Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 9
1.1. Подрод Melanocrommyum: современная таксономия, морфология и географическое распространение 9
1.2. Традиционные методы размножения луков подрода Melanocrommyum.. 11
1.3. Биотехнологические подходы к размножению декоративных растений. 13
1.4. Органогенез in vitro: современные концепции компетенции, детерминации и дифференциации тканей 18
1.5. Методы размножения in vitro представителей рода Allium 26
Глава 2 Материалы и методы исследования 33
2.1. Объекты исследования и методы культивирования in vitro 33
2.2. Цитоморфологические и гистологические исследования 40
Глава 3 Биологические особенности видов подрода Melanocrommyum в условиях лесостепной зоны Западной Сибири 42
3.1. Природно-климатические условия района интродукции 43
3.2. Морфологическая характеристика A altissimum и A. giganteum 47
3.3. Сезонный ритм развития луков в условиях интродукции 48
3.4. Семенное и вегетативное размножение 51
Глава 4 Морфогенетические реакции различных типов эксплантов представителей подрода Melanocrommyum в культуре in vitro 54
4.1. Экспланты - семена 55
4.2. Экспланты - фрагменты луковиц с частью донца и почки возобновления 61
4.3. Экспланты - флоральные органы 67
Глава 5 Особенности регенерации побегов Allium altissimumb культуре in vitro из бутонов 76
5.1. Выявление маркеров для определения сроков изоляции бутонов 76
5.2. Гистологический анализ бутонов на начальных этапах культивирования (0-14 дней) 78
5.3. Процесс регенерации побегов A. altissimum in vitro 82
Выводы 88
Список литературы 90
Приложение 109
- Органогенез in vitro: современные концепции компетенции, детерминации и дифференциации тканей
- Природно-климатические условия района интродукции
- Экспланты - флоральные органы
- Процесс регенерации побегов A. altissimum in vitro
Введение к работе
Актуальность темы. Культура клеток высших растений представляет собой уникальную модель для исследования фундаментальных основ морфогенеза растений (Бутенко, 1999; Батыгина, 2000; Батыгина, Васильева, 2002). Морфогенетиче-ский потенциал растительной клетки проявляется в системах in vitro в более широком диапазоне, чем in vivo (Журавлев, Омелько, 2008), что позволяет использовать эти системы для решения широкого круга фундаментальных и прикладных задач.
Дикорастущие виды подрода Melanocrommyum Webb et Berth, рода Allium L., ценные лекарственные и пищевые растения, широко известны своими высокими декоративными качествами, позволяющими их использовать в ландшафтном дизайне и флористике. В условиях интродукции, их массовое размножение, как и многих других геофитов, осложнено особенностями жизненного цикла: растения из семян развиваются медленно и достигают генеративного состояния через 6-8 лет. Вегетативное размножение отсутствует или выражено слабо. У некоторых видов подрода в течение вегетационного периода материнская луковица может формировать одну, в редких случаях две дочерние. Использование методов культуры тканей растений позволяет не только решить проблему массового воспроизводства высоко декоративных луков, но и исследовать особенности процессов морфогенеза в условиях in vitro, что является одной из фундаментальных задач биологии развития.
Несмотря на значительное количество публикаций по клональному микроразмножению луков, большинство работ касается технологии массового воспроизводства ценных пищевых сортов Allium сера, A. sativum и др. (Martin-Urdiroz et al., 2004; Gantait et al., 2010). Исследования по микроразмножению декоративных видов подрода Melanocrommyum немногочисленны (Каменецкая, Рахимбаев, 1984; Inagaki et al., 1992; 1994; Susek et al., 2002). Данные о локализации инициальных клеток регенератов, их тканевой принадлежности, способности к детерминации и последующей дифференциации практически отсутствуют.
