Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
Глава 2. Материал и методы исследования 53
Глава 3. Результаты собственного исследования
3.1. Врожденный гидронефроз 60
3.2 Варикоцеле 80
3.3.Гипоспадия 99
3.4 Постнатальный васкулогенез и ангиогенез 103
Глава 4. Обсуждение результатов исследования
4.1. Врожденный гидронефроз 106
4.2. Варикоцел е 120
4.3. Гипоспадия 132
4.4. Возможность развития постнатального васкулогенеза 136
Заключение 141
Выводы 143
Список литературы 146
- Варикоцеле
- Постнатальный васкулогенез и ангиогенез
- Варикоцел
- Возможность развития постнатального васкулогенеза
Варикоцеле
В норме, у взрослых людей, процесс ангиогенеза характеризуется умеренной активностью, а его усиление провоцируется повреждением тканей и последующей репарацией. Следует отметить, что наиболее детально и подробно ангиогенез изучен и описан при опухолевом росте, стромообразовании в опухолях и процессе метастазирования. Что же касается заболеваний мочеполовой системы, то оба существующих механизма образования сосудов органов этой сферы, их возможные нарушения в виде дизангиогенеза, а также их взаимосвязь с пороками развития на органном уровне до настоящего времени оставались вне зоны пристального внимания морфологов.
Ренальные васкуло- и ангиогенез могут происходить одновременно, являясь следствием четко регулируемой программы развития, которая определяется факторами роста – компонентами экстрацеллюлярного матрикса, а также их взаимодействием с мембранными рецепторами; оба они могут принимать участие в формировании интрапаренхиматозных почечных сосудов [103].
Процесс созревания органов мочеполовой системы и нефрогенеза в частности, является одним из самых сложных в эмбриогенезе и требует выработки широкого спектра факторов роста, обеспечивающих сложные клеточные взаимодействия.
Факторы роста могут продуцироваться самыми разными клетками, в том числе и неспециализированными, находящимися во всех тканях. Связываясь с рецепторами, находящимися на поверхности клеток-мишеней, они могут обеспечивать сложные процессы пролиферации, дифференцировки, миграции клеток посредством эндокринной, паракринной и аутокринной регуляции [25].
Как уже упоминалось выше, VEGF – член семейства тромбоцитарного фактора роста – является специфическим митогеном для эндотелиальных клеток, он способствует их появлению, выживанию, пролиферации и дифференцировке, ингибирует апоптоз эндотелия. Кроме того, ряд авторов указывают на то, что VEGF обеспечивает созревание и пролиферацию тубулярного эпителия – нефроцитов [129, 203]. Он продуцируется большим количеством клеток, за исключением самих эндотелиальных. Можно говорить о том, что в процессе эмбриогенеза именно VEGF играет ключевую роль в дифференцировке эндотелиальных клеток из клеток-предшественниц (C-EPC и BM-EPC) и генерации новых сосудов, обеспечивая таким образом васкулогенез, также он обеспечивает «врастание» новообразованных капилляров из предсуществующих зрелых сосудов, что является проявлением ангиогенеза [85, 176, 203]. Кроме того, следует обратить внимание и на молекулярные механизмы, лежащего не только в основе VEGF-VEGFR взаимодействия, а также и VEGF-независимой регуляции ангиогенеза [184], что также является существенным для эмбрионального васкуло- и ангиогенгеза.
Таким образом, оба этих процесса – как васкуло-, так и ангиогенез – напрямую зависят уровня экспрессии VEGF; более того, как уже упоминалось выше, он является и необходимым условием и для эмбриогенеза в целом.
Экспрессия VEGF обнаруживается на капиллярах клубочков как фетальных, незрелых, так и уже полноценно сформированных почек. Интересным является тот факт, что у трансгенных мышей и крыс была выявлена экспрессия рецепторов тирозинкиназы: VEGF R-1/FLT-1 и VEGF R-2/FLK-1 (маркеры клеток-предшественниц эндотелия) в эмбриональных почках при отсутствии явных сформированных сосудов, тогда как экспрессия VEGF при этом отсутствовала [143, 203].
