Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Классификация лейкоплакии СОР 10
1.2. Экспрессия белков опухолевого роста при ЛП и ПР СОР 13
1.2.1. Маркер пролиферации Ki-67 13
1.2.2. Экспрессия белка Р53 15
1.3. Экспрессия белков цитоскелета при ЛП и ПР СОР 17
1.4. Экспрессия белков межклеточной адгезии при ЛП и ПР СОР 21
1.4.1. Белки плотных контактов - клаудины 22
1.4.2. Белки прикрепляющих контактов 24
1.4.2.1. Экспрессия Е-кадгерина 24
1.4.2.2. Экспрессия бета-катенина 26
1.5. Экспрессия белков, участвующих в опухолевой инвазии в СОР 28
1.5.1. Коллаген IV типа 28
1.5.2. Матриксные металлопротеиназы 30
Глава 2. Материал и методика исследования 33
2.1. Иммуногистохимический метод 34
2.2. Статистический метод 39
Глава 3. Собственные исследования 40
3.1. Гистологическая характеристика неизмененного эпителия СОР 40
3.2. Гистологическая характеристика ЛП СОР 42
3.3. Гистологическая характеристика ПР СОР 44
3.4. ИГХ характеристика ЛП и ПР СОР 47
3.4.1. Экспрессия Ki-67 47
3.4.2. Экспрессия Р53 57
3.4.3. Экспрессия белка СК8 63
3.4.4. Белки межклеточной адгезии 69
3.4.4.1. Экспрессия белка клаудина -1 69
3.4.4.2. Экспрессия белков Е-кадгерина и бета-катенина 76
2 3.4.5. Экспрессия коллагена IV и ММР-9 при ЛП с акантозом и ПР СОР 87
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 96
Выводы 106
Практические рекомендации 108
Литература
- Экспрессия белков опухолевого роста при ЛП и ПР СОР
- Белки прикрепляющих контактов
- Статистический метод
- Экспрессия белка клаудина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Лейкоплакия (ЛП) - заболевание, характеризующееся патологическим ороговением слизистой оболочки рта (СОР) или красной каймы губ, возникающее в ответ на хроническое экзо- и эндогенное раздражение (Рабинович И.М. и др., 2007). Наряду с эритроплакией, красным плоским лишаем, дискоидной красной волчанкой лейкоплакия СОР рассматривается как предраковое заболевание (Neville B.W. et al., 2002; Thomas G. et al., 2003; Santos-Garcia A. et al., 2005). Определенные виды ЛП могут трансформироваться в плоскоклеточный рак СОР (Rosin М.Р. et al., 2000). Злокачественная трансформация отмечается от 2% до 36% случаев в зависимости от гистологического строения ЛП СОР (Зиновьев А.С. и др., 1999; Lee J.J. et al., 2000; Kim J. et al., 2001; Santos-Garcia A. et al., 2005).
Существует несколько классификаций лейкоплакии СОР, в основе которых лежат клинико-морфологические особенности. Общепринятой является классификация А.Л. Машкилейсона (1970), согласно данной классификации выделяют простую, веррукозную (бляшковидную и бородавчатую) и эрозивно-язвенную формы. В 2005 г. ВОЗ была принята новая классификация заболеваний головы и шеи, в которой вводится понятие «эпителиальный предрак» (Warnakulasuriya S. et al., 2007), к нему относятся лейкоплакия и эритроплакия СОР. Гистологически ЛП СОР была разделена на следующие виды: шюскоклеточная гиперплазия (ЛП без атииии), низкая степень дисплазии, средняя степень дисплазии и высокая степень дисплазии. Для последних трех видов ЛП было введено понятие плоскоклеточная внутриэпителиальная неоплазия (Squamous Intraepithelial Neoplasia - SIN) от 1 до 3 в зависимости от тяжести дисплазии (Barnes L. et al, 2005).
В обеих классификациях достаточно четко отображены особенности каждого этапа злокачественной трансформации эпителия СОР. Однако даже при наличии клинических и гистологических данных оценить стадию малигнизации практически бывает сложно (Явишева Т.М., Ягубов А.С, 2000; Bouquot J. Е. et al., 2006). Поэтому необходимо найти дополнительные диагностические критерии, позволяющие более точно определить степень дисплазии эпителия при лейкоплакии СОР.
Для ранней диагностики предраковых состояний в настоящее время можно использовать иммуногистохимические маркеры. К их числу относятся: маркер пролиферации клеток Ki-67, белок Р53, белки клеточной адгезии и опорные белки клеток, однако диагностические критерии экспрессии подобных белков при лейкоплакии СОР мало изучены. Наиболее часто с этой целью используются белки Ki-67 и Р53. При увеличении степени дисплазии их количество в эпителии СОР возрастает (Kushner J. et al., 1997), однако данных
для диагностики вида лейкоплакии бывает не достаточно. Особое внимание следует уделить белкам клеточной адгезии в опухолевом развитии и прогрессировании (Hirohashi S., Kanai Y., 2003). Имеются данные об изменении экспрессии этих белков при ПР СОР (Thomas G.J., Speight P.M., 2001), но их значение в процессе неопластической трансформации СОР остается недостаточно изученным.
