Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1. Аминокислоты и методы их анализа 10
1.1.1. Общие положения 10
1.1.2. Методы анализа- 12
1.1.3. Способы детектирования 17
1.2. Низкомолекулярные аминотиолы плазмы крови и методы их анализа - 25
1.2.1. Гомоцистеин и его метаболизм в организме человека 25
1.2.2. Методы анализа гомоцистеина 30
1.2.3. Способы идентификации гомоцистеина - 35
1.2.3.1. Методы, не требующие предварительной дериватизации 35
1.2.3.2. Методы с предварительной дериватизацией 37
1.3. Методы разделения и идентификации полинуклеотидов 45
1.3.1. Нуклеиновые кислоты. Общие положения- 45
1.3.2. Дезоксирибонуклеиновые кислоты. Методы анализа 46
1.3.3. Капиллярный гель-электрофорез. Основы метода.
1.3.4. Определение мутаций генов 55
2. Экспериментальная часть 61
2.1. Реактивы и материалы 61
2.2. Приготовление рабочих растворов 62
2.3. Приборы и оборудование - 65
2.4. Общая методология работы 66
2.4.1. Анализ свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза 66
2.4.2. Анализ гомоцистеина, цистеина и глутатиона методами ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза 67
2.4.3. Анализ олигонуклеотидов методом капиллярного гель-электрофореза 72
3. Результаты и их обсуждение 74
3.1. Определение свободных кодируемых аминокислот 74
3.1.1. Определение методом капиллярного зонального электрофореза 74
3.1.2. Определение методом мицеллярной электрокинетической хроматографии 81
3.2. Определение гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотилов плазмы крови 91
3.2.1. Определение микроколоночной ОФ ВЭЖХ 91
3.2.2. Определение методом капиллярного электрофореза 114
3.3. Определение мутаций в молекулах ДНК методом капиллярного гель-электрофореза 121
Выводы 130
Список литературы 131
- Низкомолекулярные аминотиолы плазмы крови и методы их анализа
- Анализ свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза
- Определение гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотилов плазмы крови
- Определение мутаций в молекулах ДНК методом капиллярного гель-электрофореза
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время клинические исследования все больше ориентируются на использование инструментальных микрометодов анализа для диагностики наиболее распространенных и опасных социально-значимых заболеваний. Значительная часть этих методов не полностью и не всегда обеспечивает своевременное и качественное их диагностирование, что часто не отвечает современным требованиям мониторинга биохимического статуса человека.
Свободные аминокислоты и короткие пептиды, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение. В ряде случаев они могут выступать в роли молекулярных маркеров определенных заболеваний. Изменение их концентрации часто связано с метаболическими нарушениями, которые свидетельствуют о развитии того или иного заболевания. Большинство существующих методов аминокислотного анализа является либо недостаточно чувствительными и селективными для их идентификации, либо требуют дерива-тизации аминокислот, что существенно усложняет процесс их определения. Проблема простого и экономичного анализа свободных генетически кодируемых аминокислот до сих пор до конца не решена. В то же время клинический анализ аминокислот требует их пред- или постколоночной модификации для высокочувствительного и селективного определения. Изменение содержания молекулярных маркеров в физиологических жидкостях может быть связано также с генетической предрасположенностью пациента к конкретному заболеванию. Отсюда следует необходимость проведения сравнительного анализа фрагментов ДНК с целью повышения достоверности определения причины исследуемого заболевания и более эффективной его терапии.
Между тем необходимая для аминокислотного и нуклеотидного анализа аппаратура импортного производства, как правило, является дорогостоящей и малодоступной для большинства клинических лабораторий. Ситуация усугубляется еще и тем, что многие приборы являются узкоспециализированными для каждого вида заболевания, вследствие чего наблюдается множественное дублирование диагностических методов как по аппаратуре, так и по методологии. Это резко повышает стоимость клинических исследований и усложняет сравне-
Автор выражает благодарность руководителю группы аналитической химии белка ИБХ РАН ст.н.с, к.х.н. И.В. Назимову за постоянную помощь, внимание и обсуждение результатов.
