Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 9
1.1 Строение и поведение антоциаиовых пигментов в растворах 9
1.2 Выделение антоциаиовых красителей из растительного сырья 16
1.3 Спектральные методы анализа антоцианов 18
1.4 Выделение и разделение антоциаиовых пигментов хроматографическими методами 22
1.5. Статистическая обработка данных 28
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 31
2.1 Модельные образцы флавоноидов 31
2.2. Используемые сорбенты и их характеристики 34
2.3 Дополнительные реагенты 37
2.4. Антоциансодержащее сырье, используемое для выделения красителя 40
2.5 Выделение красителей из антоцнансодержащего сырья 41
2.6 Определение количества красящих веществ в натуральных красных пищевых красителях 42
2.7 Определение рН натуральных пищевых красителей 43
2.8 Получение градуировочнои зависимости оптической плотности от концентрации антоциаиовых пигментов 43
2.9 Применение сканера и компьютерных программ цифровой обработки изображений для количественного определения антоциаиовых пигментов в спиртовых и водных растворах 47
2.10 Бумажная хроматография 48
2.11 Хроматография красителей и растворов индивидуальных антоциан-3-глюкозидов в тонком слое сорбента 49
2.12 Количественный расчет хроматограмм с применением программы «Sorbfil Videodensitometer» 50
2.13 Выявление неокрашенных фенольных компонентов красителей в тонком слое сорбента 52
2.14 Препаративная ТСХ компонентов красителей, с последующим спсктрофотометрическим анализом выделенных веществ 52
2.15 Анализ антоциансодержащих растворов методом ВЭЖХ 54
2.16 Препаративное разделение антоциаиовых пигментов методом ВЭЖХ 55
2.17 УФ и видимая спектроскопия исследуемых веществ 55
2.18 ИКС анализ изучаемых веществ 56
2.19 Изучение условий сорбции антоциаиовых пигментов в статических условиях 57
2.20 Концентрирование антоциаиовых пигментов красителя каркаде и черноплодной рябины из разбавленных водных растворов 57
2.21 Фракционирование антоциаиовых пигментов красителя каркаде 58
2.22 Условия хранения 58
2.23 Дополнительное оборудование 59
ГЛАВА 3. Аналитические характеристики модельных растворов антоцианов 60
3.1 Пленарная хроматография 60
3.2 УФ и видимая спектроскопия 64
3.3 ИК-спектроскопия 69
3.4 Заключение по главе 75
ГЛАВА 4 Выделение и анализ антоциановых красителей 76
4.1 Основные характеристики антоциановых красителей 76
4.2 Разделение компонентов антоциановых красителей методом тонкослойной хроматографии 77
4.3 Спектральные характеристики антоциановых пигментов красителей 80
4.4 Изучение состава антоциановых красителей методом ВЭЖХ 86
4.5 Неокрашенные компоненты антоциановых красителей 89
4.6 Использование сканера в качестве аналитического прибора для проведения количественного анализа антоциановых красителей 93
4.7. Заключение по главе 104
Глава 5 Выделение антоциановых пигментов методом колоночной хроматографии 105
5.1 Изучение условий выделения пигментов 105
5.2 Сравнительный анализ оптических параметров красителей, выделенных экстракцией и концентрированием 110
5.4. Качественный анализ пигментного состава концентратов методом ВЭЖХ 114
5.5 Сравнительный анализ концентратов, выделенных после хранения в
сорбированном состоянии 117
5.7. Спектральные характеристики отдельных фракций антоциановых пигментов,
выделенных методом колоночной хроматографии 121
5.8. Заключение по главе 130
Основные результаты и выводы 131
Список литературы
- Выделение и разделение антоциаиовых пигментов хроматографическими методами
- Определение количества красящих веществ в натуральных красных пищевых красителях
- УФ и видимая спектроскопия
- Разделение компонентов антоциановых красителей методом тонкослойной хроматографии
Введение к работе
биологической активностью и используются не только как натуральные
пищевые красители, но и как биологически активные добавки. Для пищевой и
фармацевтической промышленности актуальной проблемой является
разработка способов выделения и недорогих, экспрессных методик
качественного и количественного анализа АЦ в растительном сырье, экстрактах
и пигментсодержащих продуктах. Важнейшей стадией аналитического
контроля АЦ является пробоподготовка, включающая в себя экстракцию и
концентрирование аналита. В этом плане интерес представляет метод
колоночной хроматографии с применением неионогенных макропористых
сорбентов, используемых для концентрирования биологически активных
веществ.
