Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 Характеристика антибиотиков макролидов 11
1.2 Основные свойства азитромицина дигидрата 15
1.3 Физико-химические методы количественного определения макролидных антибиотиков 18
1.4 Исследование электрохимических процессов азитромицина дигидрата методом вольтамперометрии... 28
1.5 Формулировка задач исследования 30
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2 Аппаратура и методика проведения эксперимента
2.1 Приборы, электроды, ячейки 32
2.2 Приготовление растворов, посуды 35
2.3 Методика проведения эксперимента 36
Глава 3 Выбор рабочих условий для вольтамнерометрического определения азитромицина дигидрата
3.1 Рабочие условия определения азитромицина на стеклоуглеродном электроде методом дифференциальной вольтамперометрии 38
3.2 Выбор рабочих условий определения азитромицина дигидрата на ртутно-пленочном электроде 44
3.3 Оценка предела обнаружения 50
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Глава 4 Вопросы теории процессов разряда-ионизации азитромицина дигидрата на различных типах электродов и их опытная проверка
4.1 Вольтамперометрическое исследование процессов разряда-ионизации азитромицина 53
4.2 Квантово-химическая оценка структуры и реакционной способности азитромицина 60
4.3 Математическая модель процесса окисления азитромицина дигидрата на СУ электроде 64
4.4 Изучение процесса адсорбции азитро.мицина дигидрата.. 68
Глава 5 Вольтамперометричсское определение азитромицина дигидрата в лекарственных препаратах и биологических объектах
5.1 Изучение мешающего влияния органических соединений и неорганических ионов на аналитический сигнал азитромицина 85
5.2 Методика определения азитромицина дигидрата в лекарственных препаратах и биологических объектах 91
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 95
ВЫВОДЫ 104
ЛИТЕРАТУРА 106
ПРИЛОЖЕНИЕ 117
- Характеристика антибиотиков макролидов
- Приборы, электроды, ячейки
- Рабочие условия определения азитромицина на стеклоуглеродном электроде методом дифференциальной вольтамперометрии
- Вольтамперометрическое исследование процессов разряда-ионизации азитромицина
- Изучение мешающего влияния органических соединений и неорганических ионов на аналитический сигнал азитромицина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Определение таких лекарственных форм как антибиотики, чрезвычайно важно для оценки фармакологического действия и эффективности антибактериальной терапии, идентификации действующих веществ в лекарственных формах, а также его метаболитов в биологических матрицах. В последнее время много внимания уделяется синтезу новых форм антибиотиков. Таким примером служит азитромицин дигидрат, который является представителем антибиотиков макролидного ряда, однако, относится к отдельной подгруппе азалидов, за счет отличия в строении молекулы. Азитромицин относится к полусинтетическим антибиотикам второго поколения и обладает высокой микробиологической и клинической эффективностью в лечении ряда тяжелых инфекций дыхательных путей, кожи и мягких тканей, некоторых урогенитальных инфекций.
Еще одной проблемой, которая требует разработки новых, более чувствительных и селективных методов анализа, и, в частности, электрохимических методов, остается проблема фальсификации лекарственных препаратов. По различным данным доля поддельных медикаментов достигает в среднем 10-15% от общего оборота лекарственных средств.
Фальсифицированные продукты могут включать препараты с неточным составом, неправильными ингредиентами, без содержания или с недостаточным содержанием действующих веществ, или с поддельной упаковкой. По оценкам различных исследований, в настоящее время фальсификация идет в основном по пути уменьшения содержания действующего вещества в препарате.
Для выхода из сложившейся ситуации в последние 2 года были созданы нормативно-правовые базы для урегулирования контроля выпуска лекарственных средств. В связи с этим повышаются требования к методам контроля фармпрепаратов. Учитывая вышеперечисленное, необходим эффективный контроль за качеством выпускаемых препаратов, в состав которых входят антибиотики.
Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством лекарственных средств и совершенствованию методов количественного определения антибиотиков, в том числе группы макролидов.
Перед химиками-аналитиками ставится задача разработка новых, более совершенных методик анализа, позволяющих с высокой точностью и селективностью определять лекарственные вещества в более широких интервалах определяемых содержаний с небольшими материальными затратами.