ниє полученных результатов анализа. Таким образом, разработка новых методик, расширяющих возможности использования общедоступного аналитического оборудования отечественного производства для высокочувствительного экспрессного и надежного определения свободных и модифицированных аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов как для структурного анализа биополимеров и их фрагментов, так и в клинико-диагностических целях является актуальной научной задачей.
Цель работы. Целью диссертационной работы является разработка комплекса инструментальных высокочувствительных микрометодов анализа свободных и модифицированных аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов с использованием отечественной инструментальной базы.
Научная новизна.
Разработаны методики определения не модифицированных генетически кодируемых ос-аминокислот с использованием методов капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ-фотометрическим и рефрактометрическим способами детектирования.
Разработаны и применены в клинической практике методики совместного определения низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови с использованием методов обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного зонального электрофореза с флуориметриче-ским и прямым УФ-фотометрическим способами детектирования.
Разработана методика определения фрагментов мутантного гена венозных тромбозов на основе анализа продуктов аллель-специфичной полимеразной цепной реакции методом капиллярного гель-электрофореза с флуориметри-ческим детектированием.
Практическая значимость. Разработанный метод аминокислотного анализа позволяет определять микроколичества генетически кодируемых аминокислот без их предварительной дериватизации, что существенно упрощает существующую схему анализа. Разработан и предложен для практического использования комплекс методов анализа молекулярных маркеров сосудистых катастроф (гомоцистеин, цистеин, глутатион), а также фрагментов мутантного гена венозных тромбозов. В результате проведенной работы удалось показать
возможность эффективного использования отечественной аппаратуры для проведения биохимического анализа как белковых, так и нуклеиновых компонентов на одном и том же приборе для капиллярного электрофореза. Определение серосодержащих аминокислот и пептидов в плазме крови по разработанной в данной работе методике использовали для оценки фактора риска десятков пациентов с достоверно установленным инфарктным и предынфарктным состоянием. Результаты проведенной работы использованы при создании и апробировании в практике биомедицинского анализа универсального экономичного автоматизированного комплекса приборов и методов молекулярной диагностики некоторых социально-значимых заболеваний (инфаркты, инсульты, тромбозы), разрабатываемого в институте аналитического приборостроения РАН.
На защиту выносятся:
способы определения генетически кодируемых аминокислот в водном растворе без их предварительной дериватизации с использованием капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии;
оптимизированные условия дериватизации низкомолекулярных аминотио-лов плазмы с использованием флуорогенных реагентов (монобромобиман и 5-иодоацетамидофлуоресцеин);
методика анализа низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза;
результаты определения содержания гомоцистеина в плазме крови методами ОФ ВЭЖХ и капиллярного зонального электрофореза;
способ определения мутантного гена венозных тромбозов с использованием капиллярного гель-электрофореза в линейном nonH-N,N'-диметилакрил амиде.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 8-м Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (15-19 октября 2001 г. Москва, Россия), 3-м Международном симпозиуме по методам разделения в бионауках (13-18 мая 2003 г., Москва, Россия,), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (Секция химия. 12-15 апреля 2005 г., Москва,
Россия), 2-ой научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (12-14 сентября 2005 г., Анапа, Россия), 3-м съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (25-27 октября 2005 г., Москва, Россия), 1-ой конференции молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова (13-14 октября 2005 г., Москва, Россия), Международном конгрессе по аналитическим наукам ICAS-2006 (25-30 июня 2006 г., Москва, Россия), 31-м Международном конгрессе федерации европейских биохимических обществ (24-29 июня 2006 г., Стамбул, Турция), 26-м Международном симпозиуме по разделению белков, пептидов и полинуклеотидов (16-20 октября 2006 г., Инсбрук, Австрия).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.
