Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Методы регистрации активности ГГНС животных 9
1.2. Изучение характера взаимосвязи между внешними факторами и внутренним состоянием организма 13
1.3. Особенности социальных контактов между животными как стресс-фактора 15
1.4. Особенности пространственной и социальной организации представителей семейства кошачьих 18
1.5. Особенности физиологии представителей семейства кошачьих 26
1.6. Характеристика биологии объекта исследований 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Условия содержания животных 34
2.2. Валидация методов неинвазивного мониторинга гормонального статуса у дальневосточного лесного кота 35
2.3. Характеристика активности репродуктивной системы у самцов и самок дальневосточного лесного кота 37
2.4. Эксперименты по изучению поведения животных 42
Глава 3. Результаты исследований 50
3.1. Валидирование методов неинвазивного мониторинга гормонального статуса у дальневосточного лесного кота
3.1.1. Физиологический метод валидации неинвазивного измерения ИРВ-кортизол, в экскрементах животных (АКТГ-тест) 50
3.1.2.Тест на параллелизм 54
3.1.3. Биологический метод валидации неинвазивного измерения ИРВ-кортизол в экскрементах животных (моделирование «стрессорных»ситуаций) 54
3.2. Характеристика активности репродуктивной системы у самцов и самок дальневосточного лесного кота
3.2.1. Анализ активности репродуктивной системы самцов: концентрация половых гормонов 57
3.2.2. Анализ активности репродуктивной системы самцов: качество спермы 59
3.2.3. Анализ активности репродуктивной системы самок 64
3.3. Взаимосвязь социального поведения и гормонального статуса животных у дальневосточного лесного кота 70
3.3.1. Социальные взаимодействия и активность ГГНСу самцов дальневосточного кота 74
3.3.2. Социальные взаимодействия и активность ГГНСу самок дальневосточного кота 86
Глава 4. Обсуждение 106
4.1. Валидирование методов неинвазивного мониторинга гормонального статуса у дальневосточного лесного кота 106
4.2. Характеристика активности репродуктивной системы у самцов и самок дальневосточного лесного кота 112
4.3. Взаимосвязь социального поведения и гормонального статуса животных у дальневосточного лесного кота 120
Выводы 139
Список литературы 141
- Изучение характера взаимосвязи между внешними факторами и внутренним состоянием организма
- Валидация методов неинвазивного мониторинга гормонального статуса у дальневосточного лесного кота
- Характеристика активности репродуктивной системы у самцов и самок дальневосточного лесного кота
- Характеристика активности репродуктивной системы у самцов и самок дальневосточного лесного кота
Введение к работе
Комплексный анализ репродуктивной физиологии, активности системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники (ТТНС) и социальных взаимодействий, является основным подходом в изучение адаптивных стратегий животных и выявления физиологических и поведенческих путей их реализации. (Blanchard et al., 1998; Creel, 2001; Keverne et al., 2003; Мошкин и др., 2003).