При выборе инструментального метода контроля лекарственных средств учитываются ряд требований: возможность определения следов органических веществ, находящихся в пробе с минимальной погрешностью, достаточная селективность, отсутствие сложной процедуры пробоподготовки, возможность автоматизации методики, минимально возможное время исследования, достаточная универсальность (возможность многоэлементного анализа), минимальная массогабаритность оборудования.
В данной работе рассматриваются возможности вольтамперометрического определения антибиотиков макролидного ряда в различных объектах, на примере азитромицина дигидрата. Проводимые исследования направлены на увеличение чувствительности, серийности и экспрессности проводимых анализов. ""~~
7 Цель работы. Целью данной работы является разработка методики количественного определения азитромицина дигидрата в биологических средах и фармпрепаратах, а также проведение теоретических и экспериментальных исследований его вол ьтамперометричес кого поведения.
Научная новизна:
Впервые показана способность антибиотика-макролида азитромицина дигидрата окисляться на стеклоуглеродном электроде, а так же его способность к восстановлению на ртутно-пленочном электроде. Установлены рабочие условия его вольтамперометрического определения. Рассчитаны некоторые кинетические параметры данных реакций фп, к/г).
Впервые выполнены квантово-химические расчеты для молекулы азитромицина и его радикальных форм с целью определения наиболее реакционноспособной группы.
Решена краевая задача для процесса электроокисления азитромицина на стеклоуглеродном электроде в анодной вольтамперометрии. Рассмотрены способы оценки кинетических параметров этого процесса.
Теоретически и экспериментально исследован процесс адсорбции азитромицина на ртутно-пленочном и стеклоуглеродном электродах различными методами.
Разработан алгоритм подготовки проб биологических объектов (сыворотка и плазма крови) для последующего определения следовых количеств азитромицина вольтамперометрическим методом.
Впервые разработаны методики количественного химического анализа проб лекарственных препаратов (таблетки, капсулы) и биообъектов на содержание азитромицина дигидрата методом инверсионной вольтамперометрии на стеклоуглеродном электроде.
8 Практическая значимость работы.
Разработана и метрологически аттестована методика количественного химического определения азитромицина дигидрата в лекарственных препаратах методом инверсионной вольтамперометрии. Способ количественного определения азитромицина дигидрата методом инверсионной вольтамперометрии защищен патентом РФ.
Методика количественного анализа азитромицина в биологических объектах (сыворотка крови, моча, ткани) нашла практическое применение в лаборатории молекулярной фармакологии НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН г. Томска, ветеринарных службах г. Кемерова, г. Томска, а также контролирующих лабораториях ЦСМ (г. Томска, г. Кемерова, г. Новосибирска).
На защиту выносятся следующие положения:
Рабочие условия вольтамперометрического определения азитромицина дигидрата на стеклоуглеродном и ртутно-пленочном электродах.
Возможный механизм электрохимической реакции азитромицина дигидрата, протекающей на электроде с учетом молекулярного строения, реакционной способности и материала электрода.
Параметры электродной реакции с участием антибиотика и его адсорбционная способность.
Вольтамперометрический способ оценки некоторых параметров адсорбции на примере азитромицина дигидрата.
Алгоритм методик количественного химического анализа лекарственных препаратов и биологических жидкостей (сыворотка и плазма крови) на содержание азитромицина методом инверсионной вольтамперометрии.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, 7 тезисов докладов, получен 1 патент на изобретение РФ. Материалы отдельных разделов диссертационной работы и некоторые полученные результаты освещались на: VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока-2004» (Новосибирск, 2004); III Всероссийской научной конференции «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2004); VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2004» (Уфа, 2004); 8th Korea-Russia International Symposium on Science and Technology (Tomsk, 2004); Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005» (Екатеринбург, 2005); 11-ой школе-семинаре «Кватново-химические расчеты: структура и реакционная способность органических молекул» (Иваново, 2005).
Структура диссертации.
Работа объемом 126 страниц компьютерного текста, включая 31 рисунок и 12 таблиц, состоит из введения, пяти глав, выводов и приложения. Список литературы содержит 107 библиографических источников отечественных и зарубежных авторов.