Одной из характеристик злокачественных эпителиальных опухолей СОР является инфильтрирующий рост (Takes R.P. et al., 2002), однако при лейкоплакии, как при любом хроническом процессе СОР, также отмечается инфильтрация эпителиальными тяжами подслизистой оболочки рта (Зиновьев А.С. и др., 1999; Михалева Л.М. и др., 2004), что существенно затрудняет диагностику. Изучение молекулярных механизмов этих процессов позволит более точно проводить подобную дифференциальную диагностику.
Таким образом, актуальность темы диссертации обусловлена высокой распространенностью лейкоплакии слизистой оболочки рта и сложностью диагностики различных ее видов на основании клинических и гистологических данных.
Целью настоящего исследования является поиск молекулярных критериев для дифференциальной диагностики различных видов лейкоплакии и плоскоклеточного рака СОР.
Задачи исследования.
-
Изучить особенности процессов пролиферации и апоптоза по показателям экспрессии белка Ki-67 и белка Р53.
-
Изучить особенности строения промежуточных филаментов клетки по экспрессии белка СК8.
-
Исследовать белки межклеточных плотных контактов - клаудинов 1, 2, 3, 5.
-
Исследовать особенности экспрессии белков клеточной адгезии Е-кадгерина и бета-катенина.
-
Изучить распределение коллагена IV типа в базальной мембране эпителия СОР и экспрессию матриксной металлопротеиназы-9 при лейкоплакии с акантозом и при плоскоклеточном раке СОР.
-
Оценить корреляции между пролиферацией, апоптозом, экспрессией внутриклеточных промежуточных филаментов, белков плотных контактов, белков клеточной адгезии и степенью выраженности неопластической трансформацией клеток.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное иммуногистохимическое изучение процессов пролиферации, апоптоза, экспрессии белков промежуточных филаментов, плотных контактов и
клеточной адгезии при лейкоплакии и плоскоклеточном раке СОР. Показано, что основным критерием определения вида лейкоплакии СОР является соотношение распределения Ki-67 иммунопозитивных клеток в базальном и парабазальном слоях эпителия. Установлено увеличение экспрессии СК8 по мере формирования неопластических процессов в эпителии СОР. Впервые установлено, что клаудин-1 может служить критерием опухолевой трансформации эпителия, при этом показана обратная взаимосвязь между его экспрессией и пролиферативной активностью клеток при лейкоплакии и плоскоклеточном раке СОР. Выявлен механизм инфильтрирующего роста эпителия при лейкоплакии с акантозом и плоскоклеточном раке СОР.
Теоретическая и практическая значимость. В проведенном исследовании установлены особенности экспрессии белков пролиферации Ki-67, Р53, СК8, белка плотных контактов клаудина-1 и белков клеточной адгезии Е-кадгерина и бета-катенина характерные для различных видов лейкоплакии и плоскоклеточного рака СОР. Определены ИГХ критерии, которые необходимо учитывать для дифференциальной диагностики между лейкоплакией и плоскоклеточным раком СОР и для определения стадии злокачественной трансформации эпителия от SIN1 к SIN3. Изучен молекулярный механизм инфильтрирующего роста в СОР при лейкоплакии с акантозом и плоскоклеточном раке.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Иммуногистохимические методы позволяют провести более точную
дифференциальную диагностику между лейкоплакией и
плоскоклеточным раком СОР, на основании исследования
. иммуногистохимических маркеров возможна также диагностика различных видов лейкоплакии СОР.
-
Основным критерием определения вида лейкоплакии СОР является соотношение распределения Ki-67 иммунопозитивных клеток в базальном и парабазальном слоях эпителия.
-
Увеличение экспрессии СК8 происходит по мере нарастания неопластических процессов в эпителии СОР, что может быть использовано для диагностики видов лейкоплакии.
-
Клаудин-1 может служить критерием опухолевой трансформации эпителия, особенности его экспрессии позволяют проводить дифференциальную диагностику между разными видами лейкоплакии СОР.
-
Значительное уменьшение экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина на мембранах эпителиоцитов при плоскоклеточном раке СОР является
критерием для дифференциальной диагностики между лейкоплакией и
плоскоклеточным раком СОР.
