemma multiflorum Benth., Gladiolus grandiflorus hort, Haemanthus coccineus L., Hyacinthus orientalis L., Narcissus tazetta L., Nerine sariniensis Herb., Iris ensata, I. setosa Pall, /. sanguinea Hornem (Kawase et al, 1995; Чурикова, Барыкина, 1995; Ziv, Lilien-Kipnis, 2000; Ziv, Naor, 2006; Болтенков, Зарембо, 2005), часто в качестве эксплантов, характеризующихся высокой регенерационной способностью, используют не апикальные меристемы, а соматические ткани и органы цветка, в частности цветоножку.
Для культуры in vitro от генеративных побегов /. sibirica брали участки между кроющим листом и цветком. Стерильные сегменты цветоножки помещали на среду MS с различным гормональным составом (таб. 10). В качестве фитогормонов использовали БАП в концентрациях 1-20мкМ и НУК - 5мкМ.
Показано, что тип морфогенетической реакции зависел от количества и соотношения экзогенных фитогормонов. На питательных средах с 4 мкМ БАП, 4 мкМ НУК (1:1) и 4 мкМ БАП, 5 мкМ НУК (1:1,25) ответной реакцией было корнеобразование (рис. 9). На средах где содержание цитокининов превышало содержание ауксинов в 1,2 раза и более, начиная с 6 мкМ БАЛ фрагменты оси соцветия образовывали побеги.
В ходе исследований было обнаружено, что на среде с одним и тем же содержанием гормонов возможен разный тип морфогенетической реакции у эксплантов оси соцветия. Это связано с ориентацией эксплантов на оси генеративного побега. Фрагменты расположенные ближе к цветку (к завязи) образуют корни. Это, видимо, связано с тем, что экспланты завязи на всех испытанных нами вариантах сред образовывали только корни, и во время отделения фрагмента цветоножки часть ткани завязи попала на эксплант (рис. 10).
Динамика развития регенерационных процессов в экспланте зависела от концентрации гормонов в питательной среде. На среде с 8мкМ БАЛ и ЗмкМ НУК у эксплантов оси соцветия сорта Стерх первые признаки геммогенеза отмечены были на 15 сутки культивирования. Максимальное время составило 35 суток, позже этого срока видимых признаков органогенеза у испытанных сортообразцов не наблюдали.
Морфогенез и регенерация в культуре in vitro трубки околоцветника J. sibirica. Особый тип морфогенетической реакции в культуре in vitro мы наблюдали, используя в качестве эксплантов фрагменты трубки околоцветника. Из ткани экспланта развивались структуры похожие на доли околоцветника. Со временем эти структуры приобретали характерную для цветков данного сорта окраску (рис. 11).
Экспланты располагали на питательной среде адаксиальной стороной. При помещении экспланта на поверхность среды абаксиальной стороной, признаков регенерации не наблюдали за всё время культивирования.
На всех испытанных питательных средах при культивировании эксплатов трубки околоцветника отмечали 100% геммогенез (табл. 10).
В отношении органогенеза Скугом и Мурасиге была выдвинута концепция, согласно которой можно получить образование стеблей, корней или недифференцированный рост каллуса, изменяя относительное содержание ауксинов и цитокининов (Бутенко, 1975).
Влияние содержания цитокинина в питательной среде 0 пассажа отразилась на интенсивности регенерации у трубки околоцветника /. sibirica. Повышая содержание БАП от 4мкМ до 8мкМ, можно было наблюдать образование большего количества побегов, и увеличение скорости регенерации. При этом количество НУК 3, 4, 5 мкМ повторялось в каждой серии опытов. В качестве контроля использовали питательную среду содержащую БАП ІмкМ НУК 1мкМ. На данной среде все экспланты в 0 пассаже увеличились в размерах, но в дальнейшем погибли в результате некроза тканей.
На регенерационную способность эксплантов трубки околоцветника больше оказывало влияние не количественное содержание гормонов, а соотношение цитокининов и ауксинов. Если соотношение цитокинина и ауксина составляло 1:1 и 1:1,25, то есть в равном количестве, или содержание НУК было больше, одновременно с образование побегов можно было наблюдать и образование корней. В данных вариантах опыта морфогенез проходил по типу гемморизогенеза (табл. 11).
Сравнительный анализ гистогенеза и органогенеза в эксплантах генеративных органов культиваров I hybrida, I. ensata, I. sibirica
При гистологическом исследовании установлено, что морфогенетические процессы в эксплантах осевой природы (цветоносах) в культуре in vitro культиваров /. hybrida, I. ensata, I. sibirica проходят аналогично, что подтверждает близость на родовом уровне данных видов ириса. Однако при большом сходстве прохождения морфогенетических процессов, нами обнаружены и некоторые различия.