Определение уровня стрессированности животных играет важную роль в исследовании поведения животных, как для успешного содержания и разведения их в неволе, так и для оценки процессов, происходящих в природных популяциях. В связи с трудностью проведения прямых измерений одним из подходов в решении этой задачи является использование поведенческих индикаторов стресса (Carlstead, Seidensticker, 1991), не всегда подтвержденных для конкретного вида. С развитием неинвазивных методов измерения глюкокортикоидов и увеличением интереса к исследованиям биологии диких животных, большое значение приобретает разработка и валидация неинвазивных методов измерения стресса (адренокортикоидной активности) у позвоночных (Miller et al., 1991; Герлинская и др., 1993). Многими авторами отмечена необходимость валидации этих методов для каждого вида в отдельности, что связано с видовыми особенностями метаболизма гормонов (видоспецифическим составом стероидных метаболитов, возможным искажением результатов вследствии кросс-реакций и различными концентрациями иммунореактивных продуктов в фекалиях у разных видов) (Mostl, Palme, 2002; Завьялов и др., 2003; Palme, 2005). У животных, ведущих социальный образ жизни, все большее внимание отводят роли активности ГГНС в формировании структуры социальных взаимоотношений (Creel et al., 1992, 1997; DeVries et al., 1996; Martinez et al.,1998; Goymann et al., 2001; Stavisky et al., 2001). Однако, в ходе этих
5 исследований многими авторами отмечена вариабельность в реакции ГГНС животных на социальные взаимодействия с партнером (Creel et al., 1992, 1997; Goymann et al., 2001; Stavisky et al., 2001; Abbott et al., 2003). Во многом получение таких результатов связывают с зависимостью активности ГГНС от влияния дополнительных, так называемых, модифицирующих факторов (индивидуальная разнокачественность особей, пол особи, пол партнера, статус особи, стадия репродуктивного цикла, особенности социальной структуры вида) (Wingfield et al., 1998), а также от влияния характеристик самого стресс-фактора (наличия агонистического поведения во взаимодействиях животных, его длительности, интенсивности и.т.д.) (Barret et al., 2002). Для животных, ведущих одиночный образ жизни, связь активности ГГНС с особенностями социального поведения была описана всего для нескольких видов, среди которых практически отсутствуют представители хищных млекопитающих (Мошкин и др., 2001; Bronson et al., 1964; Popova, Naumenko, 1972; Mendl et al., 1992). Однако, даже у малосоциальных видов взаимодействия между животными крайне важны, и в отдельных случаях могут приводить у них к полному подавлению размножения (Wielebnowski et al., 2002). Выявление подобных закономерностей играет важную роль в изучении и сохранении редких и исчезающих видов, которые широко представлены в семействе кошачьих (Brown, 2006). Дальневосточный лесной кот - редкий и практически неизученный представитель семейства кошачьих. Согласно крайне отрывочным данным для этого вида типична пространственная и социальная структура одиночного хищника (Юдина, Юдин, 1993). Контакты между особями редки и не всегда предсказуемы, в отдельных случаях сопровождаются жесткими агрессивными взаимодействиями, что может быть связанно с активностью ГГНС животных.
Целью нашей работы было исследовать взаимосвязь между социальным поведением и гормональным статусом животных у дальневосточного лесного кота
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
Валидировать методы неинвазивного мониторинга гормонального статуса у дальневосточного кота
Выявить динамику репродуктивной активности животных
3. Описать сезонную динамику характера социальных взаимодействий животных
4. Оценить связь между характером социальных контактов и активностью ГГНС животных
Изучение характера взаимосвязи между внешними факторами и внутренним состоянием организма
В настоящий момент решение данной задачи сопряжено с целым рядом трудностей, и исследователям редко удается получить четкие и предсказуемые результаты. Основная причина этого заключается в том, что влияние стресс-факторов на организм неоднозначно и зависит от многих причин.
Животные обитают в среде, где постоянно происходят изменения. Однако, колебания факторов окружающей среды не являются абсолютно непредсказуемыми и хаотичными. К большинству из них организм подготовлен с помощью разнообразных адаптации. Эти приспособления отражаются в морфологических признаках, типе пространственной и социальной структур, лабильном функционировании различных систем организма. В результате, изменения в жизненном цикле животного сопряжены с колебаниями в его среде обитания. В связи с этим, стресс-факторы воздействуют на организм животного в совокупности с другими факторами окружающей среды (Jacobs and Wingfield, 2000). Поэтому базальная активность, также как и реактивность ГГНС, меняются, и стресс-ответ может варьировать (усиливаться или ослабляться) в зависимости, например, от времени года (Romero, 2002).