6. Основу инфильтрирующего роста эпителиоцитов при лейкоплакии и
плоскоклеточном раке СОР составляет разрушение коллагена 4 типа в
базальной мембране. Расплавление базальной мембраны происходит за
счет синтеза ММР-9 клетками воспаления при лейкоплакии с акантозом и
анапластическими эпителиальными клетками при плоскоклеточном раке
СОР.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были
представлены и обсуждены на совместной конференции сотрудников кафедры
патологической анатомии медицинского факультета Российского университета
дружбы народов и врачей патологоанатомического отделения Госпиталя для
ветеранов войн №2 г. Москвы (2010 г.). Результаты работы, отражающие
основные положения диссертации были доложены на научных конференциях:
X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке
«Инновационные технологии в биологии и медицине»» (Москва, 2009); XVII
Российском национальном конгрессе «ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО» (Москва,
2010); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); II
Международной студенческой научной конференции «Клинические и
теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 - статьи в журналах, рекомендуемых ВАК Минобразования и науки РФ.
Связь диссертации с планом научных исследований. Диссертация выполнена в рамках реализации федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг. Постановление Правительства Российской Федерации от 28 июля 2008г. № 568. Научно-исследовательская работа "Фундаментальные исследования молекулярных изменений в клетках в процессе онкогенеза и механизмов функционирования "биологических часов" организма с целью разработки макета информационного окружения морфологических и физиологических экспериментов". Номер гос. регистрации 2009-1.1-000-080.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 131 странице и состоит из введения, главы обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных результатов, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций; библиография включает 228 работ 14 источников отечественной и 214 иностранной литературы. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 36 рисунками.
Экспрессия белков опухолевого роста при ЛП и ПР СОР
Лейкоплакия (ЛП) - заболевание, характеризующееся патологическим ороговением слизистой оболочки рта (СОР) или красной каймы губ, сопровождающееся воспалением и возникающее в ответ на хроническое экзо- и эндогенное раздражение (Рабинович И.М. и др., 2007). Наряду с эритроплакиеи, красным плоским лишаем, дискоиднои красной волчанкой лейкоплакия СОР рассматривается как предраковое заболевание (Neville B.W. et al., 2002; Thomas G. et al., 2003; Santos-Garcia A. et al., 2005). Определенные виды ЛП могут трансформироваться в плоскоклеточный рак (Rosin М.Р. et al., 2000). Злокачественная трансформация отмечается от 2% до 36% случаев в зависимости от гистологического строения ЛП СОР (Зиновьев А.С. и др., 1999; Lee J.J. et al., 2000; Kim J. et al., 2001; Santos-Garcia A. et al., 2005).
Существует несколько классификаций лейкоплакии СОР, в основе которых лежат клинико-морфологические особенности. Общепринятой является классификация А. Л. Машкилейсона (1970). Согласно данной классификации выделяют простую, веррукозную (бляшковидную и бородавчататую) и эрозивно-язвенную формы (Зиновьев А.С. и др., 1999; Рабинович И.М. и др., 2007). Гистологически для простой формы лейкоплакии характерно утолщение многослойного плоского эпителия за счет базального и зернистого слоев, пара- и гиперкератоз, возможен акантоз. При веррукозной ЛП определяется мощный гиперкератоз, очень редко сочетающийся с небольшими очагами паракератоза, без разрыхления рогового слоя, зернистый слой состоит из 3-6 рядов клеток с хорошо выраженной зернистостью. В тех местах, где определялся гиперкератоз, часто выражен зернистый слой. Шиповатый слой состоит из 8-12 рядов клеток различной формы и величины, они слабо окрашиваются, их ядра крупные и гиперхромные. Нередко отмечается наличие в ядрах 2-3 ядрышек и нарушение рядности расположения клеток. Иногда выявляются атипичные митозы. В отдельных случаях отмечается выраженный акантоз, который сопровождается значительным ю удлинением и расширением эпителиальных выростов. В соединительнотканной строме пораженных участков слизистой оболочки определяется диффузное хроническое воспаление с выраженной лимфоплазмоцитарной реакцией.
При эрозивной форме ЛП, отмечается утолщение эпителиального слоя, в основном за счет увеличения базального слоя. В некоторых случаях эпителиальные тяжи глубоко проникают в подлежащую соединительную ткань. Необходимо отметить, что дискомплексация клеток шиповидного слоя и клеточная атипия особенно выражена при эрозивной форме лейкоплакии. В строме наблюдаются воспалительные изменения, сопровождающиеся гиперемией и отеком, а также появлением диффузных инфильтратов из лимфоцитов с примесью плазмоцитов и тканевых базофилов (Машкилейсон А.Л., 1970; Зиновьев А.С. и др., 1999).