В первой главе представлен литературный обзор по аналитическим методам анализа макролидных антибиотиков и физико-химическим способам исследования процессов и механизмов, протекающих на электродах. На основании обзора сформулированы задачи исследования. В главе 2 произведено описание используемой аппаратуры, типов электродов, методики проведения эксперимента. Третья глава посвящена установлению рабочих условий вольтам пером етрическо го определения азитромицина дигидрата. В четвертой главе приведены данные по вольтамперометрическому исследованию электрохимической активности
10 азитромицина. Рассмотрен механизм реакции, протекающей на электроде, путем квантово-химических расчетов, а так же методом циклической вольтамперометрин и путем использования вращающегося дискового электрода. Показаны возможности вольтамперометрин в изучении процессов адсорбции на поверхности стеклоуглеродного и ртутно-пленочного электродов. Приведены данные по некоторым физико-химическим параметрам, представляющие теоретический и практический интерес в описании электродного процесса. В пятой главе диссертации приведены разработанные методики количественного химического анализа азитромицина дигидрата в лекарственных препаратах и биологических объектах (сыворотка и плазма крови). Анализ полученных экспериментальных данных приведен в обсуждении результатов. В заключении сделаны выводы. В приложении представлены свидетельства, программа метрологической аттестации и акты о внедрении результатов работы. п ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Характеристика антибиотиков макролидов
Антимикробные препараты группы макролидов вот уже более полувека широко используются в клинической практике и зарекомендовали себя, как высокоэффективные и одни из наиболее безопасных антибиотиков с минимальным числом противопоказаний к их назначению. Основу химической структуры макролидов составляет макроциклическое лактонное кольцо с I, 2 или 3 боковыми углеводородными цепями. В зависимости от числа атомов углерода, составляющих кольцо, все макролиды подразделяются на 14-, 15- и 16-членные, а по происхождению — на природные, полусинтетические и пролекарства [1].
Первым из применяемых в клинической практике макролидов стал эритромицин А, полученный в 1952 году из почвенного грибка Streptomyces erythreus. Дальнейшее усовершенствование макролидов шло путем изменения размеров макролактонного кольца и боковых цепей с целью получения новых лекарственных средств с более высокой кислотоустоичивостыо, биодоступностыо и минимальным мотилиноподобным действием. Данный процесс сопровождался и расширением спектра активности in vitro создаваемых антибиотиков. Все известные макролиды и по строению и физиологическому действию разделяются на две подгруппы. В первую (свыше 30 антибиотиков) входят лактоны, углеродный скелет которых представляет собой насыщенную или содержащую 1-2 двойных связи жирную полиоксикислоту, причём 1 или 2 гидроксильные группы связаны с остатками углеводов [2, 3]. Соединения этой подгруппы (пикромицин, метимицин, парбомицин, олеандомицин, эритромицин, ланкамицин, магнамицин, карбомицин В, макроцин, лейкомицин А и другие) - бесцветные кристаллы, хорошо растворимы в полярных органических растворителях, обладают слабоосновпыми свойствами; активны против большинства грам положительных и некоторых грамотри нательных бактерий (бруцелл), против риккетсий, иногда - против кокков [4, 5]. Механизм их действия состоит в подавлении белкового синтеза в клетках микроорганизмов. Во вторую подгруппу (около 30 антибиотиков) входят лактоны, углеродный скелет которых, помимо гидроксильных групп, содержит 4-7 сопряжённых двойных связей. У большинства макролидов этого типа (их называют также полиеновыми антибиотиками) 1 или 2 гидроксильные группы связаны с остатками аминосахаров. Соединения этой группы (филипин, нистатин, амфотернцин В, пимарицин, лагозин, фунгихромин и другие) - жёлтые кристаллы, разлагающиеся на свету; активны против грибов и дрожжей, но обладают слабым бактериостатическим эффектом [6]. Механизм их действия заключается в нарушении функций цитоплазматических мембран благодаря образованию молекулярных комплексов с входящими в состав мембран стеринами [7]. Биосинтез макролидов грибами-продуцентами протекает по схеме биосинтеза жирных кислот [8].
Приборы, электроды, ячейки
Высокочувствительные методы анализа, такие, как инверсионная вольтамперометрия, предполагают использование высокоточных приборов, регистрирующих величину тока, протекающего в электролитической ячейке, в зависимости от приложенного поляризующего напряжения.
С развитием технического прогресса возрастают требования к измерительной аппаратуре. Анализаторы должны не только обеспечивать достаточную точность измерений, но и обладать соответствующими характеристиками, упрощающими проведение анализа, такими как: компактность размера, простота эксплуатации, максимальная автоматизация обработки результатов.
