Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 9
1.1. Применение методов криобиологии для сохранения биоразнообразия 9
1.2. Общие принципы криоконсервации генетического материала рыб 12
1.3. Криоконсервация спермы лососевых рыб 25
1.4. Крио консервация спермы карповых рыб 35
1.5. Криоконсервация спермы осетровых рыб 38
1.6. Криоконсервация спермы перспективных объектов аквакультуры 44
ГЛАВА II. Материал и методика исследований 46
ГЛАВА III. Оптимизация состава криопротектора для спермы осетровых рыб
3.1. Использование криопротекторов для краткосрочного хранения спермы 58
3.2. Подбор криопротекторов для глубокого замораживания половых клеток в жидком азоте 63
ГЛАВА IV. Усовершенствование процесса криоконсервации репродуктивных клеток осетровых рыб
4.1. Исследование метода электростимуляции половых клеток осетровых рыб 74
4.2. Выведение протектора из клеток после криоконсервации спермы осетровых рыб 82
4.3. Определение оптимальных параметров усовершенствованной схемы криоконсервации половых клеток осетровых рыб 85
ГЛАВА V. Результаты осеменения яйцеклеток осетровых рыб дефростированной спермой
5.1. Оплодотворение икры дефростированной спермой в лабораторных условиях
5.2. Оплодотворение икры дефростированной спермой в условиях рыбоводного завода 89
5.3. Поведенческие реакции молоди русского осетра, полученной с помощью нативнои и криоконсервированнои спермы 95
Заключение 98
Выводы 100
Практические рекомендации 102
Список литературы 103
Приложения 122
- Общие принципы криоконсервации генетического материала рыб
- Подбор криопротекторов для глубокого замораживания половых клеток в жидком азоте
- Определение оптимальных параметров усовершенствованной схемы криоконсервации половых клеток осетровых рыб
- Поведенческие реакции молоди русского осетра, полученной с помощью нативнои и криоконсервированнои спермы
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы в экосистемах водоемов наблюдаются существенные изменения, в результате которых произошло снижение численности осетровых рыб. В связи с этим основным источником формирования и поддержания запасов осетровых стало их искусственное воспроизводство. Однако в настоящее время отмечается снижение масштабов заводского воспроизводства. Одной из причин этого является отсутствие возможности заготовки производителей с высокими рыбоводно-продуктивными показателями.
Возникла необходимость разработки разнообразных подходов использования и сохранения популяционного генофонда производителей естественной генерации для целей искусственного воспроизводства.
Криоконсервация остается одним из наиболее привлекательных и быстроразвивающихся направлений сохранения редких исчезающих видов. Наличие в криобанке генетически репрезентативных коллекций геномов рыб и маточных стад на осетровых рыбоводных заводах позволяет с максимальным эффектом сохранить генетическое разнообразие этих ценных промысловых объектов.
В настоящее время разработаны методики криоконсервации половых продуктов рыб, в частности осетровых (Копейка, 1986; Цветкова и др., 1997; Linhart et., 2009). Однако результаты часто невоспроизводимы и не всегда обеспечивают высокий процент выживаемости дефростированных сперматозоидов. Это связано с тем, что на процесс криоконсервации оказывает влияние большое количество факторов: физиологическое состояние производителей, качество половых продуктов, индивидуальные особенности рыб разных популяций, физические факторы и т.д. Кроме того, отрицательное воздействие на клетки оказывает охлаждение, поэтому очень важно подобрать криозащитные среды и криопротекторы. В сложившейся ситуации проблема сохранения генофонда осетровых рыб путем глубокого замораживания является актуальной.
Цель и задачи исследований. Целью работы явилась разработка новых методов криоконсервации половых клеток осетровых рыб для сохранения их генофонда.
Поставленная цель определила следующие задачи:
- исследовать компоненты криосред и подобрать оптимальные протекторы для криоконсервации спермы осетровых видов рыб (русский осетр, севрюга);
- изучить действие электростимуляции на половые клетки осетровых рыб для увеличения проницаемости мембран;
- разработать метод выведения криопротектора из дефростированных половых клеток осетровых рыб;
- усовершенствовать стандартную технологию криоконсервации при введении новых биотехнологических методов;
- установить возможность использования криоконсервированного генетического материала для оплодотворения икры в целях искусственного воспроизводства в лабораторных условиях и на рыбоводных предприятиях.
Научная новизна. Подобран оптимальный состав криосреды, способствующий увеличению выживаемости дефростированных клеток осетровых рыб. Научно обосновано использование метода электростимуляции в процессе криоконсервации для усиления проникновения протекторов внутрь половых клеток осетровых рыб, определен механизм усиления протекторного действия при воздействии низкочастотным током, установлены оптимальные параметры электрического сигнала. Обосновано использование метода выведения криопротектора из дефростированных половых клеток рыб. Использование новых методов криоконсервации позволило усовершенствовать стандартную биотехнологию сохранения клеточного материала редких и исчезающих видов осетровых рыб. Дефростированный клеточный материал, сохраненный по новой технологии, впервые использован для оплодотворения крупной партии икры русского осетра и получения жизнеспособного потомства.