Работа выполнена в соответствии с планами НИР ВГТА по теме «Выделение, изучение состава и свойств природных и модифицированных биологически активных органических соединений из растительного сырья», с координационным планом Научного совета РАН по адсорбции и хроматографии 2004-2007 г. (код 2. 15. 7. 2., раздел «Синтез и исследование свойств полимерных сорбентов и носителей для хроматографии»). Часть работы выполнена в рамках гранта РФФИ № 06-08-00448 «Разработка методов диагностики качества продукции по параметрам цветности с применением цифровых технологий».
Цель работы состояла в разработке комплекса методик качественного и количественного анализа АЦ с использованием спектрофотометрии, цветометрии, планарной и колоночной хроматографии.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
выделить АЦ пигменты из красителей, полученных из природного сырья, методами тонкослойной и колоночной хроматографии;
провести анализ хроматографических и спектральных характеристик модельных антоциан-3-глюкозидов (АЦ-3-Glu) и АЦ, выделенных из экстрактов выжимок ягод ежевики, черной смородины, черноплодной рябины и соцветий каркаде;
установить закономерности сорбции и разделения АЦ пигментов на минеральных и органических сорбентах;
разработать методики количественного анализа антоциановых соединений в красителях с применением компьютерных технологий.
Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем:
найдены условия разделения АЦ пигментов методами бумажной и тонкослойной хроматографии;
предложен способ оценки качества антоциансодержащих красителей с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ). Методика защищена положительным решением о выдаче патента РФ (заявка № 2006121294/28(023118) «Способ оценки качества антоцианового красителя, полученного бескислотным способом»);
разработан способ выделения АЦ пигментов из разбавленных водных растворов с применением метода колоночной хроматографии на неионогенном сорбенте - Стиросорб-МХДЭ-100. Методика защищена патентом на изобретение РФ № 2302436 «Способ получения антоцианового красителя»;
рассмотрены условия длительного хранения природных АЦ, в сорбированном состоянии с использованием макропористых неионогенных матриц;
- предложены градуировочные зависимости по параметрам цветности для
нахождения концентрации АЦ пигментов в водных и этанольных растворах.
Практическая значимость работы. Приоритет, новизна и практическая
значимость исследований подтверждена патентом на изобретение РФ и положительным решением на выдачу патента РФ.
На основании проведенных исследований установлена целесообразность использования иеионогенного сорбента марки Стиросорб-МХДЭ-100 для выделения АЦ пигментов из разбавленных водных растворов с целью получения концентрата, необходимого в пищевой и фармацевтической промышленности. Методика разделения АЦ методом ТСХ позволяет не только выделять отдельные пигменты, но и делать выводы о качестве и биологической ценности анализируемого красителя. Разработаны условия длительного хранения АЦ с использованием макропористых неионогенных матриц, позволяющие увеличить срок использования красителя без привлечения стабилизирующих добавок.
Положения, выносимые на защиту:
оптимальные условия разделения АЦ пигментов экстрактов растительного сырья методами планарной хроматографии;
способ концентрирования АЦ из разбавленных растворов методом колоночной хроматографии с применением иеионогенного макропористого сорбента марки Стиросорб-МХДЭ-100;
цветометрические способы количественного анализа АЦ водных и этанольных растворов.
Апробация работы. Результаты работы доложены на II Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фарм. образования» Фармобразование - 2005 (Воронеж, 2005 г.); III Международной конференции «Экстракция органических соединений» ЭОС - 2005 (Воронеж, 2005 г.); Международной конференции «Научное обеспечение и тенденции
развития производства пищевых добавок в России» (Санкт-Петербург, 2005 г.); III Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» ФАГРАН-2006 (Воронеж, 2006 г.); Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» Фармобразование - 2007 (Воронеж, 2007 г.); 61 региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006 г.); VIII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии» (Казань 2007 г.); на ежегодных отчетных конференциях, проводимых Воронежской государственной технологической академией (Воронеж 2005,2006 г.г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, одна из которых в издании, рекомендованном ВАК РФ, 9 тезисов докладов, получен патент на изобретение РФ.
Выделение и разделение антоциаиовых пигментов хроматографическими методами
Метод колоночной хроматографии ранее других хроматографических методов был применен при исследовании флавоноидов. Этим способом как предварительно очищают вытяжку из растительного сырья, так и проводят разделение флавоноидов всех типов, особенно АЦ [18,92-94].