Цели и задачи исследования. Цель работы - выявление особенностей морфогенеза луков подрода Melanocrommyum в условиях in vitro и разработка эффективных технологий их клонального микроразмножения.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
изучить биологические особенности Allium altissimum и A. giganteum при интродукции в лесостепных условиях Западной Сибири;
разработать способы получения асептической культуры различных типов эксплантов (семян, фрагментов луковиц с частью донца и почки возобновления, флоральных органов) видов A. aflatunense, A. altissimum, A. decipiens, A. giganteum, A. karataviense, A. schubertii, A. sewerzowii;
определить оптимальные составы питательных сред и условия культивирования на всех этапах размножения in vitro;
изучить морфогенетические потенции различных эксплантов в зависимости от концентраций и комбинаций регуляторов роста;
выявить особенности процесса инициации и развития побеговых структур A. altissimum в культуре in vitro из флоральных тканей.
Защищаемые положения:
-
Наибольший морфогенный потенциал в культуре in vitro проявляют изолированные за 1-2 дня до раскрытия покрывала бутоны среднего яруса A. altis-simum, для выявления степени развития которых, можно использовать в качестве маркерного морфологический признак - длину столбика пестика.
-
Регенерация побегов A. altissimum при культивировании in vitro бутонов среднего яруса происходит из меристематического слоя, образующегося de novo из клеток эпидермы тычиночных нитей в области их срастания с листочком околоцветника.
Научная новизна. Впервые исследованы различные морфогенетические реакции изучаемых видов луков в зависимости от сочетания эндогенных и экзогенных факторов, включающих генотип растения-донора, тип исходного экспланта, сроки его изоляции, действие регуляторов роста, компонентов питательных сред, а также условий культивирования. Установлен диагностический признак развития женских репродуктивных структур A. altissimum -длина столбика пестика, служащий маркером для определения оптимальной стадии для введения бутонов в культуру ткани. Впервые выявлено стимулирующее действие ретарданта триапентинола на морфогенез луков в культуре in vitro из различных типов эксплантов. Впервые на основании цитоморфоло-гических и гистологических исследований проведено детальное изучение органогенеза in vitro побегов A. altissimum из флоральных органов на основе современных концепций компетенции, детерминации и дифференциации тканей.
Практическая значимость. Разработаны протоколы клонального микроразмножения 7 высоко декоративных видов подрода Melanocrommyum: A, afla-tunense, A. altissimum, A. decipiens, A.giganteum, A. karataviense, A. schubertii, A. sewerzowii, включающие способы стерилизации различных типов эксплантов, сроки введения в культуру in vitro, состав сред на всех этапах культивирования, условия адаптации ex vitro. Показано ускорение онтогенетического развития луков в условиях in vitro, что имеет важное значение для интродукции и селекции этих высоко декоративных видов. Полученные микроклоны поддерживаются в банке культур in vitro лаборатории биотехнологии ЦСБС.
Апробация работы. Основные результаты были представлены на I и II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006, 2008); VI Международной научно-практической конференции «Проблемы Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2007); 5th International Conference «Propagation of Ornamental Plants» (Sofia, Bulgaria, 2007); II (IV) Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2010); Международной конференции «Морфогенез репродуктивных структур и роль стволовых клеток в онтогенезе», посвященная 50-летию лаборатории эмбриологии и репродуктивной биологии Ботанического института им. Комарова РАН (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 350-летию г. Иркутска и 70-летию Ботанического сада
Иркутского государственного университета «Проблемы озеленения городов Сибири и сопредельных территорий» (Иркутск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 5 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 115 страницах, включает в себя 10 таблиц и 26 рисунков. Библиографический список включает 196 наименований, в том числе 162 на иностранных языках.
Органогенез in vitro: современные концепции компетенции, детерминации и дифференциации тканей
Новые структуры, такие как побеги, корни или эмбриоиды могут быть индуцированы в растительных тканях, не имеющих предсуществующих меристем (Thorpe, 1980). Органы, образовавшиеся de novo, называются адвентивными, процесс их формирования - адвентивным органогенезом, а в случае формирования эмбриоидов - соматическим эмбриогенезом (George et al., 2008).
Адвентивные меристемы теоретически могут возникнуть двумя различными путями:
прямым из дифференцированных клеток экспланта без промежуточной пролиферации недифференцированной ткани;
непрямым из неспециализированных, неорганизованных и дедифференцированных каллусных клеток или суспензионных культур.