В 2005 г. ВОЗ была принята новая классификация заболеваний головы и шеи, в которой вводится понятие «эпителиальный предрак» (Warnakulasuriya S. et al., 2007), к которому относится лейкоплакия и эритроплакия СОР. Гистологически ЛП СОР была разделена на следующие виды: плоскоклеточная гиперплазия (ЛП без атипии), низкая степень дисплазии, средняя степень дисплазии и высокая степень дисплазии. Для последних трех видов ЛП было введено понятие плоскоклеточная внутриэпителиальная неоплазия (Squamous Intraepithelial Neoplasia - SIN) от 1 до 3 в зависимости от тяжести дисплазии. Для плоскоклеточной гиперплазии характерно увеличение числа клеток в базальном и шиповатом слоях эпителия, отсутствие признаков тканевой и клеточной атипии; для низкой степени дисплазии (SIN1) - увеличение пролиферации клеток в нижней трети эпителия, клеточный и ядерный полиморфизм; для средней степени дисплазии (SIN2) - повышение пролиферации кератиноцитов в нижней и средней трети эпителия, более выраженный клеточный и ядерный полиморфизм, увеличение ядерно цитоплазматического коэффициента, гиперхроматизм, возможно изменение архитектоники тканей - появление эпидермальных выростов, гиперкератоз, лимфоцитарная инфильтрация подслизистой оболочки рта; для высокой степени дисплазии (SIN3) - наличие изменений в более чем 2/3 толщины эпителия, увеличение количества ядрышек, выраженный полиморфизм клеток, паракератоз с очагами эрозии, воспалительные явления (Barnes L. et al., 2005).
В обеих классификациях достаточно четко отображены особенности каждого этапа злокачественной трансформации эпителия СОР. Однако, даже при наличии клинических и гистологических данных оценить стадию малигнизации практически бывает сложно (Явишева Т.М., Ягубов А.С., 2000; Bouquot J. Е. et al., 2006). Поэтому необходимо найти дополнительные диагностические критерии, позволяющие более точно определить степень дисплазии эпителия при лейкоплакии СОР.
По данным ВОЗ плоскоклеточный рак СОР находится на 8 месте среди всех новообразований (Tsantoilis Р.К. et al., 2007). На его долю приходится от 2% до 3% всех злокачественных опухолей (Kademani D., 2007). ПР составляет более 90% всех злокачественных опухолей СОР (Tsantoilis Р.К. et al., 2007; Scully С. et al., 2008). Ежегодно в мире диагностируют 300 тысяч новых случаев ПР СОР (Parkin D.M. et al., 1988). По сравнению с другими неоплазиями этой области при плоскоклеточном раке самый высокий уровень смертности (Mukhopadhyay S. et al., 2004). Пятилетняя выживаемость при плоскоклеточном раке СОР, несмотря на новейшие разработки в области хирургии, радиологии и химиотерапии, соответствует 50%-55% (Neville B.D., Day Т.А., 2002). Ранняя диагностика плоскоклеточного рака СОР может ускорить начало лечения и улучшить прогноз (Massano J. et al., 2006). Потенциально злокачественные заболевания являются одним из основных факторов риска развития плоскоклеточного рака СОР (Waldron С.А., Shafer W.G., 1975; Wright J.M., 1994). Их ранняя диагностика может снизить смертность при плоскоклеточном раке (Sankaranarayanan R., 2005).
Белки прикрепляющих контактов
Иммуногистохимическое исследование биопсийного материала 72 пациентов (10 - неизмененный эпителий, 10 - лейкоплакия без атипии, 14 -лейкоплакия SIN1, 15 - лейкоплакия SIN2, 10 - лейкоплакия SIN3, 13 -плоскоклеточный рак СОР) проводилось в соответствии со стандартным протоколом. Ткани фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7,4), после проводки на гистопроцессоре заливали в парафин, с температурой плавления +54С.
С помощью одноразовых лезвий марки R35 нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла, покрытые поли-Ь-лизином. Депарафинизация выполнена в термостате при температуре +60С в течение 1 часа и погружением в ксилол. Срезы регидрировались проводкой по спиртам в убывающей концентрации в течение 15 минут.
Восстановление антигенной активности осуществлялось методом теплового демаскирования в 0,01М цитратном буфере в микроволновой печи при мощности 300 Вт в течение 20 минут, а также с использованием протеиназы К (Sigma, USA).
Блокирование эндогенной пероксидазной активности выполнено с помощью 3% перекиси водорода в течение 10 минут. В качестве первичной на срезы наносили 50 мкл разведенной сыворотки. Характеристики используемых первичных сывороток представлены в таблице 1. Срезы инкубировались в течение 30 минут. Выявление иммунных комплексов проводили при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (BioGenex, США).
После каждой инкубации срезы отмывали в фосфатно-солевом буфере, подсушивали, затем для визуализации реакции на них наносили ДАБ (3,3-диаминобензидин), что позволяло получать специфическую коричневую окраску. Интенсивность иммуногистохимической реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом: после достижения необходимой интенсивности окрашивания срезы отмывали в дистиллированной воде, а затем в течение 3 минут докрашивали гематоксилином Майера. Стекла со срезами снова промывали и погружали в проточную воду, в которую для получения щелочной среды добавляли несколько капель раствора аммиака.