Низкомолекулярные аминотиолы плазмы крови и методы их анализа
Гомоцистеин (Нсу) - это некодируемая АК, содержащая свободную сульфгидрильную группу. Единственным источником и одним из конечных продуктов его метаболизма в организме человека и является метионин. Образование Нсу из метионина H2N-CH-C-OH I происходит в результате многочисленных реакции СН2 і переноса метальных групп, при этом в качестве Н2С SH промежуточных продуктов происходит образование аденозилметионина и аденозилгомоцистеина. Аденозилметионин может обратимо гидролизоваться в метионин [54]. Обратное превращение Нсу в метионин происходит в основном под действием 5-метилтетрагидрофолата в процессе витамин Віг-зависимой реакции. Наряду с указанными процессами гомоцистеин принимает участие в конверсии в цистеин с образованием в качестве интермедиата цистатиона. Данное превращение протекает при участии таких производных витамина Вб, как например, пиродоксаль-5 -фосфат. Сам витамин Вб необходим для превращения цистатионина в цистеин и а-кетомасляную кислоту Общая схема метаболизма гомоцистеина в организме человека показана на рис. 7. Снижение уровня витаминов В6, Bj2 или фолата приводит к накоплению Нсу в организме человека. Существует связь между статусом потребления витаминов и концентрацией Нсу в плазме крови. Это обуславливает простую терапию для случаев умеренно повышенного содержания Нсу, заключающуюся в снижении потребления белков животного происхождения и повышении потребления витаминов группы В и фолиевой кислоты Кроме того, коррекция содержания Нсу может быть осуществлена путем применения триметиглицина или бетаина. Их использование в некоторых случаях помогает даже при генетически обусловленном накоплении Нсу. Помимо указанных процессов на уровень Нсу в крови влияет ряд других факторов. Некоторые из них указаны на рис. 8. Существует определенная связь содержания гомоцистеина с природой и характером протекания того или иного заболевания.
Повышение уровня Нсу в плазме крови увеличивает риск сосудистых катастроф (инфарктов и инсультов). Согласно недавно опубликованным данным 27 межлабораторных исследований, повышение общего уровня Нсу (tHcy) на 5 мкмоль/л повышает риск коронарно-сердечных и церебрососудистых заболеваний в 1,5-1,.7 раза [55]. tHcy для здоровых людей в плазме составляет 5-15 мкмоль/мл, а в моче - 10-30 мкмоль/мл [56]. Содержание Нсу у мужчин в среднем на 15-35% выше, чем у женщин. У женщин концентрация Нсу повышается с возрастом, в постмено-паузе и при активном использовании гормональных противозачаточных средств. Установлено, что Нсу стимулирует рост ткани гладкой мускулатуры, запуская механизмы действия специфических протоонкогенов и воздействуя на транскрипционную активность генов некоторых белков, то есть влияет на синтез ДНК [54, 57]. Обнаружено также, что повышение содержания Нсу в плазме крови вызывает снижение уровня серина [58]. Помимо приобретенного повышенного уровня Нсу в плазме крови возможна также генетическая предрасположенность к данной патологии. Существует связь мутации 677С-УГ в гене фермента метилентетрагидрофолатредуктазы (МТГФР) с патологическими концентрациями Нсу в плазме крови. При такой мутации аланин в составе этого фермента заменяется на валин. Вследствие этого, мутантная форма фермента становится термолабильной и его активность снижается на 50%. Мутантный вариант МТГФР часто встречается у пациентов с коронарной болезнью сосудов [59]. Также данная мутация вызывает у пациентов врожденное заболевание - гомоцистеинурию. Дети с этим заболеванием обычно умирают в раннем возрасте от осложнённого атеросклероза. Множество исследований доказали, что умеренная гомоцистеинемия также связана с повышенным риском развития заболеваний окклюзии сосудов. Гомоцистеин является мощным индуктором развития атеросклероза [60,61]. Известно, что существует связь повышенного уровня Нсу с мутацией 2756A-»G метионин синтазы и с уровнем экспрессии фермента вне клеточной супероксидисмутазы [62]. Высокий уровень Нсу в крови встречается также при наличии мутаций 833Т- С и 919G-»A в гене фермента цистатион-р-синтазы. Следует иметь ввиду, что эти мутации встречаются слишком редко, чтобы делать достоверные выводы об их влиянии на метаболизм Нсу [63]. Исследования генетических нарушений (гетерозиготная гомоцистеинурия и термолабильный вариант метилентетрагидрофолат-редуктазы) и нарушений факторов питания (дефицит фолата или кобаламина) позволили частично понять этиологию гипергомоцистеинемии in vivo. Таким образом, повышение содержания Нсу в плазме крови и в моче является серьезным сигналом нарушения метаболизма в организме человека.