Для хроматографии фенольных соединений на колонке используют в качестве сорбентов полиамид, поливинилпирролидон, порошкообразную целлюлозу и ионообменные смолы. Краткие сведения о применении этих сорбентов представлены в таблице 1.1.
Применение полиамида обусловлено возможностью возникновения водородных связей между фенольными гидроксилами и амидными группами, так что такая колонка имеет в 100 раз большую емкость, чем обычная адсорбционная. Для получения более хорошего адсорбирования АЦ необходимо использовать экстракты со значением рН не выше 2.
Адсорбционная способность поливинилпирролидона в три раза больше, чем у полиамида. Степень элюирования не зависит от рН воды, использованной для промывания в диапазоне от 2,0 до 4,5, и от концентрации спирта — от 10 до 95% при том же диапазоне рН. Длина колонки от 35 до 70 см при диаметре 1,5 см. Отмечали, что если в течение двух дней оставить колонку неэлюированной, залитой водой или 80%-ным метанолом (нейтральная среда), то выход АЦ при элюировании не уменьшается при достоверности вывода 90% [18].
АЦ сорбируются на целлюлозе прочнее Сахаров, но уступают другим флавоноидам. Колонка из целлюлозы не позволяет хорошо очистить АЦ, имеющие большие Rf - значения, и их необходимо дополнительно очистить ацетатом свинца [18]. Целлюлозной колонкой можно пользоваться как для группового отделения красящих веществ от Сахаров и прочих соединений в исходных растительных экстрактах, так и для фракционирования красителей.
Для выделения АЦ применяют амберлиты, дауэкс и аналогичные им смолы. Гликозиды можно сначала элюировать из колонки водными спиртами, например 20%-ным изопропиловым [92] или 95%-ным этанолом, содержащем 0,25 М соляную кислоту, а затем с помощью 95%-ного спирта — агликоны. Смолы амберлит IRG-50 и IR-120, а также и дауэкс-50 адсорбируют почти все количество АЦ из водных растворов, десорбция 95%-ным этанолом полнее всего достигается из амберлита IRG-50 [18]. Задержанные водорастворимые органические и неорганические вещества могут быть удалены многократным промыванием водой. Считается, что АЦ задерживаются на смоле не ионными силами, а водородными связями и Ван-дер-ваальсовыми силами [18]. Единственной помехой может оказаться склонность гликозидов к гидролизу на кислой колонке [93]. Ац цветов Camellia japonica отделяли от АЦ на колонке (1,3X12 см) с амберлитом IR-120 в водородной форме; при этом АЦ количественно сорбировались на смоле, в то время как Ац легко экстрагировались этилацетатом, откуда их выделяли после нейтрализации 0,1 MNaOH[94].
Высокомолекулярные танины, ацилированные и неацилированные АЦ разделяются с помощью гельфильтрации сефадексом G-25, а элюируются смесью воды и ацетона при низком рН. Полимерные фракции легко отделялись в виде узкой зоны, однако ввиду сильной адсорбции полного разделения АЦ не достигли. Фракционирование АЦ достигнуто при распределительной хроматографии на сефадексе в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1:5) [18].
Анализ данных показал, что полное разделение АЦ пигментов методом колоночной хроматографии недостигнуто, хотя удавалось отделять ацилированные структуры от неацилированных (сефадекс G-25), разделять гликозиды от агликонов (амберлиты). Успешно можно использовать этот метод для уменьшения содержания примесных компонентов, таких как высокомолекулярные танины, гельфильтрацией на сефадексе G-25; сахара и другие флавоноиды - на порошкообразной целлюлозе. Отмечено, что достигнуто разделение пигментов при повторном хроматографировании на поливинилпирролидоне, но неясно, какие именно структурные формы разделили.
Для разделения и анализа антоциансодержащих образцов широко применяют методы плоскостной хроматографии. Бумажная (БХ) и тонкослойная (ТСХ) хроматография просты по технике выполнения, экспрессны, не требуют дорогостоящего оборудования. Накоплен большой материал по анализу АЦ пигментов методом БХ, с которым можно ознакомится в [18, 92-94]. По очевидным причинам в наши дни ТСХ используют чаще, чем бумажную [117-120]. Разделение осуществляли на пластинах с адсорбентами: кислым гелем G, порошкообразной целлюлозой, смесью из полиакрилонитрила, полиамида, окиси алюминия и смеси поливинилпирролидона и целлюлозы. Большой выбор подвижных фаз для разделения пигментов методами планарной хроматографии не решает проблему оптимизации разделения АЦ пигментов из сырых экстрактов [18,94].