После того, как срезы приобретали голубой оттенок, стекла извлекали, обезвоживали в батарее спиртов в восходящей концентрации, заключали в канадский бальзам и исследовали под микроскопом.
Поскольку многослойный плоский эпителий представлен слоями различных по своему строению клеток, а пролиферация клеток наблюдалась только в нижних слоях эпителия, в настоящем исследовании иммуногистохимические маркеры определяли в 400 клетках четырех рядов: первом (базальном), в котором клетки непосредственно прилегают к базальной мембране и трех последующих рядах клеток. Некоторые авторы при оценке пролиферативной активности эпителиоцитов СОР объединяют второй и третий ряды клеток в один слой - парабазальный (Liu S-C. et al., 1998). Плоскоклеточный рак обладает выраженной тканевой атипией, в результате чего нарушено послойное строение многослойного плоского эпителия. Это делает практически невозможным выделение клеточных рядов, в связи с чем, мы исследовали 4 зоны распределения 400 клеток от базально расположенных клеток до середины толщины эпителия. Подсчет клеток производили при увеличении х400.
В качестве индикатора пролиферативной активности использован индекс пролиферации Кі-67 (ИП Кі-67), который определялся в каждом ряду клеток долей окрашенных ядер, выраженной в %. Помимо послойного ИП Кі-67, определяли индекс распределения пролиферирующих клеток Кі-67 (ИР Кі-67) в различных слоях, выраженный в %. Для этого, за 100% принималось общее количество пролиферирующих клеток во всех слоях, а ИР Кі-67 соответствовал % подобных клеток в каждом из слоев по отношению к общему количеству только пролиферирующих клеток. Таким образом, данный показатель указывал на клеточный слой с максимальной пролиферативной активностью.
Индекс иммунореактивности Р53 (ИИ Р53) вычислялся отношением числа клеток с окрашенными ядрами, содержащих продукт ДАБ-реакции, к общему числу клеток, не содержащих ДАБ, выраженному в %. Так же определяли индекс распределения иммунореактивных клеток Р53 (ИР Р53) в различных слоях, выраженный в %. За 100% принималось общее количество иммунореактивных клеток во всех слоях, а ИР Р53 соответствовал % подобных клеток в каждом из слоев по отношению к общему количеству только Р53 иммунореактивных клеток.
Экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) оценивалась по наличию (1) и отсутствию (0) коричневых гранул в цитоплазме эпителиальных клеток. Выявление коллагена 4 типа (Col IV) осуществлялась по распределению темнокоричневой линии в области базальной мембраны (БМ). Положительным контролем экспрессии Col IV осуществлялся по окрашиванию стенок кровеносных сосудов, также содержащих коллаген 4 типа. 2.3. Статистический метод
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 6.0. Учитывая ненормальное распределение полученных статистических показателей, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи U-критерия Манна-Уитни. Достоверным, считали различия средних при уровне статистической значимости р 0,01. Изучались корреляционные взаимоотношения между экспрессией Р53, СК8, Е-кадгерина, бета-катенина, CLDN1 и уровнем пролиферации по Ki-67 с помощью коэффициента корреляции Спирмена.
Статистический метод
Основную массу наблюдений - 128 случаев, составили лейкоплакии. В соответствии с классификацией ВОЗ 2005 г. предраковые изменения СОР при лейкоплакии проходят четыре стадии: плоскоклеточная гиперплазия (лейкоплакия без атипии), легкая степень дисплазии (SIN1), средняя степень дисплазии (SIN2) и тяжелая степень дисплазии (SIN3).
При плоскоклеточной гиперплазии отмечалось увеличение числа клеток базального и шиповатого слоев. Признаков клеточной и тканевой атипии не выявлено.
При лейкоплакии SIN1 в нижней трети эпителия отмечалось повышение пролиферации кератиноцитов, с явлениями атипии в виде незначительного клеточного и ядерного полиморфизма.
При SIN2 патологический процесс был локализован не только в нижней, но и в средней трети эпителиального слоя, клеточный и ядерный полиморфизм более выражен, наблюдался гиперхроматизм, увеличение ядерно-цитоплазматического коэффициента и количества митозов в базальном слое, в некоторых случаях отмечались изменения архитектоники тканей в виде эпидермальных «петлевидных» выростов, гиперкератоз (Рис. 4).
При SIN3 изменения затрагивали более чем 2/3 высоты эпителия, отмечались выраженные в большей степени все вышеперечисленные признаки дисплазии, также определялось увеличение количества ядрышек в клетках с ядерной гиперплазией, выраженный полиморфизм клеток, местами наблюдался паракератоз с очагами эрозии. Усиливались воспалительные явления, сопровождающиеся густой инфильтрацией лимфоцитами с примесью плазмоцитов. Лейкоплакия SIN2 COP. Окр. гематоксилин-эозин (x200). 3.3. Гистологическая характеристика плоскоклеточного рака слизистой оболочки рта
В настоящем исследовании плоскоклеточный рак (ПР) СОР был диагностирован у 22 пациентов: в 14 случаях (62%) был выявлен ороговевающий ПР и в 8 случаях (38%) - неороговевающий ПР.