Другой фактор роста – СD34 также активно курирует процессы формирования сосудов; он является панэндотелиальным маркером и экспрессируется на эндотелиальных клетках, в том числе и на фенестрированном эндотелии гломерул. Однако, в процессе дифференцировки или «созревания» эндотелиальных клеток гломерулярных капилляров они постепенно лишаются иммунной окраски CD34. В целом, СD34+ клетки «обогощают» популяцию клеток, заинтересованных в процессе неоваскуляризации; некоторые авторы указывают на их важную поддерживающую роль в образовании сосудов [179]. Определение скоплений СD34+ клеток предполагает существование зоны васкулогенеза, которая может служить источником как эндотелиальных, так и гладкомышечных клеток [144, 227]. Для характеристики сократительной способности гладкомышечных клеток сосудистой стенки используется ИГХ реакция на присутствие в клетках -SMA – протеина, играющего основную роль в генерации мышечных сокращений и обеспечивающего достаточную силу сокращения гладкомышечных клеток. -SMA определяется и в некоторых немышечных клетках, в частности в миофибробластах, находящихся в периваскулярном пространстве [209]; появление таких -SMA-позитивных миофибробластов некоторые авторы связывают с прогрессированием хронических почечных заболеваний [218]. Миофибробласты рассматриваются как дериваты нефроцитов (тубулярного эпителия), появляющиеся в процессе изменения фенотипа, то есть перехода клеток эпителиального происхождения в мезенхимальные – так называемой эпителиально-мезенхимальной трансформации. Этот процесс можно разделить на несколько этапов, которые прослеживаются на электронномикроскопическом уровне: нарушение адгезии эпителиальных клеток; изменение актинового цитоскелета и начало экспрессии -SMA; разрыв тубулярной базальной мембраны; отделение клеток от базальной мембраны, их миграция через участки повреждения и последующая «инвазия» в интерстиций [141]. Такая трансдифференцировка тубулярных эпителиальных клеток в миофибробласты играет важную роль в прогрессировании ренального фиброза [153, 157, 162].
Постнатальный васкулогенез и ангиогенез
В другом наблюдении – в почке ребенка, прооперированного в возрасте 1 месяца, при гистологическом исследовании также отмечено гроздьевидное расположение гломерул, вблизи которых обнаруживались группы недифференцированных канальцев, выстланных крупным кубическим эпителием; в некоторых крупных канальцев недифференцированные нефроциты формировали структуры типа «сосочков» (рис.23). Вблизи крупных фокусов склероза интерстиция были обнаружены гигантские канальцевые кисты, заполненные белковыми массами (рис.24). Артерии всех калибров имели извитой ход, наблюдалось нарушение их топографии (рис.25,26). Кроме того, найдены признаки выраженного нарушения строения сосудистых стенок дуговой и междолевой артерии, афферентных артериол в виде утолщения и разволокнения их стенок с дезориентацией пучков ГМК и нарушением целостности внутренней эластической мембраны.
В биоптатах ЛМС выявлена атрофия хаотично ориентированных ГМК, чередующихся с мощными пучками коллагеновых волокон (рис.27,28). Кроме того, в стенке прилоханочного отдела мочеточника часто обнаруживалась выраженная дезорганизация всех слоев мышечной оболочки с дистопией мышечных пучков в адвентицию; перечисленные изменения сопровождались диффузным выраженным склерозом всех слоев стенки. Таким образом, светооптическое исследование выявило у этих детей «экстремальную» незрелость почечной ткани в сочетании с признаками дизангиогенеза.
При проведении ИГХИ определялась крайне слабая экспрессия VEGF в гломерулярном эндотелии и нефротелии зрелых проксимальных и дистальных канальцев, слабая в ГМК артерий различного диаметра (рис.29).
Отмечена выраженная экспрессия TGF1 в незрелом кубическом эпителии недифференцированных канальцев (рис.30), а также его мозаичная экспрессия в виде мелких гранул в нефроцитах собирательных трубочек, нефротелии гломерулярных кист, эндотелии капилляров гломерул и в клетках интерстиция, особенно в очагах воспалительной лимфогистиоцитарной инфильтрации. Кроме того, отмечена его слабая экспрессия на гладкомышечных клетках артерий различного калибра. Что же касается рецепторов данного фактора – TGF1 R1, то выявлена его выраженная экспрессия на крупном кубическом эпителии недифференцированных канальцев и более слабая экспрессия на нефроцитах канальцев мозгового слоя, ГМК стенок артериол и на уплощенном эпителии, выстилающем канальцевые и гломерулярные кисты (рис.31). В тех же структурах имело место более интенсивное окрашивание TGF1 R2.