Г.С. Хикс описал эти два способа регенерации как прямой и непрямой органогенез соответственно (Hicks, 1980). На практике не всегда удается различить эти два пути. Меристемы при прямой регенерации, из которых формируются побеги или соматические эмбриоиды, могут пролифелировать и формировать регенеративную ткань, похожую на каллус. Такие меристемы могут быть окружены дедифференцированным каллусом, поэтому бывает трудно определить путь морфогенеза. Напротив, меристемы побегов могут формироваться внутри каллуса, который связан с первичным эксплантом, или процессы каллусообразования и развития меристем побегов из поверхностных клеток экспланта могут происходить одновременно (Bigot et al., 1977).
Для индукции органогенеза de novo в культуре ткани необходим определенный баланс ауксинов и цитокининов (Skoog, Miller, 1957). Концептуально процесс органогенеза можно разделить на три основные фазы:
- на первой стадии клетки экспланта приобретают органогенную компетентность, определяемую как способность к реакции на гормональные сигналы;
- во время второй фазы происходит детерминация компетентных клеток для формирования примордиев органов под воздействием экзогенных регуляторов роста;
- третья стадия - собственно морфогенез, протекающий независимо от экзогенных регуляторов роста (Christianson, Warnick, 1983, 1984, 1985; Sugiyama, 1999; Zhang, Lemaux, 2004).
Компетенция и детерминация
Высокоспециализированные клетки интактных растений не способны к изменению своего дифференцированного состояния. Кроме того, существуют некоторые клетки, сохраняющие способность к делению, но тем не менее, не способные дать начало новым органам. Такие клетки считаются рекальцитратными (recalcitrant), то есть неподдающимися воздействию. Клетки, которые сохранили способность к клеточной дифференциации или регенерации, или приобретающие эту способность в ответ на определенный стимул, являются компетентными (George et al., 2008). Следовательно, компетентность может быть определена как состояние клеток, способных реагировать на внеклеточные сигналы (Christianson, Warnick, 1985).
Природа сигналов, определяющих компетенцию клеток, по-прежнему слабо изучена. Это может быть определенный уровень эндогенных фитогормонов в момент изоляции эксплантов или способность клеток к синтезу регуляторов роста или метаболитов, активизируемая под воздействием экзогенных регуляторов роста.
Ткани растений в значительной степени различаются по компетентности. Изменяя состав среды и комбинацию регуляторов роста, можно индуцировать регенерацию у рекальцитратных растений, однако для некоторых видов так и не было получено положительных результатов. Причина неудач, возможно, заключается в «молчании» определенных генов гетерохроматина (George et al., 2008).
В компетентных клетках и тканях воздействие регуляторов роста является сигналом для перехода клеток из стадии G0 клеточного цикла в G1 для дифференциации. В некоторых случаях требуется предобработка регуляторами роста, например, ауксиновый шок. Однако в рекальцитратных тканях гены, необходимые для перехода из стадии G0 клеточного цикла в G1 и затем из G1 в S, заблокированы в гетерохроматине и «молчат», пока не произойдет перехода последнего в эухроматин (Gahan, 2006).
Значительное влияние на прямую регенерацию органов или на способность клеток к калуссообразованию имеет происхождение экспланта. Интересные данные получены Г.Е. Стритом при изучении морфогенетического потенциала, различающихся морфологически каллусных линий, полученных из одного экспланта (Street, 1979). Автор предположил, что различия в морфогенной компетенции линий обусловлены их происхождением из разных слоев клеток или тем, что компетенция индуцируется только в определенных клетках. Следовательно, каллусные культуры могут состоять из морфогенно компетентных и некомпетентных зон.
Кроме того, возможно взаимное коррелятивное влияние соседних слоев клеток. Так, при культивировании интактных сегментов стебля Torenia fournieri субэпидермальная паренхима не показала органогенных потенций, в то время как из клеток, окружающих проводящие пучки, сформировались зачатки корней (Chlyah, 1974). Однако культивирование изолированных субэпидермальных клеток на подходящей среде позволило наблюдать регенерацию корней. Если использовали клетки двух слоев (эпидермы и субэпидермы) отмечали формирование примордиев побегов (Chlyah, 1974).