При гистологическом исследовании ПР определялись беспорядочно расположенные комплексы атипичных клеток плоского эпителия с инвазивным ростом в глубжележащие слои подслизистого слоя. Клеточная атипия проявлялась в различной степени и характеризовалась изменением размеров и формы самих клеток, их ядер, изменением ядерно-цитоплазматического соотношения, наличием полиплоидных форм, патологических митозов. При ороговевеющем ПР отмечались явления избыточной кератинизации, что сопровождалось появлением очагов геперкератоза округлой формы с признаками незавершенной кератинизации в центре - «раковые жемчужины», гранул кератогиалина мало или они отсутствуют (Рис. 5). При неороговевающем ПР обнаруживались тяжи эпителиальных клеток с выраженным полиморфизмом. Клетки имели различную форму и величину и мелкие гиперхромные ядра. Часто выявлялись митозы, обычно патологические (Рис. 6). .л %
Повышение пролиферативной активности клеток является основным звеном патогенеза опухолевого роста. Белок Ki-67 считается универсальным маркером пролиферирующих клеток, т.к. выявляется в клетке во всех фазах митотического цикла, кроме GO (Ара D. et al., 2003; Ataman O.U. et al., 2004; Бабиченко И. И. с соавт., 2008). В связи с этим, были изучены особенности экспрессии белка Кі-67 в неизмененном эпителии, при лейкоплакии и при плоскоклеточном раке СОР.
При ИГХ исследовании экспрессия белка Ki-67 наблюдалась в ядрах эпителиальных клеток. На Рис. 7 представлено распределение иммунопозитивных клеток в неизмененном эпителии СОР. Видно, что практически все эпителиоциты с окрашенными ядрами располагались в базальном слое. При лейкоплакии СОР с явлениями SIN количество пролиферирующих клеток увеличилось (Рис. 8). Экспрессия белка Ki-67 отмечалась в клетках как базального, так и парабазального слоев. Максимальное количество иммунопозитивных клеток локализовалось во втором и третьем рядах эпителиоцитов. Количество пролиферирующих клеток значительно увеличилось при плоскоклеточном раке. На Рис. 9 продемонстрирована ИГХ реакция с AT к белку Ki-67 при плоскоклеточном раке СОР. Наблюдалось значительное увеличение экспрессии данного белка эпителиальными клетками, при этом отмечалось окрашивание ядер большей части опухолевых клеток во всех четырех исследованных зонах. Клетки, которые экспрессировали белок Ki-67, распределялись равномерно в толще эпителия. Рис. 7. ИГХ реакция в неизмененном эпителии СОР с антителами к белку Ki-67. Окр. ДАБ-гематоксилин Майера (х200). Рис. 8. ИГХ реакция при лейкоплакии SIN2 СОР с антителами к белку Ki-67. Окр. ДАБ-гематоксилин Майера (х200). Рис. 9. ИГХ реакция при плоскоклеточном раке СОР с антителами к белку Ki-67. Окр. ДАБ-гематоксилин Майера (х200). При оценке пролиферативной активности клеток эпителия СОР использовали индекс пролиферации (ИП Ki-67), представляющий отношение числа клеток с окрашенными ядрами к общему числу клеток. ИП Ki-67 определяли в каждом клеточном ряду в неизмененном эпителии, при лейкоплакии (без атипии, SIN1, SIN2, SIN3) и плоскоклеточном раке СОР. Средние значения индексов пролиферации по Ki-67 и их средние квадратические отклонения представлены в Табл. 2. На Рис. 10 данные отображены в виде диаграммы.
Данные результаты были также оценены по индексу распределения пролиферирующих клеток (ИР Кі-67). В неизмененном многослойном плоском эпителии экспрессия белка Кі-67 отмечалась только в 1-м и 2-м рядах клеток, причем значительное количество пролиферирующих эпителиоцитов локализовалось в базальном ряду, что составляло 84% всех пролиферирующих клеток. В 3-м и 4-м рядах пролиферации клеток не наблюдалось.