Отмечена выраженная экспрессия -SMA на ГМК стенок артерий различного диаметра с признаками кинкинга и синусоидно расширенных вен, также имеющих извитой ход (рис.32). CD34 определялся преимущественно на перитубулярных сосудах. Коллаген III типа обнаружен в зоне перитубулярного склероза, фибронектин – в «лучах» мозгового слоя и очагово в интерстиции. Оба этих фактора экспрессировались в стенке лоханки. Что же касается коллагена IV типа, то выраженная его экспрессия была обнаружена нами в лишь в базальной мембране атрофично измененных канальцев и канальцевых кистах. Выраженные морфологические изменения в этой группе больных сочетались с высокими значениями мочевого TGF – 209.3+/-34.7pg/ml.
Для более детального анализа процесса дизангио- и нефрогенеза было предпринято электронномикроскопическое исследование (ЭМ) биоптатов почек детей всех групп (17 из первой группы, 12 из второй и 5 из третьей группы), включая удаленные нефункционирующие почки у детей первых дней и месяцев жизни, поскольку именно на ультраструктурном уровне можно достоверно подтвердить как признаки незрелости компонентов паренхимы почки, так и наличие сосудистой мальформации.
У детей первой группы были обнаружены признаки сосудистой мальформации, однако часть сосудов сохраняла нормальное строение. Имело место нарушение строения стенок артериол – часто базальная мембрана имела неравномерную толщину; ГМК мышечного слоя распределялись хаотично (рис.33). В большинстве артерий мелкого калибра определялась плохо сформированная внутренняя эластическая мембрана, наружная отсутствовала. Компоненты почечной паренхимы имели признаки незрелости: в некоторых гломерулах просветы капиллярных петель сосудистого клубочка визуализировались плохо или вообще не определялись, присутствовали группы хаотично расположенных крупных недифференцированных клеток (рис.34). В тех клубочках, где капиллярные петли были сформированы, их базальная мембрана имела вариабельную толщину, четкое ее деление на слои отсутствовало, отмечалась разреженность слоев. Часто перечисленные изменения встречались в различных участках капиллярных петель одного сосудистого клубочка. Эндотелиальная выстилка была представлена высокими и крупными (плохо дифференцированными) клетками.
Варикоцел
Как известно, основным клиническим методом обследования больных ВЦ является визуальный метод с оценкой степени асимметрии мошонки и контурировании расширенных вен через кожу мошонки. Пальпаторное исследование дает возможность оценить размер яичек и их придатков, степень выраженности расширения вен семенного канатика и локализацию патологических изменений. Важным подтверждением полученных данных являются результаты цветного допплеровского картирования, позволяющего оценить степень васкуляризации гонад и определить ИР яичек, который является показателем периферического сопротивления сосудов. Чекмарев В.Н. [42] в своих рекомендациях также указывает на необходимость предоперационного ультразвукового доплеровского исследования, которое позволяет оценить как состояние сосудов всего тестикулярного бассейна, так и наличие стеноза левой почечной вены, что оказывает существенное влияние на послеоперационное течение заболевания.
Данные ультразвукового исследования позволили дать оценку внутриорганному кровоснабжению гонад по показателям ИР, зависящим от периферического сопротивления сосудов. Так, снижение ИР происходило параллельно нарастанию клинической симптоматики и было наиболее значительным у детей с третьей степенью ВЦ. Данные изменения связаны не только с расширением вен при варикозе, но и с нарастанием ригидности их стенок (особенно вен второго типа) за счет склероза, что сопровождается конгестивными расстройствами кровообращения, нарушением кровоснабжения яичек и снижением их функционального состояния, а также и развитием изменений атрофического характера. У всех детей, независимо от степени выраженности заболевания, вены первого типа имели крупный диаметр; утолщенные стенки были выявлены в венах первого и третьего типов в виде фокальной или диффузной 128 гипертрофии наружного продольного слоя. Вены второго типа имели тенденцию к истончению стенки и появлению участков склероза по мере увеличения тяжести ВЦ. Однако, в большинстве биоптатов вены третьего типа сохраняли обычную структуру – на их стенках формировались фиброзно-мышечные «валики», основная функция которых, как мы показали выше, заключена в обеспечении компенсаторного процесса, а именно в улучшении кровообращения при местном нарушении гемодинамики. Наибольшие структурные изменения стенок вен выявлены у детей с третьей степенью ВЦ, но даже в этих случаях в биоптатах определялись сосуды, сохранившие типичную структуру и способные нормально функционировать – в основном это вены третьего типа.