В методиках по разделению пигментов часто указывают на необходимость предварительной очистки сырых экстрактов осаждением раствором ацетата свинца в метаноле или колоночной хроматографией.
Гупта [18] испытал ряд растворителей, применяемых в хроматографии АЦ на бумаге, и нашел, что среди испытанных растворителей только верхняя фаза смеси н-бутанол-уксусная кислота-вода (4 : 1 : 5) и смесь вода-уксусная кислота-соляная кислота (82 : 15 : 3) пригодны для ТСХ на слоях целлюлозы. Предложен способ разделения пигментов на слоях целлюлозы с размером пластин 12 16 см методом двумерного элюирования сначала смесью муравьиная кислота-соляная кислота-вода (10 : 1 : 3) вдоль короткой стороны пластинки, а затем смесью амиловый спирт - уксусная кислота - вода (2:1:1) вдоль длинной стороны.
Определение количества красящих веществ в натуральных красных пищевых красителях
Интенсивность окраски исследуемого раствора красителя и стандартного сравнивали на колориметре КФК-2 при толщине измеряемого слоя 1см и длине волны света 540 им.
Стандартный раствор готовили следующим образом: взвешивали точно 20 г кристаллического сернокислого кобальта, растворяли в химическом стакане в дистиллированной воде и количественно переносили в мерную колбу вместимостью 1000 мл. Раствор в колбе доводили до метки дистиллированной водой при температуре 20С и все хорошо перемешивали. Приготовленный стандартный раствор сернокислого кобальта по интенсивности окраски соответствует содержанию 22 мг красящего вещества (энина).
Затем готовили испытуемый раствор красителя. Навеску хорошо перемешанной пробы образца красителя в количестве 1-4 г (в зависимости от содержания пигмента) взвешивали с точностью до 0,0002 г, разбавляли в химическом стакане дистиллированной водой, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 1000 мл. К раствору мерным цилиндром доливали 40 мл концентрированной соляной кислоты и содержимое колбы доводили дистиллированной водой до метки (температура 20С). Если приготовленный раствор получали мутный или содержащий нерастворимые частицы, его фильтровали через складчатый фильтр.
Содержание красящих веществ в растворе красителя рассчитывали по формуле: где х - концентрация красящих веществ, г/л; Aj - оптическая плотность стандартного раствора сернокислого кобальта, 490 нм; А2 - оптическая плотность испытуемого раствора красителя, 540 нм; m - масса навески красителя, г [79].
Для определения величины рН отвешивали 5 г красителя с точностью 0,01 г, растворяли в дистиллированной воде в химическом стакане и количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл. Содержимое колбы разбавляли дистиллированной водой при температуре 20С до метки и измеряли величину рН полученного раствора красителя на рН-метре. Определение рН проводили при температуре раствора красителя 20С [79].
Инструментальным сигналом в спектрофотометрическом анализе является величина оптической плотности (А) испытуемого раствора при выбранной аналитической длине волны. Поведение поглощающих свет систем подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера при определенных условиях. Причины отклонения от основного закона светопоглощения могут быть кажущимися (инструментальные, химические) и истинными. Истинные причины связаны с изменениями в окружении поглощающих частиц при повышении концентрации и с допущениями, сделанными при выводе закона. Не все значения А можно измерить с одинаковой точностью, существует оптимальный диапазон измерения светопоглощения. При работе на фотоэлектроколориметрах оптимальный рабочий диапазон оптической плотности изменяется от 0,1 до 0,7 [95].
Наиболее распространенным способом определения концентрации по оптической плотности является метод градуировочного графика. По экспериментальным данным зависимости величины оптической плотности от концентрации строят градуировочный график, по которому оценивают количество аналита в образце, используя инструментальный отклик, полученный для образца посредством интерполяции. Этот процесс известен как обратная регрессия [191-194].
Параметры градуировочных моделей рассчитывали математически, в данной работе с применением программного пакета Statgrahics Plus 3.0. Наилучший подход при выборе модели состоит в том, чтобы использовать настолько простую функцию, насколько это возможно, каждый раз, проводя оценку дисперсии адекватности модели. Для нахождения содержания вещества в анализируемом образце представляли найденную функцию в обращенном виде [194].
УФ и видимая спектроскопия
Хроматографирование АЦ-3-Glu в системах БУВ и АУВ осуществляли на силикагеле - наиболее часто используемом в НФ ТСХ сорбенте. Данные, представленные в таблице 3.2, позволяют выбрать из рассматриваемых комбинаций сорбент-элюент наиболее подходящую пару для хроматографирования пигментов.