При оценке пролиферативной активности клеток при различных видах лейкоплакии по классификации ВОЗ 2005 г. было выявлено, что при ЛП без атипии распределение окрашенных ядер клеток отмечалось такое же, как и в неизмененном эпителии СОР: в 1-м и 2-м рядах клеток, с преимущественной локализацией пролиферирующих клеток в базальном ряду, где ИР Кі-67 составил 82%, и отсутствовала экспрессия белка Кі-67 в 3-м и 4-м рядах клеток. При ЛП SIN 1 положительная реакция отмечалась в первых трех рядах клеток. При этом основная масса пролиферирующих клеток была выявлена в базальном слое, ИР Кі-67 составил 67% и 33% - в парабазальном. В 4-м ряду клеток
Экспрессия белка клаудина
Для количественной оценки экспрессии Р53 был использован индекс иммунореактивности Р53 (ИИ Р53), представляющий отношение числа клеток с интенсивно окрашенными ядрами к общему числу клеток. Данный индекс был подсчитан в каждом клеточном ряду в неизмененном эпителии, при лейкоплакии (без атипии, SIN1, SIN2, SIN3) и плоскоклеточном раке СОР. Средние значения индексов в % Р53 и их средние квадратические отклонения представлены в Табл. 4. На Рис. 15 данные отображены в виде диаграммы.
Данные результаты были также оценены по индексу распределения иммунореактивных клеток (ИР Р53). В неизмененном многослойном плоском эпителии экспрессия белка Р53 отмечалась во всех клеточных рядах. Распределение иммунопозитивных клеток было следующим: в базальном слое ИР Р53 составил 43%, в парабазальном - 46% и в четвертом клеточном ряду -11%. При лейкоплакии без атипии отмечалось похожее распределение клеток, которые экспрессировали данный белок. ИР Р53 в базальном слое был 42%, в парабазальном - 47%, а в четвертом ряду остался прежним - 11%. При лейкоплакии с признаками атипии наблюдалось уменьшение ИР Р53 в базальном слое: при ЛП SIN1 составил 32%, при ЛП SIN2 и ЛП SIN3 - по 23%; и увеличение в парабазальном слое: при ЛП SIN1 - 49% и при ЛП SIN2 и ЛП SIN3 - по 53%. На четвертый клеточный ряд приходилось 19%, 24% и 24% клеток от общей массы иммунопозитивных клеток по мере увеличения степени неопластических изменений. При плоскоклеточном раке СОР основная масса клеток, экспрессировавших белок Р53, приходилась на вторую и третью клеточные зоны, где ИР составил 50%. В первой и четвертой зонах ИР был 26% и 24% соответственно.
Таким образом, экспрессия белка Р53 отмечалась во всех клеточных рядах. Выявлено увеличение общего числа клеток, экспрессирующих Р53, по мере увеличения злокачественной трансформации в эпителии СОР. Распределение иммунопозитивных клеток в толще эпителия мало отличалось между исследуемыми группами, что делает этот критерий мало информативным для проведения дифференциальной диагностики между лейкоплакией с признаками атипии.
Цитокератины (кератины) представляют собой большую подгруппу белков промежуточных филаментов. Существует 54 вида цитокератинов в организме человека (Fuchs Е. et al., 1998; Ku N. et al., 1999). Для каждого типа эпителиальных клеток характерен определенный набор этих белков. При различных заболеваниях отмечаются изменения синтеза цитокератинов не только в количественном отношении, но также возможна экспрессия белка, который характерен для другого вида эпителия (Omary М. et al., 2009).
Экспрессия цитокератина 8 и цитокератина 19 характерна для простого эпителия желудочно-кишечного тракта, печени, поджелудочной железы, молочной железы (Leube R.E. et al., 1986; Inada H. et al., 2001) и для переходного эпителия урогенитального тракта (Moll R. et al., 1988).
Поэтому, представляется целесообразным изучить особенности экспрессии белка цитокератина 8 и цитокератина 19, которые входят в структуру промежуточных филаментов простого однорядного эпителия, при лейкоплакии и плоскоклеточном раке СОР.
При ИГХ изучении этих белков было установлено отсутствие экспрессии цитокератина 19 в эпителии СОР во всех исследуемых группах. Экспрессия белка цитокератина 8 отмечалась в цитоплазме клеток.
На Рис. 16 видно, что в неизмененном эпителии отсутствовала экспрессия данного белка во всех четырех рядах клеток. На Рис. 17 представлено распределение клеток, экспрессирующих СК8, при лейкоплакии SIN2 СОР: цитоплазма клеток базального слоя была наиболее ярко окрашена, в парабазальном слое эпителиоциты были также достаточно интенсивно окрашены, а в вышележащих слоях интенсивность окрашивания цитоплазмы заметно уменьшается. На Рис. 18 отображена экспрессия белка цитокератина 8 при плоскоклеточном раке СОР: равномерное интенсивное окрашивание цитоплазмы наблюдалось практически во всех опухолевых клетках.