Детерминация определяется как состояние дифференциации, в которое переходят компетентные клетки, предварительно получившие внешний стимул. Если клетки экспланта в момент его изоляции еще не являются компетентными, они могут быть индуцированы in vitro с помощью определенной комбинации регуляторов роста (George et al., 2008).
Морфологическая детерминация, как было установлено, не действует по принципу «все или ничего». По данным Е.М. Атфилда и П.К. Эванса, чем дольше культивировать экспланты табака на среде, индуцирующей побегообразование, перед переносом на безгормональную среду, тем больше образуется побегов. В результате, по мнению авторов, либо больше клеток становится детерминированными, либо детерминированные клетки способны к пролиферации (Attfield, Evans, 1991).
Итак, развитие компетентности является первым шагом на пути к регенерации из одной или нескольких клеток. Клетки в их начальном состоянии либо имеют исходную способность к компетенции, либо лишены такой способности. Второй шаг - индукция детерминации компетентных клеток. Отдельные клетки или группа клеток становятся детерминированными, когда они необратимо следуют по определенному генетически-запрограммированному пути развития, например, регенерации, и будут следовать этой программе без дополнительных гормональных воздействий (Christianson, 1987).
Регуляторы роста и процессы регенерации
Определенное соотношение ауксинов и цитокининов является критическим фактором для индукции развития структур in vitro (Skoog, Miller, 1957; Christianson, Warnick, 1985). В ряде исследований доказано, что тип органа, формирующегося de novo, зависит и от концентрации экзогенных гормонов (Feher et al., 2002; Pasternak et al., 2002).
В литературных источниках приводится множество данных по методам индукции органогенеза для различных типов эксплантов. При этом оптимальные количества регуляторов роста, используемых для стимуляции органогенеза сравнительно велики. Уровни же ауксинов или цитокининов, проникших в клетки во время культивирования, по данным ряда исследователей существенно ниже (Gahan et al., 1995, 1996; Wang et al., 2001; Reuther et al., 1996; Ross, Zoglauer, 1998). При попытках определения количества эндогенных гормонов в эксплантах оказалось, что их уровень колеблется от фемтомолей (10"ЬМ) до пикомолей (10" "М) на единицу измерения (на 1 клетку или на 1мкг белка) в зависимости от типа экспланта (Gahan et al., 1995. 1996; Wyndadaele et al., 1988; Reuther et al., 1996). Однако такие измерения не отражают реального распределения регуляторов роста в клетках в зависимости от стадии клеточного цикла, хотя из данных П. Редига с соавторами известно, уровень цитокинина в значительной степени варьирует на разных стадиях клеточного цикла (Redig et al., 1996).
Регуляторы роста могут поступать в ткани апопластическим путем (по межклетникам) либо симпластическим путем (через цитоплазму клеток). По данным Л. Вонга с соавторами исходное перемещение цитокинина и ауксина в изолированных семядолях томата происходило обоими путями (Wang et al., 2001).
Природно-климатические условия района интродукции
Изучаемые растения поддерживаются в коллекции лаборатории гербарий ЦСБС СО РАН, расположенной в юго-восточной части Новосибирска (лесостепная зона, почвы дерново-подзолистые). Климат Новосибирской области носит черты резкой континентальности: продолжительная суровая зима и короткое, жаркое лето. Годовое количество осадков составляет 400-470 мм. Снежный покров держится 5- 6.5 мес.
Эффективной характеристикой климатических условий служит сумма положительных температур, являющаяся показателем ресурсов тепла, необходимого для роста и развития растений.
При сравнении метеорологических условий за 2008-2010 гг. в городе Новосибирске, нами отмечено, что в 2008 году сумма положительных температур в апреле составила 129.9, в 2009 г. в том же месяце - 138.5, в 2010 - 121.5. Самый высокий показатель за три года в мае был отмечен в 2008 г. - 387.5 , а самый низкий - в мае 2010 г. - 282.3, в июне в 2008 г. он составил 523, а в 2009 г. - 415.8, в июле 2008 г. - 636.3, в 2010 г. - 539.6 соответственно. На графиках приведены схемы изменения средних температур за 2008-2010 гг. (рис. 1, 2, 3).