Оно может быть вызвано и связано как с нейродегенеративными заболеваниями [64], нарушениями сердечной деятельности (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда) [65], заболеваниями сосудов [60,66], включая кардиососудистые, церебральные и переферальные артериально-окклюзионные заболевания, атеросклероз, лейкемией [67], почечной недостаточностью [61], так и с генетическими нарушениями (гомоцистеинурия, цистатион-Р-синтазная и метионин-синтазная недостаточности и т.д.). Не последнюю роль могут играть процессы старения и неправильный образ жизни. В свете изложенного становится убедительной все больше проявляющаяся тенденция рассматривать содержание гомоцистеина в качестве фактора риска ряда заболеваний, в первую очередь сердечночх)судистой системы. Определение Нсу используют для клинико-биохимических исследований, диагностики некоторых из перечисленных нарушений метаболизма, а также для мониторинга лекарственной терапии [61,66]. Определение свободного гомоцистеина в физиологических жидкостях осложнено рядом факторов: существованием этого аминотиола в виде соединений с белками и смешанных или симметричных дисульфидов с некоторыми низкомолекулярными аминотиолами (Рис. 9) [68], а также низким
Анализ свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза
Определение свободных кодируемых АК проводили на приборах: «Нанофор 01» (ИАнП РАН, Санкт-Петербург, Россия) и Model 270 А (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, США) и CEZAR (ОАО «Прикладные системы», Минск, Беларусь). Методика проведения анализа АК методом капиллярного электрофореза включала в себя следующие этапы: термостатирование прибора в течение 20 мин, последовательную промывку капилляра в течение 3 мин водой и щелочью и в течении 5 мин стартовым фоновым электролитом, "холостой" анализ, анализ стандартной смеси веществ, промывку капилляра в течение 3 мин щелочью и рабочим фоновым электролитом, ввод пробы в капилляр, проведение анализа. После каждого анализа капилляр последовательно промывали в течение 3 мин 0,2 М раствором NaOH, тридистиллированной водой и рабочим буферным раствором. В качестве фоновых электролитов использовали: фосфат, борат, ацетат и цитрат натрия; трис(гидроксиметил)аминометан, 3-(циклогексиламино)-1-пропан-сульфоновую кислоту. При использовании метода МЭКХ в качестве мицеллообразователя использовали додецилсульфат натрия. В качестве добавок органических растворителей к фоновому электролиту использовали ацетонитрил, метанол и 2-пропанол. Добавки органических растворителей к рабочим растворам в методе МЭКХ осуществляли на стадии приготовления растворов, контролируя значение рН при помощи рН метра и в соответствии с требуемым объемным содержанием. В качестве маркера электроосмотического потока применяли 5% водный раствор ДМСО. Все анализируемые кодируемые аминокислоты взвешивали на аналитических весах (nu l мг) и растворяли в 0,1 М НС1 до требуемой концентрации. УФ-фотометрическое детектирование проводили на длине волны 208 нм.
Для разделения АК использовали модифицированные плавленые кварцевые капилляры с внутренним диаметром 50, 75 мкм и внешним 360 мкм. Общая длина используемых капилляров лежала в интервале от 450 до 1220 мм, а эффективная - от 350 до 950 мм. Максимальное прикладываемое напряжение составляло 30 кВ, а значение тока 150 мкА. Более подробные условия проведения разделений указаны под соответствующими электроферограммами. Приготовление образцов плазмы крови. Кровь (5 мл) получали от здоровых представителей лабораторного персонала и пациентов кардиологической реанимации натощак венепункцией и затем переносили в пробирки, содержащие 0,5 мл 3,8% водного раствора цитрата натрия, немеделенно центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин для получения плазмы, которую затем декантировали, замораживали и хранили при температуре -20С. Модификация гомоцистеина, цистеина и глутатиона монобромобиманом. 30 мкл оттаявшей плазмы крови отбирали в 0,5 мл закрывающуюся полипропиленовую пробирку для центрифугирования (Eppendorf), содержащую 15 мкл 0,2М НС1, добавляли 10 мкл 430 мМ раствора трифенилфосфина, пробирку закрывали, раствор интенсивно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем добавляли 5 мкл раствора 5-сульфосалициловой кислоты с концентрацией 100 г/л, содержимое пробирки перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течении 15 мин, затем раствор перемешивали и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин.