Для подсчета экспрессии белка цитокератина 8 был использован метод Н-score. Оценивалась интенсивность цитоплазматического окрашивания от 0 до 3 в цитоплазме 100 эпителиоцитов в первых четырех клеточных рядах. Средние значения H-score и их средние квадратические отклонения представлены в Табл. 5. На Рис. 19 данные отображены в виде диаграммы.Для количественной оценки экспрессии Р53 был использован индекс иммунореактивности Р53 (ИИ Р53), представляющий отношение числа клеток с интенсивно окрашенными ядрами к общему числу клеток. Данный индекс был подсчитан в каждом клеточном ряду в неизмененном эпителии, при лейкоплакии (без атипии, SIN1, SIN2, SIN3) и плоскоклеточном раке СОР. Средние значения индексов в % Р53 и их средние квадратические отклонения представлены в Табл. 4. На Рис. 15 данные отображены в виде диаграммы.
Данные результаты были также оценены по индексу распределения иммунореактивных клеток (ИР Р53). В неизмененном многослойном плоском эпителии экспрессия белка Р53 отмечалась во всех клеточных рядах. Распределение иммунопозитивных клеток было следующим: в базальном слое ИР Р53 составил 43%, в парабазальном - 46% и в четвертом клеточном ряду -11%. При лейкоплакии без атипии отмечалось похожее распределение клеток, которые экспрессировали данный белок. ИР Р53 в базальном слое был 42%, в парабазальном - 47%, а в четвертом ряду остался прежним - 11%. При лейкоплакии с признаками атипии наблюдалось уменьшение ИР Р53 в базальном слое: при ЛП SIN1 составил 32%, при ЛП SIN2 и ЛП SIN3 - по 23%; и увеличение в парабазальном слое: при ЛП SIN1 - 49% и при ЛП SIN2 и ЛП SIN3 - по 53%. На четвертый клеточный ряд приходилось 19%, 24% и 24% клеток от общей массы иммунопозитивных клеток по мере увеличения степени неопластических изменений. При плоскоклеточном раке СОР основная масса клеток, экспрессировавших белок Р53, приходилась на вторую и третью клеточные зоны, где ИР составил 50%. В первой и четвертой зонах ИР был 26% и 24% соответственно.
Таким образом, экспрессия белка Р53 отмечалась во всех клеточных рядах. Выявлено увеличение общего числа клеток, экспрессирующих Р53, по мере увеличения злокачественной трансформации в эпителии СОР. Распределение иммунопозитивных клеток в толще эпителия мало отличалось между исследуемыми группами, что делает этот критерий мало информативным для проведения дифференциальной диагностики между лейкоплакией с признаками атипии.
Цитокератины (кератины) представляют собой большую подгруппу белков промежуточных филаментов. Существует 54 вида цитокератинов в организме человека (Fuchs Е. et al., 1998; Ku N. et al., 1999). Для каждого типа эпителиальных клеток характерен определенный набор этих белков. При различных заболеваниях отмечаются изменения синтеза цитокератинов не только в количественном отношении, но также возможна экспрессия белка, который характерен для другого вида эпителия (Omary М. et al., 2009).
Экспрессия цитокератина 8 и цитокератина 19 характерна для простого эпителия желудочно-кишечного тракта, печени, поджелудочной железы, молочной железы (Leube R.E. et al., 1986; Inada H. et al., 2001) и для переходного эпителия урогенитального тракта (Moll R. et al., 1988).
Поэтому, представляется целесообразным изучить особенности экспрессии белка цитокератина 8 и цитокератина 19, которые входят в структуру промежуточных филаментов простого однорядного эпителия, при лейкоплакии и плоскоклеточном раке СОР.
При ИГХ изучении этих белков было установлено отсутствие экспрессии цитокератина 19 в эпителии СОР во всех исследуемых группах. Экспрессия белка цитокератина 8 отмечалась в цитоплазме клеток.
На Рис. 16 видно, что в неизмененном эпителии отсутствовала экспрессия данного белка во всех четырех рядах клеток. На Рис. 17 представлено распределение клеток, экспрессирующих СК8, при лейкоплакии SIN2 СОР: цитоплазма клеток базального слоя была наиболее ярко окрашена, в парабазальном слое эпителиоциты были также достаточно интенсивно окрашены, а в вышележащих слоях интенсивность окрашивания цитоплазмы заметно уменьшается. На Рис. 18 отображена экспрессия белка цитокератина 8 при плоскоклеточном раке СОР: равномерное интенсивное окрашивание цитоплазмы наблюдалось практически во всех опухолевых клетках.
Для подсчета экспрессии белка цитокератина 8 был использован метод Н-score. Оценивалась интенсивность цитоплазматического окрашивания от 0 до 3 в цитоплазме 100 эпителиоцитов в первых четырех клеточных рядах. Средние значения H-score и их средние квадратические отклонения представлены в Табл. 5. На Рис. 19 данные отображены в виде диаграммы.
![Разработка и оценка эффективности методов профилактики и лечения радиомукозита слизистой оболочки рта [Электронный ресурс]](/i/i/4276/203157.png "Разработка и оценка эффективности методов профилактики и лечения радиомукозита слизистой оболочки рта [Электронный ресурс] Нуриева Наталья Сергеевна")