Следовательно, из трех годов наблюдений 2008 и 2009 гг. близки по погодным условиям, а третий - 2010 г. оказался самый холодным.
Просвещение через средства массовой информации может помочь в расширении контактов социальных служб с обществом, например, через организацию социальной рекламы, показывающей и раскрывающей предоставляемые ими услуги. Такую стратегию профессионального поведения специалиста по социальной работе в контексте взаимодействия со СМИ можно обозначить как «поиск клиента», т.е. информирование потенциальных клиентов об услугах, которые предоставляет организация социальной службы. Эффективная программа установления контактов, рассчитанная на локальные/местные средства массовой информации, может помочь гражданам не только стать более осведомленными клиентами служб социальной защиты и социальной политики, но и более полно использовать ресурсы общества, которые могут быть им доступны.
Популяризация - это традиционные способы передачи специалистами по социальной работе социально-психологических знаний в современной и доступной форме для широкого круга людей через различные средства массовой информации. Например, популяризация психиатрических знаний и методов социальной реабилитации больных может способствовать современному обращению данной категории людей к врачам и другим специалистам; привлекает внимание различных представителей власти и общественных организаций к проблемам психического здоровья; способствует профилактике нарушений психического здоровья в обществе.
Многими специалистами по социальной работе отмечается, что в обществе возрастает количество людей, проявляющих определенную обеспокоенность состоянием своего физического и психического здоровья (данные факты, например, подтверждаются также возросшим количеством людей, проходящих профилактические осмотры в учреждениях здравоохранения) и готовых взять на себя ответственность за собственной физическое, социальное и психологическое благополучие.
Экспланты - флоральные органы
В работе использовали различные типы флоральных эксплантов: цветоложе соцветий, бутоны на разных стадиях развития, цветки.
Стерилизация соцветий
Стерилизацию проводили либо путем обжига в пламени спиртовки закрытого покрывалом соцветия (предварительно обработав его этанолом), либо используя в качестве стерилизующего агента 0.2% раствор хлорида ртути (II). При обжиге соцветия цветки, находящиеся близко под покрывалом, обгорали, что приводило к потере эксплантов. Использование раствора хлорида ртути (II) в качестве стерилизатора, по нашим данным, наиболее эффективно: после 7-9 минутной стерилизации выход асептических эксплантов составил 100%.
Морфогенныереакции цветоложа соцветий in vitro
После стерилизации закрытых покрывалом соцветий лука высочайшего с них снимали покрывало. Затем цветоложе соцветий разрезали на 4 части и высаживали на среды BDS без регуляторов роста (контроль) и дополненные регуляторами роста в различных комбинациях и концентрациях: 1-2 мг/л БАП и 1-2 мг/л НУК; 1-3 мг/л КН и 1-2 мг/л НУК; 1-3 мг/л КН. На среде без регуляторов роста не отмечено морфогенного ответа - экспланты темнели и не развивались. На средах с регуляторами роста уже через две недели отмечено появление почек, из которых через 5-6 недель формировались луковички-детки (рис. 12 а, б, в, г).
Далее луковички отделяли от экспланта и высаживали на среду BDS, дополненную 1 мг/л ТП. Коэффициент размножения составил 3-8 регенерантов на один эксплант.
По нашим данным наибольшее количество луковичек образовывалось на среде с БАП и НУК в равных концентрациях. На среде с добавлением КН в испытанных концентрациях наблюдали образование морфогенного и неморфогенного каллусов.
Влияние регуляторов роста на прямой органогенез побегов из бутонов
В качестве следующего типа экспланта использовали бутоны на разных стадиях развития, извлеченные из закрытого покрывалом соцветия у A. altissimum, A. giganteum и A. karataviense.
Известно, что у исследуемых видов луков наблюдается ярусная разновозрастность цветков (рис. 13). Визуально нами выделено три яруса: верхний, средний и нижний.
После стерилизации бутоны изолировали из разных ярусов соцветий (рис. 15, а) и инокулировали на питательные среды, содержащие цитокинины и ауксины в различных концентрациях и комбинациях (табл. 10).
