Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время наиболее приоритетным направлением в производстве вакцин, диагностических и про-, филактических препаратов, многих биологически активных веществ становится клеточная биотехнология. Воспроизводимость биотехног логических процессов, связанных с культивированием клеточных линий млекопитающих и насекомых, а также качество биопрепаратов могут в значительной степени зависеть от содержания микроэлементов в питательных средах и сыворотке крови животных - основном источнике микроэлементов в питательной среде. Необходима стандартизация питательных сред и, соответственно, сыворотки крови животных по содержанию микроэлементов. Поскольку существует взаимозависимость влияния микроэлементов на клеточные системы, когда эффект влияния одного элемента зависит от концентрации другого, то возникает необходимость одновременного контроля ряда микроэлементов в сыворотке крови на уровне 1-10мкг/л. Наибольшими возможностями для решения этой задачи обладают многоэлементные методы анализа.
Атомно-эмиссионный анализ благодаря доступности, простоте, еысокой чувствительности вполне пригоден для серийного анализа биологических образцов при решении задач биотехнологии. Поскольку определение следовых элементов в сыворотке крови прямым этомно-эмиссионным методом на фоне высокого содержания основных элементов практически невозможно, становится необходимым предварительное концентрирование и разделение элементов перед их непосредственным определением. Использование концентрирования в сочетании с методом- атсмно-эшссионного анализа позволяет устранить влияние матричного эффекта и снизить предел: обнаружения микроэлементов до уровня 10-10 г/г.
Следовательно, разработка новых многоэлементных методов анализа биологических образцов с предварительным концентрированием микроэлементов (10) является весьма актуальной задачей. Успех решения этой задачи определяется прежде всего эффективностью концентрирования IS, позволяющего расширить возможности применения существующих инструментальных методов анализа.
Цель работы. Целью диссертации является разработка унифицированных химико-атомно-эмиесионных методов анализа сыворотки крови, позволяющих оценить влияние микроэлементов на качество
питательных сред.
Для решения поставленной задачи было необходимо: выбрать сорбционную систему для извлечения микроэлементов из минерализованной сыворотки крови;
исследовать влияние на эффективность извлечения микроэлементов способа.подготовки сорбента;
исследовать- влияние, остатков макрокомпонентов на интенсивность спектральных линий микроэлементов;
выбрать эффективный и достаточно ёмкий экстрагент для отделения основных компонентов при атомно-емиссионном анализе сыворотки крови;
изучить поведение микроэлементов в выбранной экстракционной системе;
оценить возможность и целесообразность использования разработанных аналитических методов в реальных биотехнологических процессах.
Научная новизна работы. Впервые показана возможность использования суспензии дибензо-І8-краун-б (ДБІ8К6) в >,$ -дихлорди-этиловом эфире, как эффективного и избирательного экстрагента для одновременного извлечения Na, К и Ре из солевых растворов.
Предложен способ разделения микро- и макрокомпонентов при анализе сыворотки крови, заключающийся в экстракционном извлечении основных компонентов суспензии* ДБІ8К6 в хлорексе.
Исследована экстракция Na и К ДБШКб в хлорексе из хло -ридно-перхлоратных растворов, сделан вывод о составе экстрагируемых комплексов.
Показана возможность сорбционного извлечения из минерализованной сыворотки крови б рекомендуемых условиях II микроэлементов хелатообразующим сорбентом полиарсеназо.
Продемонстрирована применимость разработанных аналитических методов для серийного анализа промышленных образцов сыворотки крови животных, используемой в биотехнологии.
Экспериментально доказана целесообразность введения понятия "минимальная предельно допустимая концентрация микроэлементов" применительно к компонентам биотехнологических питательных сред.
Практическая ценность работы. Разработан метод сорбционно-атомно-эмиссионного анализа сывороткя крови, позволяющий проводить определение II"микроэлементов с пределами обнаружения
0,8-5,0 мкг/л.
Разработан метод экстракиионно-атомно-эмиссионного анализа сыворотки крови, дающий возможность определять 21 элемент с-пределами обнаружения 0,2-100 мкг/л.
Продемонстрирована возможность количественного описания влияния микроэлементов на пролиферацию клеточных систем, что позволяет проводить сопоставление чувствительности клеток к воздействию микроэлементов.
Впервые обнаружено снижение содержания микроэлементов в сыворотке крови после обработки её полиэтиленгликолем (ПЭГ); показана возможность увеличения пролиферативной активности сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), обработанной. ПЭГ, путём введения в неё ионов металлов до уровня их содержания в сыворотке крови плодов коровы.
Разработанные химико-атомно-эмиссионные методы использованы Новосибирским медицинским институтом для анализа крови здоровых людей (доноров) и людей, контактирующих с комплексом токсических веществ, а также НПО "Вектор" для анализа различных видов сыворотки крови животных.
Автор защищает; обоснование пригодности использования сорбента полиарсена-зо для сорбционного концентрирования микроэлементов при анализе сыворотки кроЕи;
обоснование возможности использования суспензии ДБІ8К6 в хлорексе для экстракционного отделения Na, К и Fe при анализе сыворотки крови;
выводы по экстракции Na и К из хлоридно-перхлоратных сред; методические разработки по анализу сыворотки крови; результаты изучения концентрационных зависимостей влияния микроэлементов на пролиферацию различных клеточных систем (клетки почек сирийского хокячка (ВНЮ; клетка легких эмбриона человека (ЛЭЧ1, клетки непарного шелкопряда (SCEd -135).
Апробация работы. Результаты работы доложены на сессии Сибирского отделения Научного совета по аналитической химии Кемерово, 1988 г.), ХІУ годичной сессии Научного совета АН СССР по аналитической химии (Суздаль, 1989 г.), Всесоюзной конференции по разработке и производству препаратов медицинской био -технологии (Махачкала, 1990 г.), Ш Всесоюзном совещании по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1990 г.),
1ІІ Всесоюзной конференции по.методам концентрирования в аналитической химии.(Черноголовка, 1990 г.), XI Международной, конференции по аналитической спектроскопии (Москва, 1990 г.), УП Европейской конференции по .аналитической химии (Вена, 1990 г.), Всесоюзной конференции по питательным средам- и сывороткам для культур клеток (Кольцово, 199I г.).
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, трёх экспериментальных глав, выводов, списка литературы и приложения. Она изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, I? таблиц и библиографию из 195 наименований.
Методика исследований. Поведение микро- и макрокомпонентов в минерализованной сыворотке крови при сорбционном концентрировании і>В изучали атомно-абсорбционным и атомно-эмиссионным методами.
іУІєжфазное распределение натрия и калия определяли по их эмиссии в воздушно-ацетиленовом пламени с использованием спектрофотометра фирмы "Реикш EtmeR", модель 303. Поведение микроэлементов при экстракции изучали атомно-эмиссионным методом, используя кварцевый спектрограф /1СП-2Ь. Почернение аналитических линий элементов измеряли на микрофотометре Ш?-2.
В качестве объектов анализа служила сыворотка крови животных производства НПО "Вектор". Перевиваемые клеточные культуры, охарактеризованные в соответствии с паспортными данными, получали из музея клеточных культур НПО "Вектор". Счет клеток производили в камере Горяева.
