Введение к работе
Актуальность. Одной'из важнейших задач современной аналитической химии является разработка чувствительных, селективных и в то же время экспрессных и достаточно простых по выполнению методов определения различных биологически активных веществ в природных объектах. Следует отметить и социальную значимость этого направления развития аналитической химии в связи с проблемами экологии. Большие перспективы в этом плане представляют вольтамиерометрические методы, обладающие целым рядом вышеперечисленных свойств. Однако при анализе природных образцов часто приходится сталкиваться с трудностями, обусловленными присутствием в исследуемом растворе нескольких электроактивных веществ. Такие помехи .особенно часто возникают в случае биологических жидкостей.v
Повышенные требования к аналитическим разработкам диктуют необходимость в экспрессных и в то яе время достаточно простых по выполнению методиках определения биологически активных соединений. И здесь определенного успеха можно достичь за счет разработки различных химических сенсоров. В этом направлении исследований весьма интересно и перспективно сочетание тех или иных вольтамперных датчиков - электродов с каталитическими реакциями. Заманчивым и перспективным оказалось использование для этих целей свойств'ферментов и содержащих их препаратов, биоматериалов, которые являются, по существу, аналитическими реагентами нового поколения. Использование иммобилизованных ферментных препаратов в гаком варианте позволяет разрабатывать так называемые биохимические сенсоры (биосенсоры). Большой интерес вызывают и сенсоры на основе угольно-ластовых электродов, позволяющие вводить катализатор (модификатор) непосредственно в состав электродного материала.
-'К началу наших исследований ферментативные реакции очень редко и весьма односторонне использовались в волыамперометрии Исключение, составляла, пожалуй, лишь реакция ферментативного окисления глюкозы в присутствии глюкозооксидази в сочетании с кислородным электродом Кларка, которая оказалась весьма перспективной для осуществления высокоселекгивных анализов, прежде всего в медицинских целях (определение глюкозы). Реакции
ферментативного катализа почти не использовались для контроля объектов окружающей среды. Имелись лишь отдельные публикации и упоминания в монографиях на эту тему. В настоящее время ферментные методы анализа и основанные на их закономерностях различные биосенсоры - новое, перспективное и успешно развивающееся направление современной аналитической химии, одна из задач которого разработка методов, способов и средств их осуществления для организации и развития экологического мониторинга природных объектов.
Использование различных, в том числе и каталитических, процессов в вольтамперометрии, основанное на применении специально подобранных катализаторов или модификаторов, с той или иной степенью жесткости закрепленных на твердофазной подложке, позволяет значительно расширить возможности этого метода исследования и анализа как в плане решения ряда проблем электрохимии, так и в плане аналитических приложений, что отвечает современный тенденциям развития науки.
Цель настоящего исследования заключается в обосновании общеме^одических подходов к разработке новых вариантов амперо-метрических сенсоров, в том числе и биосенсоров, и создании на их основе высокочувствительных, селективных и экспрессных способов определения широкого круга биологически активных соединений в сложных многокомпонентных средах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: Г. Обоснование принципов электрохимического контроля ферментных, других каталитических и иммунологических реакций. 2. Подбор, соответствующих стационарных электродов-трансдыосеров как основы химических сенсоров, в том числе и биосенсоров. 3. Изучение механизма электрохимических реакций, лежащих в основе волыамперометрического контроля процессов ферментативного катализа, и процессов каталигического выделения водорода на модифицированных угольно-пастовых электродах. 4. Разработка способов и условий получения биоспецифических мембран. 5. Оптимизация условий амперометрического детектирования реакции ферментативного катализа гидролиза серосодержащих субстратов холинэс-теразы и каталитического выделения водорода на угольно-пасто -вом электроде.
5. Обоснование методологических аспектов новых вариантов иммунологического анализа с ампероыетрическш детектированием. 7. Определение кииетичесних параметров реакции ферментативного гидролиза субстратов холинэстеразы и процессов кошілексо-эбразования в системе антиген - антитело по вольтамперным данным. 8. Разработка рекомендаций практического использова-П1я сенсоров для анализа состояния и динамики изменения объ-зктов эколого-аналитического контроля. 9« Разработка различ-шх способов модификации электродной- поверхности и электро-іктивного материала с целью придания определенных свойств химическим сенсорам.