Аликвоты супернатанта (25 мкл) отбирали в 0,5 мл полипропиленовые пробирки для центрифугирования (Eppendorf). В каждую пробирку добавляли 15 мкл 9 мМ раствора монобромобимана, и после перемешивания вносили в реакционный объем 35 мкл 0,3 М раствора диэтанол амина. Образцы перемешивали и инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Пробирки центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин. 3-7 мкл каждого образца использовали для проведения либо ОФ ВЭЖХ, либо КЭ анализа. Пробирки с образцами хранили в темноте при -20С. Приготовление калибровочных стандартов. Были приготовлены 200 мМ модельные растворы гомоцистеина, цистеина и восстановленного глутатина. Для построения калибровочной зависимости модельные растворы аминотиолов разбавлялись 0,2М раствором НС1 до требуемой концентрации. Концентрации AT составляли 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0; 60,0; 75,0; 100,0 мкМ. Аликвоты калибровочных стандартов были подвергнуты выше описанной процедуре пробоподготвки. Модификация гомоцистеина, цистеина и глутатиона 5-иодоацетаамидофлуоресцеином. 15 мкл модельного раствора AT вносили в 0,5 мл закрывающуюся полипропиленовую пробирку для центрифугирования (Eppendorf), содержащую 5 мкл 0,2М НО. После добавления 5 мкл 430 мМ раствора трифенилфосфина пробирку закрывали, раствор интенсивно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин.
Полученный раствор перемешивали и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Аликвоты супернатанта (20 мкл) отбирали в 0,5 мл полипропиленовые пробирки для центрифугирования (Eppendorf). В каждую пробирку добавляли 5 мкл 20 мМ раствора 5-иодоацетамидофлуоресцеина, и после перемешивания вносили в реакционный объем 45 мкл 0,3 М раствора фосфата натрия рН 11.0. Образцы перемешивали и инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Пробирки центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин. 3-7 мкл каждого образца использовали для проведения либо ОФ ВЭЖХ, либо КЭ анализа. Пробирки с образцами хранили в темноте при -20С. Хроматографический анализ. Для анализа MB и AF производных использовали ранее описанные системы 1 и 2. Образцы (3-7 мкл) инжектировали с помощью автосамплера в микроколонку. Для анализа МВ-производных AT применяли колонки: Nucleosil 100-5 СІ8 (размер колонки -2x75, диаметр пор -100 мкм, диаметр частиц - 5 мкм) и Prontosil 120-5C18AQ (размер колонки - 2x75, диаметр пор - 120 мкм, диаметр частиц - 5 мкм). Лучшие результаты получены при использовании колонки Prontosil 120-5C18AQ. Колонки термостатировали при 55 С. УФ-фотометрическое детектирование проводили на длине волны 234 нм, флуориметрическое - возб==390нм, А,эмм=478нм. Условия градиентного элюирования: Элюент А - 0,1% трифторуксусная кислота (рН 2.2) Элюент Б - 100% ацетонитрилРегенерацию колонки между анализами проводили раствором, содержащим 4% Б в течении 5,2 мин при скорости потока 150 мкл/мин. Для AF-производных использовали микроколонки Prontosil 120-5C18AQ (размер колонки - 2x75, диаметр пор -120 мкм, диаметр частиц - 5 мкм) и Vydac С4 (размер колонки - 2x120, диаметр частиц - 5 мкм). Лучшие результаты получены при использовании колонки Prontosil 120-5C18AQ. УФ-фотометрическое детектирование проводили на длине волны 250 и 300 нм, флуориметрическое - А.ВОзб=390нм, Аомм=478нм. Условия градиентного элюирования при фотометрическом детектировании: Элюент А - 0,1% трифторуксусная кислота (рН 2.2) Элюент Б - 100% ацетонитрил
Определение гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотилов плазмы крови