Влияние сезона или погодных факторов, таких как температура, влажность, доступность пищи и воды, ассоциированы с изменением в уровне метаболитов глюкокортикоидов в экскрементах у ряда видов птиц и млекопитающих (Frigerio et al.,2004; Harper, Austad.,2001; Creel et al., 2002). И хотя механизмы сезонных колебаний в активности ГГНС и их функция изучены слабо, было показано, что они тесно сопряжены с биологической значимостью и влиянием стадии жизни животного. Так, сезон размножения, период перед залеганием в спячку, период миграции и лактации характеризуются высоким уровнем метаболитов глюкокортикоидов у различных видов млекопитающих (Kenagy, 1987; Bronson, 1989; Kenagy and Place, 2000; Новиков, 2005).
Наряду с сезонными изменениями в уровне глюкокортикоидов в плазме крови и метаболитов глюкортикоидов в экскрементах животных отмечены суточные и ежесуточные колебания гормонов (Сое and Levine, 1995; Atkinson and Waddell, 1997; Колосова и др., 2007).
Также существуют половые различия в активности ГГНС. Самцы и самки отличаются по физиологическим и поведенческим аспектам, что может отражаться на динамике глюкокортикоидов и силе стресс-ответа. В нескольких исследованиях авторы отмечают более высокие базальные концентрации метаболитов глюкокортикоидов у самок (африканские собаки (Creel, 1997); домашние кошки (Shatz and Palme, 2001); гепарды (Wielebnowski et al., 2002)), другие у самцов (лабораторная крыса (Cavigelli et al., 2005)), третьи отсутствие таких различий (волки (Sands and Creel., 2004); носороги (Brown et al., 2001)).
Наряду с перечисленными изменениями в активности ГГНС существуют и индивидуальные различия между особями по целому ряду параметров: базальные уровни глюкокортикоидов в плазме крови, и метаболитов глюкокортикоидов в экскрементах и/или моче животных; реактивность ГГНС; «стрессоустойчивость» отдельных особей к действию различных внешних факторов; различия в восприятии той или иной ситуации индивидуумом (Wildt et al., 1988; Мошкин и др., 2001; Mostl et al., 2002; Touma et al., 2005).
Помимо того, что характер влияния стресс-факторов на организм зависит от внешних условий, собственные параметры и особенности стресс-факторов (интенсивность, длительность, природа (физическая или психическая) и др.) также имеют решающее значение в активации ГГНС в ответ на их воздействие (Barret et al., 2002) Все это в значительной степени способствует многообразной картине ответа животных на внешние стимулы, в том числе и на взаимодействия с особями своего вида.
Валидация методов неинвазивного мониторинга гормонального статуса у дальневосточного лесного кота
Для физиологического подтверждения адекватности метода неинвазивного мониторинга глюкокортикоидов в экскрементах животных оценивали изменения концентрации иммунореактивных веществ, связывающихся с антителами к кортизолу (далее ИРВ-кортизол), в экскрементах в ответ на инъекцию АКТГ, вызывающего выброс глюкокортикоидов в кровь и повышение уровня их метаболитов в экскретах. Семь половозрелых особей (три самки и четыре самца) дальневосточного кота содержали поодиночке как описано выше. Эксперимент с инъекцией синтетического аналога АКТГ («Synacten», 1 мг/мл, Novartis Pharma GmbH, Nurnberg) проводили дважды: зимой (январь-февраль) и летом (июль) 2006 года. АКТГ вводили внутримышечно в утренние часы (8.30-12.00; 0,25 мл/10 кг массы тела, что соответствовало 25 ИЕ). В зимний период собирали все экскременты животных, выделившиеся в течение суток до инъекции гормона (день «0» - контроль) и 6 суток после нее. При последующей обработке данных эти 6 суток были разбиты на 3 периода по двое суток в каждом. Это было связано с низкой частотой дефекаций животных в этот период (2-3 раза в течение 6 суток после инъекции). В летний период у всех животных перед инъекцией АКТГ и через час после нее были собраны образцы крови для последующего определения в них уровня кортизола. Экскременты собирали в течение трех суток до и после инъекции. Сбор образцов летом проводили с минимальными временными промежутками (до 6 часов), чтобы минимизировать время нахождения образцов на открытом воздухе. Собранные экскременты замораживали при температуре -18С и хранили до проведения экстракции гормонов.