Через 3-10 дней культивирования из бутонов формировались цветки: из бутонов верхнего яруса, находящихся на более поздней стадии развития, через Ъ-А дня, из бутонов среднего яруса - через 7-8 дней, и, в единичных случаях, из бутонов нижнего яруса - через 9-10 дней (рис. 15, б).
Характерно, что в условиях культуры листочки раскрывшихся околоцветников у A. altissimum и A. giganteum приобретали свойственную виду фиолетовую окраску (рис. 14, а, б). У цветков верхнего яруса значительно удлинялись тычиночные нити, вынося пыльники выше околоцветника, в отличие от цветков среднего яруса, у которых тычинки оставались сравнительно короткими. Бутоны нижнего яруса после помещения на питательную среду, как правило, оставались без изменения и в дальнейшем погибали.
Через две-три недели культивирования бутонов на питательной среде BDS с регуляторами роста отмечали разрастание тканей в нижней части цветка в области срастания тычинок и листочков околоцветника (рис. 15, в, г). Следует заметить, что у A. giganteum эту морфогенную реакцию наблюдали на 4-5 дней позже, чем у луков высочайшего и каратавского. К третьей неделе у лука высочайшего в зоне срастания тычиночных нитей и листочков околоцветника появилось большое число почек (рис. 15, г). Пересадка эксплантов на среду для дифференциации (BDS + 2.0 мг/л ТП) приводила к активному развитию сформировавшихся регенерантов и интенсивному росту их листьев (рис. 15, д).
При сравнении данных по влиянию регуляторов роста на индукцию побегообразования исследуемых видов через 4 недели культивирования установлено, что наиболее активно регенерация побегов происходила из бутонов среднего яруса (табл. 10). Бутоны верхнего и нижнего ярусов показали невысокую морфогенную активность. При этом отмечается видоспецифичность реакций на гормональное воздействие, которые наиболее выражены у лука высочайшего на средах BDS, содержащих различные концентрации и комбинации регуляторов роста. Оптимальным вариантом оказалось использование БАП и НУК в равных концентрациях (2 мг/л), при котором образовалось в среднем 8.3 побегов на эксплант.
Использование этой же комбинации регуляторов роста было эффективным и для лука каратавского, хотя количество образовавшихся побегов было существенно ниже (в среднем 3.0 побега на эксплант). Бутоны лука гигантского оказались менее отзывчивы на действие испытанных регуляторов роста (табл. 10). Наилучший морфогенный ответ получен на среде BDS, содержащей БАП 1 мг/л и НУК 1 мг/л. Увеличение концентрации НУК в этой комбинации до 2 мг/л снижало побегообразование, а при использовании БАП 2 мг/л и НУК 1 мг/л образовались единичные побеги из бутонов верхнего яруса.
Через 9 недель культивирования при переносе на безгормональную среду, способствующую удлинению побегов, на одном экспланте можно наблюдать многочисленные частично этиолированные побеги, находящиеся на разных стадиях развития, и формирование луковичек-деток (рис. 15, е).
Процесс регенерации побегов A. altissimum in vitro
С помощью стерео- и сканирующей микроскопии через 2 недели культивирования наблюдали пролиферацию тканей и появление первых почек (рис. 22, а, б). Гистологический анализ цветков показал, что в области срастания тычинок и околоцветника происходит пролиферация клеток и в течение 2 недель формируется меристематическая ткань (рис. 23).
После 4 недель в этой зоне начинается активный органогенез (геммогенез) - формирование апикальной меристемы побега и заложение листовых примордиев (рис. 24, а). Примордий первого листа формируется в виде валика, занимающего большую часть периферической зоны апекса побега (рис. 24, б), что свидетельствует об образовании нормального чешуевидного листа, характерного для данного вида. В этот период на одном экспланте можно наблюдать многочисленные этиолированные побеги, находящиеся на разных стадиях развития (рис. 25).