Нарастание изменений в стенках именно этих сосудов могут приводить к нарушению функционирования вен других типов. Естественно, при оперативном вмешательстве удаляется весь «пучок» вен, куда попадают и сосуды, изменения в которых часто не носят критического характера (вены первого и особенно третьего типа), за счет чего не только нарушается отток крови, но и уничтожается возможность использования данных вен в компенсаторном процессе. При этом, как уже было отмечено выше, в стенках вен этих типов нами были обнаружены признаки адаптивного ответа на нарушение циркуляции в виде их утолщения за счет гипертрофии ГМК, наличия в просветах многочисленных «валиков». Следует подчеркнуть, что во всех биоптатах были выявлены сосуды артериального типа, начиная с артериол и заканчивая более крупными стволами артерий мышечного типа с хорошо сформированными стенками. Таких сосудов в одном биоптате могло быть несколько. Если учесть и попутное иссечение артерий разного калибра, обеспечивающих питание гонады, можно с уверенностью утверждать – оперативное вмешательство усугубляет уже в какой-то степени нарушенное, но до настоящего времени частично компенсированное кровоснабжение яичка, что указывает на необходимость тщательного предоперационного обследования больного с 129 учетом всей клинической симптоматики. Гипотрофия и атрофия яичка после проведенного оперативного вмешательства по коррекции ВЦ представляет собой самое грозное осложнение, однако, в силу отдаленности последствий, истинная его частота остается неизвестной. Считается, что это достаточно редкое осложнение – развивается в 2-х случаях на 1000 прооперированных больных, однако оно является крайне неприятным для молодых пациентов [6].
Таким образом, по нашему мнению, вопрос о необходимости оперативного лечения детей с I-II-ой степенью ВЦ остается дискутабельным; при этом даже в тех случаях, когда имеют место начальные признаки склероза, венозная система еще может частично компенсировать нарушенный кровоток.
Следовательно, первопричиной развития ВЦ нужно считать нарушение формирования v.spermatica sinistra, когда вместо одного крупного ствола образуется сеть вен с различными морфологическими характеристиками – проявление сосудистой мальформации. По мере прогрессирования заболевания в начале наблюдается развитие компенсаторных процессов прежде всего в венах третьего типа в виде утолщения их стенок за счет гипертрофии ГМК и появления хорошо сформированных, часто многочисленных фиброзно-мышечных «валиков» на их внутренней поверхности. Увеличение количества коллагеновых и эластических фибрилл на фоне небольшого утолщения стенки также способствует улучшению кровотока наравне с гипертрофированными ГМК, поскольку они усиливают каркас стенок вен. В дальнейшем наблюдается тенденция к уменьшению количества этих волокон, их фрагментация, что объясняет ригидность стенок вен при варикозе в противоположность к венам нормального строения, и, в конечном счете, приводит к дилатации их просветов. Эта прогрессирующая дестабилизация характерна для ВЦ.
Возможность развития постнатального васкулогенеза
Различные послеоперационные осложнения при реконструктивных операциях, проводимых по поводу гипоспадии, развиваются довольно часто. В отечественной и зарубежной литературе разброс данных значителен и их частота варьируется от 10% до 60%. Согласно результатам нашего совместного исследования [40], частота развития послеоперационных осложнений при «передней» форме гипоспадии составила 5%; при «средней» – уже 12%, а при «задней» форме достигла 36,6 %. Следует упомянуть, что достаточно высокий процент осложнений, особенно при «средней» и «задней» формах заболевания, имел место несмотря на применение современной одноэтапной методики проведения оперативной коррекции. К типичным послеоперационным осложнениям можно отнести: формирование кожно-уретеральных свищей (наиболее частый вариант), развитие стриктур, дивертикулов неоуретры или ее лизис, расхождение краев раны, некроз лоскутов, уретриты, рецидив искривления полового члена [40]. В качестве причины их развития обычно выступает воспалительный процесс и нагноение послеоперационной раны, а также и дефицит трофики тканей.