В работе использовали полярограф ПУ- 1 ГОСТ 22261-76 в комплекте с лабораторным компенсационным двухкоординатным прибором типа ЛКД-4 ТУ 25-05-1625-74 и цифровым вольтметром типа Ф-203 ТУ 25-04-1696-75, для контроля текущего значения поляризующего напряжения в процессе снятия вольтамперных кривых, ПУ-1 имеет пределы изменения напряжения 0-М- В и диапазон скорости изменения потенциала 0,5-405 мВ/с. Максимальная чувствительность полярографа 1-Ю"10 А/мм. В режиме постоянно-токовой полярографии относительная погрешность определения тока не превышала ±3 %, ошибка регистрации напряжения ±2 %.
Аналитический вольтамперометрический комплекс СТА ТУ 4215-001-20694097-98, представляющий собой компактный прибор, состоящий из электронного блока, измерительного блока с тремя электрохимическими ячейками. Комплекс СТА полностью компьютеризирован. Обработка полученных данных проводилась с помощью установленных программ «СТА».
Для исследования механизма электродного процесса использовали анализатор ВАМ - одноканальный вариант анализатора СТА с дополнительными возможностями в виде циклической развертки потенциала, дифференциально - импульсного режима съемки вольтамперограмм, возможностью применить вращающийся электрод.
При исследованиях обратимости процессов электроокисления азитромицина использовался вращающийся дисковый СУ электрод. Скорость вращения задавалась программным способом на анализаторе.
В работе было использовано два вида электрохимической ячейки. Для определения азитромицина дигидрата на стеклоуглеродном электроде, это был вариант трехэлектродной ячейки, а при применении ртутно-пленочного электрода - двух электродная.
Деаэрирование и перемешивание анализируемых растворов в ячейке на стадии электролитического накопления осуществлялось газообразным азотом с содержанием кислорода менее 0,001%.
Определения рН раствора проводились с использованием переносного рН-метра-м и лл и вольтамперметра (рН-673) обычным образом. Погрешность в определении рН раствора не превышала величину ±0,1 %.
Для исследований вольтамперометрического поведения антибиотика в качестве индикаторных электродов были использованы стеклоуглеродный электрод и ртутно-пленочный.
Рабочие условия определения азитромицина на стеклоуглеродном электроде методом дифференциальной вольтамперометрии
Антибиотик обладает способностью окисляться на различных типах графитовых электродов. В качестве индикаторных электродов применяли СУ и графитовый электрод, пропитанный полиэтиленом и парафином в вакууме. Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов, как в водных, так и в неводных средах, а также простотой механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности. Способность к окислению азитромицина зависит от материала электрода и состояния его поверхности. Максимальное значение регистрируемого тока с использование м графитового электрода выше (примерно на 10-15%), однако из-за большого остаточного тока, он оказался менее удобным в работе, чем СУ. Для определения азитромицина использовали «игольчатые» по форме индикаторные электроды, после предварительного электрохимического модифицирования их поверхности. Использование таких электродов приводит к снижению нижней границы определяемых содержаний, улучшению воспроизводимости вольтамперометрических измерений и экспрессности анализа. «Игольчатые» СУ и графитовые электроды впервые использованы для идентификации антибиотиков группы макролидов на примере определения азитромицина. Использование нами данного вида электродов дает широкие возможности для применения фоновых электролитов как водных, так и неводных. Углеродные электроды химически устойчивы, доступны для исследователей и являются нетоксичными [78].
На рисунке 3.1.1. представлена типичная вольтамперограмма окисления азитромицина на СУ электроде снятая в дифференциально-импульсном режиме развертки потенциала.
В таблице 3.1.1. представлены результаты исследования различных фоновых электролитов из которых видно, что относительное стандартное отклонение (Sr) не превышает 0,20 и 0,25 при регистрации анодных пиков соответственно на фонах 0,2 М Na2HP04 и раствора буфера Бриттона-Робинсона рН 8,0+9,0 для диапазона концентраций 2,2-10"0+3,0-10 9 моль/л и Sr равно 0,13 для диапазона концентрации Н0"6+1-10"7 моль/л. При этом более высокие значения тока окисления фиксировались на фоне гидрофосфата натрия (рис. 3.1.2.), что позволяет увеличить чувствительность метода.