Отметим, что отсутствие данных в таблице 3.2 о результатах хроматографирования АЦ-3-Glu на пластинах марки «Sorbfil» элюентом БУВ вызвано тем, что процесс хроматографирования в этих условиях описывается выпуклой изотермой сорбции, т.е. зоны пигментов деформированы (вытянуты) по линии движения растворителя. Это явление несопоставимо с качественным и тем более количественным анализом веществ в тонком слое сорбента. На пластинах марки «Silufol» в БУВ зоны АЦ имеют правильную форму, пластины характеризуются более высокими значениями N и более низкими Н (за исключением Md), чем при хроматографировании в АУВ. Несмотря на это, с точки зрения универсальности элюента БУВ для хроматографирования пигментов выявлены недостатки, имеющие решающее значение. А именно: происходит обесцвечивание зоны Df-3-Glu, пигменты с Рп и Md основой имеют близкие значения Rf. Поэтому при изучении состава и идентификации пигментов предпочтительнее использовать систему АУВ, в которой величина Rf отличается для каждого пигмента, хроматографические зоны имеют правильную форму и сохраняется характерная окраска АЦ.
В работе использован один тип адсорбента (S1O2 пНгО), имеющий на поверхности ОН-группы, способные удерживать вещества с образованием Н-связей. Разделение на силикагеле протекает преимущественно по адсорбционному механизму. Рассмотренные подвижные фазы отличаются хроматографическими характеристиками. Сила элюента АУВ, рассчитанная по Снайдеру в условиях нормально-фазовой хроматографии составляет, 5,85, а БУВ - 7,26. Следовательно, растворимость и взаимодействие АЦ с молекулами растворителя выше в подвижной фазе БУВ. Следствием этого является то, что АЦ-3-Glu соответствуют более высокие значения Rf при хроматографировании в системе БУВ (табл. 3.2), являющейся более сильным растворителем, чем АУВ, и наблюдаемая деформация хроматографических зон на пластинах марки «Sorbfil».
Количественный анализ, проводимый непосредственно на хроматограммах, предпочтительнее осуществлять на пластинах, характеризуемых меньшим разбросом размера частиц сорбента относительно среднего значения, поскольку при этом улучшается соотношение сигнал/шум, снижается предел детектирования и метод становится более чувствительным. Для этого лучше подходят пластины марки «Sorbfil», разброс размера частиц сорбента которых 8-10 мкм, в то время как для пластин «Silufol» - 5-40 мкм.
Хроматографические зоны рассматриваемых АЦ-3-Glu имеют характерную окраску. Первоначально идентификацию АЦ проводили на основе их цвета. Несмотря на то, что современный подход основывается на использовании комплекса хроматографических, химических, спектральных и других методов, цветовые особенности пигментов, тесно связанные с их строением, могут служить одним из векторов для дальнейших исследований.
Нами отмечено сильное проявление структурных особенностей пигментов, а именно степени метилирования и гидроксилирования фенольных колец Ац, в окраске хроматографических зон на высушенных пластинах. Для АЦ-3-Glu Md и Рп, содержащих метилированные гидроксидные группы в фенольном кольце, характерна розовая окраска. Увеличение числа гидроксидных групп проявляется в изменении цвета от розового к синему, наблюдаемом для производных Pt и Df. Отмеченная связь структуры Ац и окраски хроматографической зоны иллюстрирует схема:
Интересно, что при визуальной оценке АЦ-3-Glu, находящихся в водном растворе при рН=1,5, наблюдается отсутствие различий в окраске и для всех характерен красный оттенок.
Такие представители флавоноидов как кверцетин и катехин, на хроматографических пластинах со слоем силикагеля в растворителях АУВ и БУВ имеют значения Rf больше 0,8. Завышенные значения являются следствием повышенной гидрофобности молекул, из-за отсутствия углеводных остатков. Следовательно, для гликозидов следует ожидать значения Rf несколько ниже.
Разделение компонентов антоциановых красителей методом тонкослойной хроматографии
Качественный состав красителей, как правило, специфичен для конкретного вида растений и довольно стабилен. Однако он зависит от сортовых особенностей, условий произрастания растения, качества сырья и способа получения. Состав красителей, полученных спиртовой экстракцией из природного сырья, можно представить сложной многокомпонентной матрицей, состоящей на 30-40% из пигментов и 60-70% сопутствующих веществ.