Согласно клиническим данным, дети с «передней» и «средней» формами гипоспадии в целом благоприятно перенесли послеоперационный период. В среднем заживление раны происходило на 7, максимум на 10 день после оперативного вмешательства. Наибольший процент осложнений развивался как раз при «задней» форме: отмечалось частое (примерно в 30% случаев) формирование уретеральных свищей; при этом заживление мелких свищей наблюдалось лишь на 12-19 день после операции, более крупные требовали месяцы долечивания.
Традиционно, с точки зрения практикующего хирурга, больший процент послеоперационных осложнений при «задней» форме гипоспадии объясняется техническими сложностями операции, связанными с тяжестью этого порока развития и дефицитом пластического материала. Однако, согласно полученным нами данным, развитие осложнений у детей этой группы можно объяснить как скудным кровоснабжением препуция с ишемизацией тканей, так и наличием выраженной воспалительной инфильтрации и эффектом «псевдоваскуляризации».
Формирование свищей после операции пластики уретры при «задней» форме гипоспадии, скорее всего, следует рассматривать как осложнение самого заболевания, а не как осложнение оперативного лечения, поскольку нарушение местного ангиогенеза, напрямую сопряженное с различными формами гипоспадии, оказывает непосредственное влияние на развитие осложнений. Существенную роль в благоприятном течении послеоперационного периода играет васкуляризации дермы; сделанные нами выводы согласуются с данными других авторов [170, 174]. Степень васкуляризации тканей, то есть, суммарная площадь просветов артерий, вносит коррекцию в процесс заживления послеоперационной раны; достаточная васкуляризация препуция, но лишь при отсутствии выраженной воспалительной реакции, является одним из критериев благоприятного исхода послеоперационного периода. Таким образом, наличие воспалительного компонента, стимулирующего патологический ангиогенез, рассматривается как отягчающий фактор, вызывающий развитие осложнений. Негативная роль воспаления в препуции подтверждается быстрым заживлением послеоперационной раны у детей с «передним» типом гипоспадии, когда недостаточная, по сравнению с группой контроля, васкуляризация дермы не оказала существенного отрицательного эффекта на этот процесс; при этом воспалительная инфильтрация в биоптатах практически отсутствовала.
У части детей с «задней» формой гипоспадии и недостаточной маскулинизацией гениталий отмечено выраженное недоразвитие кожи крайней плоти и ствола полового члена. Исходя из этого, им был проведен месячный предоперационный курс аппликации препаратами андрогенов: 133 дигидротестостероновым гелем или смесью эфиров тестостерона – омнадреном. К сожалению, не было возможности получения повторного биоптата с последующей морфологической оценкой кровоснабжения препуция; положительное влияние данной методики на течение послеоперационного периода основывается лишь на клинической симптоматике, подтверждающей благополучный исход лечения [40]. Согласно полученным результатам, применение андрогенов в предоперационном периоде у этих детей привело к увеличению размеров полового члена: его длина в среднем возросла на 1,2см, а крайней плоти – на 0,8см, что позволило устранить дефицит пластического материала и облегчить проведение операции. По сравнению с детьми с «задней» формой гипоспадии, не получавшими местную гормональную терапию в предоперационном периоде, частота развития кожно-уретеральных свищей в этой группе пациентов была ниже почти на 15%. Это можно объяснить тем, что местное применение андрогенов стимулировало процесс ангиогенеза и васкуляризацию дермы кожи полового члена за счет анаболического эффекта тестостерона, экспрессии VEGF и прямого воздействия на эндотелиальные клетки [194], то есть, способствовало улучшению репарации тканей в послеоперационном периоде.
Анализ данных, полученных после морфологического исследования и сравнение их с показателями стимулированного тестостерона дал возможность отметить слабую положительную корреляцию между степенью васкуляризации кожи препуция и уровнем стимулированного тестостерона. Исследование гормонального профиля на основании теста с ХГЧ дает возможность определения базальных и стимулированных сывороточных уровней андрогенов.