Научная новизна работы. Предложены и обоснованы подходы і принципы вольтампероиетрического детектирования систем фер-«ент - субстрат, антиген - антитело, металл - лиганд, на ос-іовє которых разработаны новые варианты амперомегрических сенсоров с иммобилизованным катализатором, в том числе и био-зенсоров с иммобилизованной холинэстеразой, обладающих расши-5синим динамическим диапазоном концентраций, использующих электровосстановление продуктов предшествующих собственно электродному процессу реакций. Предложены новые способы иммобилизации холинэстеразы, приводящие к получению образцов с хорошими эксплуатационными характеристиками. Намечены пути іегулирования каталитической активности иммобилизованной хо-[инэстеразы. Предложены новые трансдьюсеры для биосенсоров -:тационарный ртутно-пленочный электрод с серебряной лодлоа-сой и угольно-ластовый электрод, позволяющие работать не :олько в режиме электроокисления, ко и электровосстановления іродуктов реакций. Разработан способ оценки ферментативной іктивности по данным вольтамлерных измерений. Обнаружено активирующее действие щелочных, щелочно-земельных и некоторых іругих металлов (алюминия, марганца, цинка), а такке микроко-[ичеств тяжелых металлов (свинца, кадмия, ртути, таллия) на ;аталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы.Оце-еєно ингибирукщее действие широкого круга ионов тяжелых ме-'аллов, азот-, фосфор-, серо- и хлорсодержащих органических оединений (в том числе и пестицидов) на биочувствительную асть холинэстеразного биосенсора. Показаны пути снижения
нижней границы определяемых-содержаний как за счет особенностей фермент-субстратной системы, так и условий вольтамперо-метрической регистрации полущеного сигнала. По вольтамперным данным оценены значения кинетических параметров ферментативной реакции в присутствии иммобилизованного фермента и их изменение в присутствии ингибиторов холинэстеразы. Проведено сравнительное исследование ингибирувдей способности этих соединений. Найден новый -вариант гомогенного иммуноферменгного анализа с использованием амперометричесного холинэстеразного биосенсора и ингибиторов фермента в качестве метки иммуноглобулинов. Разработаны имыуноферыентные электроды разных видов, включающие в состав биочувствительной части помимо фермента различные компоненты биоспецифического взаимодействия и позволяющие проводить иммуноферментный анализ в гетерогенном варианте. Предложен способ определения эффективных значений констант' связывания иммунного комплекса антиген - антитело по данным вольтамперометрических измерений с использованием способности микроколичеств белков в особых условиях вольтамперо-метрии вызывать каталитическое выделение водорода на стационарных электродах. Показана возможность" модификации угольно-пастовых электродов хелатами, солями металлов и органическими реагентами с целью повышения селективности определений. Найдена взаимосвязь между величиной каталитического эффекта выделения водорода и устойчивост.ыо образующихся на поверхности мрдифицированного угольно-пастового электрода комплексных соединений.
В результате проведенных исследований значительно расширены рамки-аналитических возможностей вольтамлерометрии. Намечены новые пути развития данного метода, всесторонне обосновано использование реакций ферментативного катализа и других видов каталитических процессов.
Практическая значимость. Разработаны и сконструированы новые типы амперометрических сенсоров для определения физиологически активных соединений в объектах окружающей среды, био-
логических жидкостях, продуктах питания и другой сельскохозяйственной продукции. Предложены простые и эффективные способы получения образцов иммобилизованной ХЭ, отлмчахщиеся минимальным воздействием на ее каталитическую активность. Способы технологичны, позволяют получать однородные по составу образцы с большой механической прочностью, формировать специфичные биомембраны нужной конфигурации и размера, использовать данные подходы при иммобилизации других ферментов. Предложены варианты получения биоспецифических мембран для изготовления биосенсоров и иммуноферментных электродов. Разработан простой, удобный и наглядный способ контроля изменения каталитической активности иммобилизованной ХЭ. Разработаны селективные и высокочувствительные способы и методики определения серосодержащих субстратов ХЭ, лекарственных препаратов, потенциальных загрязнителей окружающей среды (тяжелых металлов, пестицидов, серных компонентов вулканизующих систем) с помощью новых сенсоров в широком концентрационном диапазоне с величиной сн на уровне ПДК и ниже на несколько порядков. Методики отличаются простотой и экспрессностью. Показано преимущество использования данных биосенсоров при анализе биологических систем, так как в этом случае аналитический отклик наиболее адекватен реакции живого организма на воздействие извне. Разработан проточный ферментный реактор периодического действия для определения экотоксикантов в потоке.