Вольтамперометрическое исследование процессов разряда-ионизации азитромицина
В выбранных рабочих условиях ВА определения азитромицина на стеклоуглеродном электроде с помощью циклической вольтамперометрии [80], а так же с использованием вращающегося дискового электрода [86, 87] были получены данные по механизму процесса, протекающему на электроде, и рассчитаны кинетические параметры электродных процессов. Путем квантово-химических расчетов была обоснована структура азитромицина и предложен наиболее вероятный механизм электроокисления антибиотика.
Применение циклической вольтамперометрии дает информацию об обратимости электродного процесса [88].
В литературе отсутствуют данные об изучении обратимости процесса электроокисления азитромицина на поверхности твердых электродов.
Гидродинамическими критериями обратимости электродного процесса являются величины тангенсов углов наклона прямых, описывающих зависимости /ш„=/ (Q), Етах= f (Igw) для покоящегося и вращающего электродов и разность потенциалов перегибов поляризационных кривых. Процесс считается обратимым, если:
1.Отношение тангенсов углов наклона зависимостей максимальных токов электрорастворения определяемого вещества от количества электричества с поверхности покоящегося электрода и вращающегося электродов меньше единицы (0,79).
2. Тангенс угла наклона прямой в координатах E-lgw для покоящегося электрода меньше, чем в случае вращающегося электрода. При одной и той же скорости развертки напряжения потенциал максимума поляризационной кривой растворения с поверхности вращающегося электрода не совпадает с потенциалом пика соответствующей кривой для покоящегося электрода.
Дополнительными критериями обратимого протекания электродного процесса может служить уменьшение ширины полупика при переходе от покоящегося к вращающемуся электроду при w=const. В случае же необратимых процессов ширина полупика в этих условиях будет оставаться постоянной [100].
Воспользовавшись вышеизложенными критериями, изучена обратимость процесса окисления азитромицина с поверхности стеклоуглеродного дискового электрода на фоне гидрофосфата натрия с оптимальным значением рН, при котором достигаются лучшие результаты количественного определения азитромицина методом адсорбционной дифференциальной вольтамперометрии.
Накопление азитромицина осуществляли при перемешивании раствора азотом, используя оптимальное значение Е, и т,; электрорастворение антибиотика проводили с поверхности покоящегося и вращающегося дискового электрода при линейном наложении анодного напряжения и постоянной скорости развертки потенциала.
Изучение мешающего влияния органических соединений и неорганических ионов на аналитический сигнал азитромицина
Как показывают литературные данные [61], а так же проведенные нами исследования, мешающее влияние могут оказывать катионы Са2+, Zn2+, Cu2f, Fe3+, Fe2+... в связи с тем, что происходит образование комплексных соединений когда их соотношение в растворе достигает соотношения (2:1).
Основное мешающее влияние на сигнал азитромицина при его определении в биообъектах (сыворотка и плазма крови) оказывает белковая составляющая. На 90-91% плазма крови человека состоит из воды, 6,5-8 % составляют белки, остальные 2% приходятся на низкомолекулярные органические и неорганические вещества. Номиналыгое содержание альбуминов в плазме составляет 4-6 г/100 мл; глобулинов -2-3 г/100 мл; фибриногена - 0,2 - 0,4 г/100мл. [92]. Белки плазмы крови могут вступать в реакции как с кислотами, так и с основаниями. Белки обладают способностью адсорбироваться на поверхности электрода, поэтому присутствие белков затрудняет электродные процессы, снижает чувствительность, воспроизводимость и точность анализа.
Так же определенные сложности для анализа антибиотика в крови создается связыванием азитромицина с белками плазмы, степень которой зависит от его концентрации в крови и может варьировать от 37 до 50%.
Еще одним мешающим компонентом является присутствие в крови лейкоцитов и эритроцитов, которые электрохимически активны и при достаточных концентрациях могут давать аналитический сигнал при рабочих условиях определения азитромицина дигидрата на СУ электроде в области потенциала аналитического сигнала антибиотика [93]. В связи с этим количественное определение азитромицина в сыворотке крови на СУ электроде, ограничивается наличием остаточных концентраций эритроцитов и лейкоцитов.
Для освобождения пробы от белковых примесей крови применяли необратимое осаждение белков (денатурацию) обычным образом изложенных в методиках [97, 98, 99]. Денатурацию проводили под действием достаточно высоких температур. Предварительные исследования показали, что азитромицин при данном воздействии не разрушается и не меняет своих свойств.