Одним из распространенных способов качественного и количественного анализа красителей является метод ВЭЖХ. Однако, использование сложной дорогостоящей аппаратуры, трудности, связанные с подготовкой прибора к анализу, необходимость применения адекватных образцов сравнения ограничивает его применение. Более доступный, с материальной точки зрения, и в то же время экспрессный метод разделения и идентификации пигментов красителей - ТСХ. Выбор условий является главным фактором эффективного применения метода. Установлено, что наиболее эффективно хроматографический процесс АЦ-3-Glu происходит на пластинах со слоем силикагеля в системе растворителей АУВ. Однако, когда имеют дело с многокомпонентными системами, возникает задача разделения. По этому наряду с такими величинами как Н и N основной характеристикой эффективности процесса служит величина разрешающей способности R . Разделение двух соседних зон считается полным при R 1,5.
Результаты расчетов, позволяющие оценить эффективность разделения пигментов красителей из различного природного сырья в системе АУВ на пластинах марки «Silufol», представлены в таблице 4.2.
На хроматограммах ежевичного и черносмородинового красителя отчетливо различаются три зоны АЦ, следовательно, красители из этого вида сырья имеют более разнообразный пигментный состав по сравнению с красителями из каркаде и черноплодной рябины, для которых отмечено по две хроматографические зоны АЦ (табл. 4.2). На основании значений R , представленных в таблице 4.2, можно заключить, что на пластинах марки «Silufol» в системе растворителей АУВ достигается полное разделение пигментов красителей, за исключением АЦ каркаде, для которых величина разрешающей способности двух соседних зон с Rn=0,33 и RQ=0,37 равна 0,7.
Повысить эффективность хроматографирования можно увеличением полярности элюента или за счет использования неподвижной фазы с улучшенными свойствами. На примере пигментов каркаде проведем оценку влияния этих двух факторов. В таблице 4.3. представлены параметры, позволяющие оценить эффективность разделения АЦ в системе АУВ на пластинах марок «Sorbfil» и «Merk», и в более сильном элюенте БУВ на пластинах марок «Silufol» и «Merk».
Полное разделение АЦ каркаде, характеризуемое величиной разрешающей способности R =2,3, достигается в системе АУВ на пластинах марки «Sorbfil». Разделение пигментов происходит и в системе БУВ на пластинах «Merk», R =1,5.
Можно сделать вывод, что для разделения АЦ природных красителей методом ТСХ с целью последующего изучения выделенных со слоя сорбента веществ в качестве неподвижной фазы более предпочтительными являются пластины со слоем силикагеля марки «Sorbfil» и подвижной фазы - АУВ [196, 197].
Разделенные АЦ пигменты красителей методом ТСХ в найденных нами условиях выделены со слоя сорбента экстракцией этанолом.
Изучение спектров поглощения антоциансодержащих растворов позволяет получить некоторую информацию о строении пигментов. По положению характеристических максимумов в УФ (А7) и видимой области (X ) света можно предположить какой Ац является основой структуры пигмента. Помимо основных максимумов в спектрах АЦ в области 260 нм и 540 нм наблюдается появление дополнительного максимума около 310-355 нм, характерного для ацилированных структур. Этот максимум является результатом наложения спектра ацилирующей кислоты на спектр АЦ. Так, при ацилировании н-кумаровой кислотой максимум наблюдается в области 308-313 нм, а кофейной - 326-329 нм. Неацилированные структуры также имеют максимум в этой области, но менее интенсивный. Поэтому важное значение в изучении АЦ имеет отношение А\ ац/А /щах, которое для неацилированных структур менее 30%. Ацилированной молекулу можно считать, єсли а ац/а/тах 48% [18].
Такие спектральные показатели как соотношения а/щах/а/тах и ашо/a/max, позволяют отличить моногликозиды (сз) от дигликозидов (с3 5). так как дигликозиды имеют меньшую интенсивность абсорбции при X щах И Х}40 по сравнению с моногликозидами, оба этих соотношения у дигликозидов ниже, чем у моногликозидов. Величина первого выражения для моногликозидов изменяется от 50% и выше, а для дигликозидов не превышает 45%; величина второго выражения для моногликозидов - от 18 до 40%, а для дигликозидов - 9-20% [18]. В таблице 4.4 представлены важные спектральные показатели при Идентификации АЦ: СООТНОШеНИЯ Aj, шах/Ах max, Ах WAx шах И АХ ац/Ах max, вычисленные по спектрам поглощения выделенных пигментов красителей ежевики, каркаде, черной смородины и черноплодной рябины.