Кроме концентраций ИРВ-кортизол, определяли также глюкокортикоидный индекс (ГКИ), равный отношению концентрации гормона (кортизола в плазме крови или иммунореактивных веществ в экскрементах) в условиях стресса к базальному уровню (Moshkin et al., 2002).
Для биологического подтверждения адекватности метода неинвазивного мониторинга глюкокортикоидов в экскрементах животных, оценивали изменения концентрации ИРВ-кортизол в экскрементах, в ответ на проведение «заведомо стрессорных» процедур. В эксперименте использовали 5 половозрелых особей дальневосточного кота: 4-х самцов и 1 самку.
В качестве «стрессорных» ситуаций рассматривали процедуру взятия крови у самки, включающей поимку животного, а также процедуру электроэякуляции у самцов, включающей поимку животного, с последующим обездвиживанием зверя по стандартной методике (Goeritz et al., 2006). Эти процедуры приводят к активации надпочечников у ряда видов животных (Whitten et al., 1998; Young et al., 2004), в том числе и у некоторых представителей семейства кошачьих (Brown et al., 1989; Wildt et al., 1988). При этом максимальной активации ГГНС как в случае с введением АКТГ не происходит,. В связи с этим результаты данного теста были необходимы для получения дополнительных данных, показывающих, что метод измерения позволяет определять биологически значимые изменения в циркуляции глюкокортикоидов, т.е. значения концентраций глюкокортикоидов выбрасывающиеся в кровь при неполной активации ГГНС.
Процедуры взятия крови и электроэякуляции были проведены в рамках эксперимента по изучению динамики репродуктивной активности животных в весенний период (апрель-май), в утренние часы согласно методике описанной ниже (см. раздел 1.3). Мы собирали все образцы экскрементов через каждые 3-4 часа в течение 3-х суток до проведения «стрессорных» процедур и в течение 4-х суток после них. Собранные экскременты замораживали при температуре -18С и хранили до проведения экстракции гормонов
На целом ряде видов млекопитающих (Martinet et al., 1984), в том числе и на представителях семейства кошачьих (Schmidt et al., 1979; Schmidt et al., 1988), было показано, что концентрация половых гормонов (тестостерона, прогестерона и эстрадиола) в плазме крови служит надежным индикатором репродуктивной активности животных. Для мониторинга репродуктивной активности у дальневосточного лесного кота в течение года у 10 половозрелых самцов проводили сбор образцов крови в период с 2006-2009 год. Забор крови у каждого зверя проводили один раз в месяц из бедренной вены (около 1,5 мл), в сочетании с процедурой электроэякуляции. Для того чтобы свести к минимуму возможные различия в измерениях, вызванные суточной динамикой стероидных гормонов, забор крови осуществляли в утренние часы (9.00-12.00).
Сразу после сбора образцов плазму крови отделяли центрифугированием при 6000 об/мин на протяжении 20 минут и отбирали микропипеткой в чистую пробирку Эппендорфа. Плазму замораживали при температуре — 18С и хранили при этой температуре до проведения измерений. Перед началом измерения образцы размораживали. Всего было собрано и проанализировано 121 образец крови.
Характеристика активности репродуктивной системы у самцов и самок дальневосточного лесного кота
Анализ активности репродуктивной системы у дальневосточного лесного кота на протяжении года мы проводили при помощи измерения концентрации половых гормонов в плазме крови и их метаболитов в экскрементах животных в течение года.