При разработке приведенного ниже метода определения максимально учитывали существующий опыт исследований по анализу AT в моче и плазме крови человека. На основании известных и собственных полученных экспериментальных данных предложено окисленные и связанные с белком аминотиолы восстанавливать трифенилфосфином, высокомолекулярные белки плазмы крови осаждать 5-сульфосалициловой кислотой, модификацию свободных сульфгидрилов проводить монобромобиманом или 5-иодоацетамидофлуоресцеином. Полученные производные разделяли, идентифицировали и количественно оценивали методами микроколоночной ОФ ВЭЖХ, КЗЭ. Для идентификации применяли фотометрический и флуориметрический способы детектирования. Производные охарактеризовывали методами абсорбционной, флуориметрической и масс-(MALDI, ESI) спектроскопии. Стадия пробоподготовки В опубликованных данных для восстановления дисульфидных связей рекомендуется использовать главным образом дитиотреитол [119], три-п-бутилфосфин (ТБФ) [121], 2-меркаптоэтанол [116] или борогидрид натрия [187]. Применение данных восстановителей имеет ряд недостатков. Использование 2-меркаптоэтанола или дитиотреитола при последующей дериватизации флуорофорами приводит к образованию флуоресцирующих производных не только целевых AT, но и самих тиол-содержащих реагентов, а также полупродуктов реакции тиол-дисульфидного обмена. Это значительно усложняет хроматографическое разделение смеси и идентификацию целевых производных AT. Борогидрид натрия - агент нестабильный в водных средах, очень «жесткий» и неудобный в работе (из-за сильного пенообразования) восстановитель.
Особенно заметно это проявляется при хроматографическом анализе. Три-н-бутилфосфин, особенно при высоких концентрациях, является взрывоопасным реагентом. Учитывая, что для предотвращения реокисления AT необходимо вводить большой избыток восстановителя, избегая при этом существенного разбавления пробы, использование три-п-бутилфосфина является опасным. Принимая во внимание указанные недостатки, было решено использовать в качестве восстанавливающего агента трифенилфосфин (ТФФ). Это соединение более безопасно в использовании и в тоже время обладает высокой реакционной способностью. Стандартный окислительно-восстановительный потенциал ТФФ несколько выше чем у ТБФ, что обуславливает более мягкое восстановление дисульфидных связей. ТФФ отличает также сравнительно низкая себестоимость. Реакционная способность ТФФ достаточно легко подается контролю и регулированию. Предлагаемая методика восстановления обеспечивает быстрое и полное восстановление дисульфидов и высвобождение сульфгидрилов при комнатной температуре. Необходимый для этого избыток ТФФ устанавливали экспериментально. На рис 19. представлена зависимость выхода реакции восстановления 100 мкМ цистина от введенного количества ТФФ. Из него видно, что оптимальным является 4500-5000-кратный избыток восстановителя. Эксперимент проводили при времени инкубирования 25 мин., что заведомо превышало требуемое для его проведения. Зависимость выхода реакции восстановления цистина до цистеина от времени инкубирования при использовании 5000-кратного избытка ТФФ показана на рис. 20а.
Постоянный выход реакции, составляющий более 96%, достигается через 18-20 мин после ее начала. Добавление 0,1 М соляной кислоты в указанный раствор ТФФ позволяет создать условия для каталитического восстановления дисульфидных связей и тем самым ускорить реакцию, (рис. 206). В результате время инкубирования уменьшается до 12 мин. Оптимальной для проведения каталитического восстановления является концентрация соляной кислоты, равная 0,2 М. Из литературных данных известно, что анализируемые флуоресцентные производные AT устойчивы только при рН 8. Использование на стадии восстановления более высокой концентрации кислоты требует введения больших объемов основания для ее нейтрализации, что приводит к понижению чувствительности метода. Рис. 20. Определение оптимального времени инкубирования. Проведение стадии восстановления при указанных условиях не увеличивает общее время пробоподготовки по сравнению с приведенным в литературе [108]. Для удаления катионов тяжелых металлов, способствующих реокислению тиолов, в данной работе использовали добавку 0,5М ЭДТА. Выходы реакций восстановления определяли, используя стандартную методику измерения содержания свободных AT [108]. Депротеинизацию плазмы крови проводили с помощью 5-сульфосалициловой кислоты (ССК). Эксперимент показал, что если на каждые 30 мкл анализируемого раствора добавить 5 мкл раствора ССК с концентрацией 100 г/л., то удается полностью удалить из смеси высокомолекулярные соединения белковой природы.