Предложены общеметодические подходы и рекомендации к разработке амперометрических сенсоров и биосенсоров, позволяющие распространить и использовать выявленные закономерности при разработке сенсоров для анализа других объектов и конкретных зоединений. Показана возможность применения разработанных (в гом числе и модифицированных) амперометрических биосенсоров на основе ХЭ в иммуноанализе ряда веществ после предварительного зеревода их в иммуногенное состояние.
Разработаны новые варианты осуществления иммуноферментно-го анализа (ИФА) с ампероыетрическим детектированием, отличающиеся простотой и экспрессностью (время анализа 15-30 мин).
Эти варианты ИФА. использованы для обследования ряда животных и растений с целью диагностики их заболеваний. Показана перспективность данного подхода к выявлению заболеваний на разных стадиях развития, а также целесообразность приценения разработанных вариантов ИФА для энзшодиагностики патологических состояний человека. Разработан способ определения констант связывания иммунных комплексов антиген - антитело (вирус крапчатости гвоздики - Ig Б- ) по данным вольтамперометрии с использованием высокочувствительной реакции каталитического выделения водорода микроколичесгвами белка в присутствии солей кобальта. Каталитически активные комплексы кобальта и серебра нашли применение в качестве модификаторов УПЭ, предназначенных для определения серосодержащих пестицидов и серных компонентов вудканизущих систем. Высокая селективность сенсоров данного типа обусловлена кинетикой лигандного обмена с участием модификатора УПЭ. Явление каталитического выделения водорода на модифицированных электродах из угольных паст использовано такве для сникения сн ионов тяжелых металлов в природных объектах.
Практические разработки защищены 9 авторскими свидетельствами, получено 10 актов о внедрении НИР и использовании их в различных лабораториях и институтах. Теоретические и экспериментальные результаты диссертации послужили основой для цикла лекций,- читаемых на кафедре аналитической химии Казанского университета и на курсах повышения квалификации для работников аналитических лабораторий и служб экологического мониторинга предприятий и организаций региона, а также нашли отражение в учебной литературе (Г.К.Будниксв, Н.А.Улахович, Э.П.Медянцева. Основы электроаналитической химии, Казань: Изд-во КГУ, 1986).
На защиту выносятся:
основные подходы к разработке, исследованию и конструированию аыперометрических химических и биохимических сенсоров;
результаты исследования электрохимического поведения соединений, отвечающих за аналитический сигнал в системах на основе реакций с иммобилизованным катализатором;
подход к выбору трансдьюсеров как основы амперомет рических сенсоров;
- способы иммобилизации холинэстеразы для получения био-
чувствительной части ферментных электродов;
способы модификации биомембран, электродной поверхности и состава электродно-активного материала с целью получения сенсоров с заданными свойствами;
вольтаыперометрический способ контроля изменения каталитической активности иммобилизованной холинэстеразы;
обоснование подходов к разработке новых вариантов иину-ноанализа с амперометрическим детектированием; вольтамперомет-рический способ определения констант связывания иммунных комплексов антиген - антитело;
комплекс унифицированных вольтампероиетрическнх методик определения пестицидов, ускорителей вулканизации, лекарственных препаратов, тяжелых металлов и систем для диагностики некоторых заболеваний живых организмов и растений;
рекомендации для практического использования сенсоров при анализе состояния и динамики изменения объектов окрупащей среды, биологических нидкостей, медицинских препаратов и материалов химической промышленности.