Анализ 120 образцов крови, собранных от 10 половозрелых самцов дальневосточного кота, показал достоверные различия в уровне тестостерона в плазме крови в разные периоды года (Friedman ANOVA: n=10; df = 3; Т=13,9; р 0,01). Максимальные значения гормона были отмечены с февраля по апрель (7,7-14,6 нг/мл) (Рис.7), затем концентрация тестостерона плавно снижалась до 2,8+1,2 нг/мл в мае. Незначительный пик тестостерона мы отмечали также в августе (7,4+3,4 нг/мл), а затем концентрация падала до минимальных значений в декабре (1,8+0,7 нг/мл). Поскольку максимальные значения концентрации тестостерона мы фиксировали с февраля по апрель, то именно этот период мы обозначали в дальнейшем, как период размножения или весенний период.
Оценка гормональной активности половой системы самцов на основе анализа концентрации ИРВ, связывающихся с антителами к тестостерону в экскрементах животных (далее ИРВ-тестостерон), показала сходную динамику ИРВ-тестостерон половых гормонов с сезонными изменениями тестостерона в плазме крови.
Кроме этого, уровень ИРВ-тестостерон в экскрементах, также как и уровень тестостерона в плазме крови, возрастал в августе месяце (2609нг/г), однако достоверных различий в данном случае мы не обнаружили (Friedman ANOVA: n=5; df =3; Т=5; ns).
Таким образом, динамика концентрации тестостерона в плазме крови в течение года прослеживался и в сезонной динамике ИРВ-тестостерон в экскрементах животных, что свидетельствовало о возможности оценки активности репродуктивной системы у самцов дальневосточного лесного кота неинвазивными методами. Кроме этого, на основе анализа этой динамики мы можем говорить о том, что пик репродуктивной активности у самцов дальневосточного кота приходится на весенний период (с февраля по апрель)- период гона, а период покоя репродуктивной системы - на осенний (с сентября по ноябрь). Мы также можем говорить о наличии второго менее выраженного пика репродуктивной активности животных в августе.
Выраженная сезонность в динамике половых гормонов у самцов дальневосточного кота, уровень которых связан с эндокринной активностью семенников, позволила нам предположить наличие сезонности в проявлении их экзокринной функции: процессе сперматогенеза и как результат - в качестве спермы. Для того, чтобы проверить это предположение, мы проанализировали количественные показатели качества спермы самцов дальневосточного лесного кота по образцам, собранным в течение года.
Анализ 101 эякулята от 10 самцов позволил описать следующие характеристики качества спермы дальневосточного лесного кота
Характеристика активности репродуктивной системы у самцов и самок дальневосточного лесного кота
На данный момент для ряда видов кошачьих описаны сезонные изменения в уровне половых гормонов и их метаболитов в экскрементах, как для самцов, так и для самок, сопряженные с изменениями в поведении животных. Так, большинство представителей семейства кошачьих, на основе данных по динамике половых гормонов, относят к видам, не имеющих сезонности в размножении (лев (Schmidt et al.,1979), леопард (Schmidt et al.,1988), пума (Bonney et al.,1981), длиннохвостая кошка (Leopardus wiedi) и оцелот (Leopardus tigrinns) (Moreira et al.,2001).
В нашем исследовании отмечены сезонные изменения в уровне половых гормонов в крови и иммунореактивных веществ в экскрементах животных, как у самцов, так и у самок дальневосточного лесного кота. Максимальные значения в уровне тестостерона в плазме крови и ИРВ-тестостерон в экскрементах самцов выявлены в период с февраля по апрель. Для самок увеличение уровня ИРВ-прогестерон и ИРВ-эстрадиол нами было отмечено в марте. Сходные результаты были получены на евразийской рыси, на основе данных об изменении уровня ИРВ-тестостерон в экскрементах животных (Jewgenov et al., 2006). Согласно крайне малочисленным литературным данным, основанных только на наблюдениях за поведением животных, гон у дальневосточного кота проходит с начала марта до середины апреля (Юдина, Юдин, 1991). По нашим данным репродуктивная активность самцов возрастала уже в феврале, у самок же чуть позже - в марте. После спаривания динамика ИРВ в экскрементах самок в значительной степени зависела от того насколько успешно прошел для них гон, о чем мы могли судить впоследствии по наличию детенышей у самки. Выявлены значительные различия в динамике ИРВ-прогестерон и ИРВ-эстрадиол в экскрементах самок между рожавшими и не рожавшими кошками.