Пересадка эксплантов на среду для дифференциации (BDS + 2.0 мг/л ТП) приводила к активному развитию сформировавшихся регенерантов и интенсивному росту их листьев, приобретающих на свету зеленую окраску и выполняющих ассимиляционную функцию. При этом влагалища листьев оставались бесцветными, утолщались, начиная выполнять запасающую функцию. В результате всех этих процессов формируются небольшие луковички (рис. 26), внешне сходные с дочерними луковичками, формирующимися у растений in vivo (Полубоярова и др., 2011).
В настоящей работе проведены детальные исследования органогенеза in vitro побегов лука высочайшего на основе современных концепций компетенции, детерминации и дифференциации тканей, согласно которым, процесс органогенеза можно разделить на три основные стадии. На первой стадии клетки экспланта приобретают органогенную компетентность, определяемую как способность реагировать на гормональные сигналы. Затем на второй стадии компетентные клетки под влиянием экзогенных регуляторов роста детерминируются для формирования примордиев определенных органов (побегов или корней), и, наконец, третья стадия -морфогенез органов in vitro (Christianson, Warnick, 1983, 1984, 1985; Sugiyama, 1999; Yancheva et al., 2003; Zhang, Lemaux, 2004).
Установлено, что наблюдаемые гистологические и цитоморфологические изменения в процессе формирования побегов характеризуются определенными временными параметрами. Поскольку эпидермальные клетки интактного растения обычно делятся антиклинально, периклинальные и наклонные деления этих клеток указывают на изменения полярности клеток, что, возможно, является сигналом начала процесса их дедифференциации (Lo et al., 1997). По нашим данным в течение 3-5 дней культивирования под влиянием регуляторов роста (2 мг/л БАП и 2 мг/л НУК) клетки эпидермы тычиночной нити в области срастания ее с листочком околоцветника становятся компетентными, затем происходит их дедифференциация, и они приобретают способность к меристематической активности. Успешность прохождения этой стадии зависит от комбинации регуляторов роста и их концентрации, а также сроков взятия бутонов, используемых в качестве эксплантов. Изучая органогенную компетентность различных органов и тканей лилий, было установлено, что для индукции органогенеза побегов из бутонов наиболее эффективно добавление НУК и БАП (Verron et al., 1995). Указанные физиологически активные вещества в равной концентрации были использованы в настоящем исследовании. Подобные реакции эпидермальных и субэпидермальных клеток эксплантов на воздействие БАП отмечены у хвойных (Villalobos et al., 1984; Von Arnold, Gronroos, 1986; Saravitz et al., 1993), а также у Begonia rex (Chlyah, Tran Thanh Van, 1974).
Формирование меристематических центров, по полученным нами данным, происходит с 3 по 14 день. Следует отметить, что они формируются только в зонах срастания тычиночных нитей и листочков околоцветника, где наблюдается образование складки. В других зонах, в которых также образуются складки - например, между тычиночной нитью и завязью эпидермальные клетки не обладают способностью к дедифференциации и образованию побегов. По всей видимости, близость проводящего пучка в области срастания тычиночной нити и листочка околоцветника значительно стимулирует меристематическую активность клеток эпидермы тычиночной нити. Эти наблюдения о сопряженности процессов деления клеток с поступлением веществ через проводящие пучки согласуются с данными К.К. Шарма и С.С. Бхойвани, изучавшими дифференциацию побегов из семядолей Brassica Juncea (L.) Czern. (Sharma, Bhojwanii, 1990).
Стадия детерминации, проявляющаяся в формировании конусов нарастания, образовании адвентивных листовых примордиев в виде валиков протекает с 14 по 28 день. К концу этого срока отмечена регенерация первых вегетативных побегов. Дальнейшее их развитие и формирование луковичек, то есть стадия морфогенеза, происходит под влиянием ретарданта ТП с 28 по 42 день. Стимулирующее действие данного вещества на органогенез регенерантов A. altissimum показано впервые.
Таким образом, исследование процесса морфогенеза у A. altissimum в культуре in vitro с использованием бутонов среднего яруса в качестве эксплантов выявило, что новые органы - побеги - формируются в результате прямого органогенеза в меристематическом слое, образующемся de novo из клеток эпидермы тычиночных нитей в области их срастания с листочком околоцветника.