На хроматограммах растворов, полученных после осаждения, отсутствуют пики высокомолекулярных соединений. В опубликованных исследованиях сообщается об использовании значительно более концентрированных (500 г/л) растворов ССК [187]. Использование растворов кислоты с более низкой концентрации позволяет избежать разбавления пробы на стадии нейтрализации за счет введения дополнительного объема нейтрализующего основания. Необходимое значение рН, лежащее в основной области, поддерживали, используя диэтаноламин (рКа = 8,9). В литературе каких-либо сведений об использовании этого соединения при модификации AT не имеется. Для этих целей, как правило, используют гидрооксид натрия [187] боратные [116] или фосфатные буферные растворы [107]. Использование данных регуляторов рН требовало в последующем удаления образующихся при нейтрализации солей из реакционной смеси перед масс-спектрометрическим анализом. Применение диэтаноламина позволило избежать указанной операции, упростить масс-спектр и проводить прямое контролирование образование целевых продуктов масс-спектрометрически. Стадия модификации, разделения и идентификации Хроматографический анализ проводили на микроколоночном хроматографе «Милихром-А02» с фотометрическим и флуориметрическим детектированием. Разделение проводили на колонках: 1) Nucleosil 100-5 СІ8 2) Prontosil 120-5C18AQ 3) Vydac C4 в системах растворителей 0,1% трифторуксусная кислота - ацетонитрил, 0,1% фосфорная кислота -ацетонитрил, 2М перхлорат лития - ацетонитрил. Диаметр частиц сорбента во всех случаях составлял 5 мкм.
Определение мутаций в молекулах ДНК методом капиллярного гель-электрофореза
В настоящее время для успешной интенсивной терапии многих социально значимых заболеваний необходимо иметь точную информацию о природе их происхождения - является ли оно генетически обусловленным или приобретённым. Разработка быстрых и точных методов генетической диагностики является актуальной задачей современной аналитической химии. Одним из методов анализа, позволяющих решить эту задачу, является -КЭ в растворах полимеров (капиллярный гель-электрофорез, КГЭ). Разделение ДНК в данном методе, как и в классическом КЗЭ, проходит в капиллярах из кварцевого стекла диаметром от 25 до 100 мкм. Основное отличие КГЭ от КЗЭ - это использование в качестве разделительной среды растворов полимеров. Высокое значение отношения площади поверхности к объёму капиллярной трубки обеспечивает эффективное рассеивание тепла, выделяющегося в процессе электрофореза, что позволяет использовать более высокие значения напряжения электрического поля, значительно сократить время анализа и улучшить разрешение компонентов анализируемого образца. В отличие от электрофореза на пластинах КГЭ достаточно легко поддается автоматизации. В данной работе в качестве сепаративной матрицы использовали поли-Л -диметилакриламид (пДМА) производства ЗАО «Синтол», отличающийся низкой вязкостью и способностью к самосшиванию. Его также можно использовать при КГЭ в чипах. Это немаловажно, поскольку для увеличения экспрессности определения разработанная методика в дальнейшем, возможно, будет перенесена на чип-вариант КГЭ. пДМА синтезировали из мономера диметилакриламида путём радикальной полимеризации. Длину цепи контролировали, изменением температуры или добавлением ловушек радикалов.