Различия в динамике ИРВ-прогестерон между рожавшими и не рожавшими самками отмечались нами только в период после родов: у рожавших самок концентрация ИРВ-прогестерон оставалась высокой, по сравнению с концентрацией до первого спаривания, в течение еще 2-3 месяцев после родов (в период лактации). Это было сходно с евразийской рысью у самок которых высокая овариальная активность сохранялась примерно в течение трех месяцев после родов (Goritz et al., 2009). Такая тенденция не была отмечена нами у нерожавших кошек, у которых концентрация ИРВ-прогестерон падала до базальных значений после периода гона (в мае) и больше не возрастала. Таким образом, мы можем предположить, что у всех самок дальневосточного лесного кота происходила овуляция после родов, что приводило к резкому увеличению уровня прогестерона в плазме крови и ИРВ-прогестерон в экскрементах (Brown et al., 1994; Morreira et al., 2002; Brown, 2006)
Различия в динамике ИРВ-эстрадиол между рожавшими и не рожавшими самками заключались в том, что, во-первых, концентрация ИРВ-эстрадиол падала примерно через месяц после спаривания (апрель) у нерожавших кошек и возрастала у рожавших вплоть до момента родов, достигая максимальных значений. На следующий месяц после родов концентрация ИРВ-эстрадиол резко падала до базальных концентраций в экскрементах родивших самок и больше не возрастала. У нерожавших самок отмечали 2-ой пик в уровне ИРВ-эстрадиол в летний период (в мае-июне). Пик уровня эстрадиола у самок отмечают в период эструса (Morreira et al., 2002; Brown, 2006). Увеличение же уровня эстрадиола в период беременности прослеживается лишь у отдельных видов (Jewgenow et al., 2007).
Таким образом, динамика ИРВ-прогестерон и ИРВ-эстрадиол различалась между рожавшими и нерожавшими самками дальневосточного лесного кота, что может быть использовано для диагностики беременности у этого вида кошачьих.
Тот факт, что динамика половых гормонов различна у беременных и небеременных животных отмечен на многих видах млекопитающих (Briges, 1978), в том числе и на ряде представителей кошачьих (Wildt et al.,1981; Tsutsui et al., 1993; Moreira et al., 2002;). Подобные результаты были получены и на основе анализа концентрации гормонов в плазме крови и при исследовании динамики их метаболитов в экскрементах животных (Brown et al., 1994, 1995, 2002). Некоторые исследователи отмечали у кошек в неволе возможность повторного спаривания животных, в том случае если гон для самок прошел неудачно, или в случае если самка по тем или иным причинам потеряла выводок (Андреевская, 1964; Стоянова, Сваринская, 1964; Stehlik, 1983). В этом случае самки могли вторично приходить в эструс, что было сопряжено с повышенной секрецией эстрадиола. В нашем случае второй пик репродуктивной активности у самок дальневосточного лесного кота выражался в повышении только уровня ИРВ-эстрадиол, но не ИРВ-прогестерон. Это может быть связанно с тем, что увеличение концентрации ИРВ-прогестерон происходит (как было показано нами см. Глава 2 (пункт 3.2.3)) только после спаривания (а ИРВ-эстрадиол еще до спаривания). А поскольку для большинства представителей семейства кошачьих, характерен индуцированный тип овуляции (Graham et al., 2000; Shille et al., 1979), то скорее всего, увеличение ИРВ-прогестерон отмечали у самок дальневосточного лесного кота только после того как наступает собственно овуляция, что отмечено для домашней кошки (Swanson et al., 1995). Отсутствие подъема уровня прогестерона в экскрементах животных после летних пиков ИРВ-эстрадиол позволяет предположить, что спонтанная овуляция у самок дальневосточного лесного кота - крайне редкое явление.