Способность к дедифференциации и восстановлению меристематической активности в цветоносах ириса проявляют, прежде всего, клетки перицикла и нескольких прилегающих к нему внутренних слоев первичной коры. Клеточные деления постепенно распространяются центробежно и центростремительно, вовлекая в этот процесс все слои клеток первичной коры, а также клетки обкладок проводящих пучков. По всей видимости, это особенность рода Iris. У гиацинта и нарцисса, описанных ранее О.А. Чуриковой и Р.П. Барыкиной (19955), меристематическую активность в начале процесса регенерации проявляют клетки неповреждённого субэпидермального и нескольких прилегающих к нему наружных слоев первичной коры.
Первые деления клеток эксплантов I. ensata и /. sibirica отмечали спустя 7 суток после помещения их на питательную среду. Экспланты /. hybrida обладают большей регенерационной активностью, первые полиады наблюдали на 4 сутки культивирования, а первые визуальные признаки геммогенеза - после 14 суток культивирования на данных питательных средах. Это на несколько дней раньше, чем у I. ensata и Z sibirica.
Формирование гидроцитной системы было выявлено только в эксплантах /. hybrida, у /. ensata и /. sibirica не наблюдали. Подобные васкулярные элементы отмечены ранее для гиацинтов, нарциссов, лилий (Чурикова, Барыкина, 1995; Набиева, 2008). Вероятно, это связано с местом обитания данных видов и условиями произрастания. /. hybrida способен расти в условиях повышенной сухости верхних горизонтов почвы. Его ткани запасают воду при помощи, проводящей системы. Произрастание I. ensata и I. sibirica исторически связано с переувлажнёнными почвами, и делать запасы воды в тканях нет необходимости.
Побеги и корни, развившиеся на эксплантах оси соцветия /. hybrida, I. ensata и /. sibirica имели исключительно эндогенное происхождение (табл. 20).
При сравнении динамики прохождения этапов гистогенеза и органогенеза в эксплантах трубки околоцветника у культиваров I. hybrida, I. ensata, I. sibirica в основном была отмечена их синхронность.
Нами установлено, что регенерационнои способностью обладала только адаксиальная сторона трубки околоцветника. При помещении экспланта на поверхность среды абаксиальной стороной, признаков регенерации не наблюдали за всё время культивирования. При гистологическом анализе отмечен разный уровень регенерационнои активности тканей внешней и внутренней стороны трубки околоцветника у всех изученных культиваров Z hybrida, I. ensata, I. sibirica. В субэпидермальных слоях адаксиальной стороны клетки паренхимы не утратили способности к меристематической активности. Именно здесь возникали полиады, из которых формировались множественные очаги деления и закладывались вегетативные побеги. На испытанных вариантах питательных сред с содержанием 4-8 мкМ БАП и 3-5мкМ НУК, отмечен геммогенез у всех изученных видов ириса.
У 100% сформированных побегов, вместо примордиев первых листьев, развивались структуры похожие на доли околоцветника. Со временем- эти структуры приобретали характерную для цветков данного сорта окраску.
Появление флоральных элементов в культуре эксплантов генеративных органов описано рядом авторов (Чуб и др., 1994; Вечернина и др, 1998; Болтенков, 2000; Алаторцева и др., 2001). Репродукция de novo элементов цветка устойчиво сохранялась у эксплантов трубки околоцветника всех изученных генотипов ириса не зависимо от концентрации фитогормонов в пределах опыта. Отмеченный феномен циклического воспроизводства генеративных структур может быть интерпретирован как результат экспрессии регуляторных генов, запускающих определённые морфогенетические процессы (рис. 61).
При дальнейшем культивировании эксплантов трубки околоцветника с целью получения активно пролиферирующей культуры, необходимо было изменить гормональный состав питательных сред, определяющим в этом являлось содержание цитокининов. В отношении гормонального состава генотипы ириса проявляли видовую специфичность. Чтобы получить нормально развитые побеги /. sibirica содержание БАП должно быть в пределах 5-7,5мкМ, для /. ensata - 15-17,5мкМ, для /. hybrida - 2,5мкМ. Отличием также явилось заложение гидроцитной системы у эксплантов /. hybrida сорт Jazzamataz, у /. sibirica сорт Berlin Ruffles и I. ensata гибрид 28-50-00 подобного явления не наблюдали (табл. 21).