Работа выполнялась в соответствии с координационным планом АН по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 2,20.4.7) по теме № 01.86.0106158, согласно приказам Государственного комитета СССР по народному образованию Ifc 59 от 31.01.89 и Миннауки РФ ft ГЗЗ-ф от 04.02.92 г. и И» 13-ф от 08.02.93 г. по приоритетному направлению развития химической науки и технологии 29 "Анализ".
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на УШ (Днепропетровск, 1984 г.) и IX (Усть-Каменогорск, 1987 г.) Всесоюзных совещаниях по полярографии, Республиканской конференции по охране окружающей среды (Казань, 1984 [\)i П (Томск, 1985 г.) и Ш (Томск, 1989 г.) Всесоюзных конференциях по электрохимическим методам анализа, XI Всесоюзном зовещании по электрохимии органических соединений (Льнов,1986 с), Всесоюзной конференции по методам анализа объектов окру-іающей среды (Москва, 1985 г.). Всесоюзном симпозиуме "Охрана жружающей среды в химической, нефтехимической промыиленностях t промышленности по производству минеральных удобрений"(Самар-
канд, 1983 г.), УІ Всесоюзной конференции "Органические реагенты в аналитической химии" (Саратов, 1989 г.), IX Конференции "Аналитика - 89" (Алма-Ата, 1989 г.), Ш Всесоюзной конференции "Проблемы, разработки средств нонтроля окружающей среды" (Казань, 1989 г.), конференции "Химические сенсоры - 89й (Ленинград, 1989 г.)» Е Всесоюзной конференции по методам концентрирования в аналитической химии (Черноголовка, 1990 г.), конференции "Анализ-ЭО" (Ижевск, 1990 г.)* УІ конференции Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Калининградской области (Рига, 1990 г.), Всесоюзной конференции по истории и методологии аналитической химии (Москва, 1990 г.)» Всесоюзной конференции "Экология химических производств" (Северодонецк, 1990 г.)» ІУ Всесоюзной школе-семинаре по электрохимическим методам анализа (Краснодар, 1990 г.), семинаре секции "Методы контроля химического состава материалов" Центрального Российского Дома знаний (Москва, 1990 г., 1992 г.), выездной сессии Комиссии по электрохимическим методам анализа Научного совета по аналитической химии АН СССР (Казань, 1990 г.), Международном конгрессе по полярографии памяти Я.Гейровского (Прага, 1990 г.), Международном симпозиуме по электроанализу объектов биомедицины, окружающей среды и промышленности (Великобритания, Лохборо, 1990 г., 1993 г.), УІ Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991 г.), Всесоюзной научно-практической конференции "Современные методы контроля окружающей среды и пищевых продуктов" (Краснодар, 1991 г.)« ЇХ Всесоюзной конференции по экстракции (Адлер, 1991 г.), конференции "Аналитическая химия объектов окружающей среды" (Сочи, І99Ї г.)» Международной конференции по экстракции органических соединений (Воронеж, .1992 г.)» ІУ Европейской конференции по электроанализу (Нидерланды, Г992 г.). УІ семинаре "Проблемы экологии в преподавании химических дисциплин" (Ростов-на-Дону, 1992 г.)» Всесоюзной конференции "Химические и биологические методы в охране окружающей среды" (Усть-Каменогорск, 1990 г.). Московском семинаре по аналитической химии при ГЕОХИ РАН (1991 г,), I Всероссийской школе по биохимическим и биологическим методам анализа (Москва, 1992 г.)» ХУ Менделеевском съезде (Минск, 1993 г.), ХУ Чернневском совещании по химии, анализу и технологии платиновых металлов (Москва, 1993 г.), Ш
:онференцин "Проблемы преподавания аналитической химии" (Ека-еринбург, 1993 г.), Неадународной конференции "Евроанализ УШ" Единбург, 1993 г.), Московском сеиинаре по аналитической химии, освященной 70-легип развития метода полярографии (Москва,1992 '.), ІУ конференции "Электрохимические методы анализа" (Моск-а, 1994 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 80 работ, из их 5 обзоров.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 13 страницах маиинописного текста и содержит 40 рисунков, 63 аблицы, 330 литературных ссылок. Диссертация состоит из вве-ения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы и риложений, в" которых представлены документы об использовании азработок и вспомогательный расчетный материал.