Синтезированные полимеры тестировали на приборе «Нанофор 02» принимая во внимание их вязкость, уровень нативной флуоресценции, способность к разделению смесей флуоресцентно меченых полинуклеотидов в определённом интервале длин (в данном случае до 101 н.о.) при высоких значениях напряжения, долговременность неизменности свойств под действием электрического поля и сохранение способности к эффективному разделению полинуклеотидов от анализа к анализу на единичном заполнении капилляра и при увеличении количества анализируемой материи. Были протестированы полимеры, содержащие 5-8% мономера пДМА. В качестве фоновых электролитов применяли 0,1М ТВЕ (0,1М трис(гидроксиметил)аминометан, 0,1М борная кислота и 2,5 мМ ЭДТА) и 0,1М Н-трис-(гидроксиметил)метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS). Все исследуемые полимеры имели низкий уровень нативной флуоресценции ( 0,5 AU). Полимеры, приготовленные с использованием 0,1М TAPS позволяли проводить до 5 разделений без перезаполнения капилляра гелем, 0,1М ТВЕ - не более 3. Разрешающая способность метода повышалась с увеличением содержания мономера пДМА в геле. Одновременно увеличивалась его вязкость, что в конечном счете негативно сказывалось на экспрессности определения. Содержания мономера равные 6-8% масс, обеспечивали необходимую разрешающую способность метода в 2 н.о. Для анализа использовали поверхностно-немодифицированные кварцевые плавленые капилляры с внутренним диаметром 50 и 75 мкм и внешним - 375 мкм.
Общая длина капилляров составляла от 450 до 650 мм. Эффективная длина на 75 мм меньше. В табл. 18 и 19 приведены данные по времени заполнения капилляра и общему времени анализа модельной смеси флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (длина 5-101 н.о.) при использовании различных капилляров, фоновых электролитов и полимеров для разделения. Полученные данные показывают, что оптимальным полимером для разделения олигонуклеотидов с длиной цепи до 100 н.о. является гель на основе пДМА содержащий 6% мономера, 7М мочевины и 0,1М TAPS. В качестве модельного раствора использовали смесь флуоресцентно меченых полинуклеотидов с длинами 5-15-25-35-45-55-65-75-85-95-100 123 101 и.о., соответственно с концентрацией каждого из них 10 9 М. Ввод пробы осуществляли электрокинетически. На рис. 38. представлена картина качественного разделения тестовой смеси нуклеотидов. Оптимизация условий разделения (напряжение, сила тока, диаметр капилляра) позволила достичь разделения до базовой линии олигонуклеотиодов общей длиной менее 100 н.о. и разницей по длине 1 н.о. (рис. 39). Проведенные исследования показали, что используемые полимеры и их западные аналоги обеспечивают сопоставимую разрешающую способность, но при этом более доступны по цене. Полученные данные были положены в основу разработки системы быстрой и эффективной диагностики мутантного гена венозных тромбозов (Leiden гена фактора V системы свёртывания крови человека). Поскольку полученные полимеры обеспечили возможность идентификации полинуклетидов с разницей по длине вплоть до 1 и.о., то представилось возможным подобрать и синтезировать аллель-специфичные флуоресцентно меченые по 5 -концу праймеры. Разница праймеров по длине составляла 5 н.о. на 5 -конце. Встречный праймер подбирали таким образом, чтобы длина продукта ПЦР не превышала 100 н.о.
Данное граничное условие обусловлено областью, в которой используемые полимеры показывают стабильное качество разделения полинуклеотидов с разницей по длине в 5 н.о. и ниже. Для выяснения возможности совместного определения продуктов дикого и мутантного типов (разница 5 н.о.) были проведены следующие ПЦР: (1) ДНК дикого типа (без мутации) + праймер дикого типа; (2) ДНК дикого типа (без мутации) + праймер FV Leiden; (3) ДНК с гетерозиготной мутацией FV Leiden + праймер FV Leiden; (4) праймер FV Leiden без ДНК. Продукты реакции после обработки формамидом разбавляли тридистиллированной водой и подвергали анализу методом КГЭ с флуориметрическим детектированием. Контрольные образцы (2 и 4) не показали наличия никакого продукта ПЦР. На соответствующих электроферограммах имеет место только пик, относящийся к праймеру (рис. 40). На электроферограммах образцов 1 и 3 наблюдается 2 четко выраженных пика: интенсивный пик праймера, обусловленный присутствием избыточного его количества (необходимое условие проведения ПЦР), и значительно менее интенсивный пик продукта (рис. 41).