Практическая значимость. Результаты настоящей работы могут быть использованы для создания криобанков редких и исчезающих видов рыб с целью сохранения их генофонда, для увеличения эффективности процесса криоконсервации репродуктивных клеток осетровых рыб, для повышения выживаемости сперматозоидов после оттаивания. Усовершенствованная технология низкотемпературного консервирования половых клеток может применяться на предприятиях, занимающихся воспроизводством и товарным выращиванием осетровых видов рыб.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Новый криораствор для половых клеток осетровых рыб с оптимальным подбором протекторов.
2. Метод электростимуляции для усиления проникновения криопротекторов через клеточные мембраны.
3. Метод выведения протектора из дефростированных клеток.
4. Усовершенствованная биотехнология криоконсервации половых клеток осетровых рыб.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались на ежегодных студенческих научных конференциях Астраханского государственного технического университета (АГТУ) в 2005-2006 гг., на ежегодных научных конференциях студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2006-2009 гг.), на международной конференции «Состояние и перспективы развития фермерского рыбоводства аридной зоны» (Азов, 2006 г.), на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дубровицы, 2007 г.), на 11-й и 12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино 2007-2008 гг.), на международной научно-практической конференции «Инновационные технологии аквакультуры» (Ростов-на-Дону, 2009 г.), на VI международном симпозиуме по осетровым: Гармония и взаимоотношения между деятельностью человека и природой: на примере осетровых (Китай, г.Ухань, 2009 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 работ, 2 из них из перечня ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, пяти глав, содержащих описание результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов и рекомендаций производству, приложения. Общий объем 126 страниц с 30 рисунками, 11 таблицами, 2 приложениями. Список литературы включает 178 источников, из них 94 иностранных.
Общие принципы криоконсервации генетического материала рыб
Антропогенное влияние на гидрологические условия и трофику рыб (гидростроительство, загрязнение водной среды, сокращение нерестилищ и естественного воспроизводства рыб), а также превышение вылова и браконьерский лов привело не только к снижению численности ценных форм, но и к исчезновению отдельных видов (Андрияшева, Черняева, 2000; Баранникова и др., 2000; Литвиненко, Палубис, 2000; Руднева и др., 2000; Кловач, 2002; Савушкина, 2008). Одним из направлений в области сохранения популяций исчезающих видов рыб является криоконсервирование их половых продуктов.
Впервые успешные результаты криоконсервации спермы рыб были получены на молоках сельди (Blaxter, 1953; 1955).
К настоящему времени разработана и осуществлена концепция «Криобанк рыб» (Катасонов и др., 1995), где приведены основные направления сбора и хранения половых клеток рыб в низкотемпературных генетических банках. Учитывая современные экологические условия, коллектив криобиологов создал Национальную программу, направленную на «Сохранение и устойчивое использование генетических ресурсов промысловых, редких и исчезающих видов, популяций рыб и водных беспозвоночных с применением криотехнологий» на период 2003-2010 гг. (Ананьев и др., 2002; Савушкина, 2008).
Разработке методов глубокого замораживания способствовали исследования по изучению механизма природной адаптации рыб и беспозвоночных к переохлаждению.
Среди рыб наблюдаются виды, чаще это пресноводные формы, которые замерзают без переохлаждения (Borodin, 1934; Шмидт, Платонов, 1938); другие способны к переохлаждению, что, по мнению Н.И. Калабухова и Г.В. Никольского (1934), объясняется их меньшей величиной тела. Значительно сильнее переохлаждаются яйца и особенно мальки рыб.
Исследование холодоустойчивости рыб арктического бассейна указало на неизвестные ранее пути адаптации к низким температурам: способность организмов сохранять активность в переохлажденном состоянии при неизменной в течение года точке замерзания внутренней среды благодаря гомоосмотическому типу осморегуляции; способность приспособляться к зимнему понижению температуры воды путем изменения своего осмотического давления, понижающего величину точки замерзания, благодаря чему избегается неустойчивое состояние переохлаждения (Лозина-Лозинский, 1972).
В ходе эволюции у животных, не способных поддерживать постоянную температуру тела, возникали механизмы, позволяющие пережить холодный период, и в частности, избежать, а если это не удается, то выдержать возможное замерзание внутриклеточных и внеклеточных растворов организма. Избежать образования льда можно либо снижением точки замерзания раствора путем накопления электролитов и низкомолекулярных веществ типа глицерина или Сахаров, либо активным подавлением нуклеации и блокированием роста кристаллов льда, что требует специфических веществ, обладающих высоким сродством к формирующейся кристаллической фазе воды, таких как антифризные белки некоторых рыб и насекомых (Андреев, Петропавлов, 1994).
Накопление живыми организмами тех или иных веществ в качестве антифризов зависит от многих факторов. Животные, которые переживают холодный период в активном состоянии, используют преимущественно довольно сложные, но высокоэффективные способы активного подавления кристаллизации, например, накопление антифризных белков в сочетании с повышением уровня электролитов и неэлектролитов. В основном накопление антифризных белков показано для полярных рыб (Lang et al., 1988; Duman, de Vries, 1976; Raymond et al., 1989; Franks, 1985).
В последствии ученые использовали природные адаптивные свойства полярных рыб для криоконсервирования половых клеток радужной форели, . стальноголового лосося и среднерусского карпа (Цветкова, Каранова, 1994). Так, ими установлено, что препарат АФГП 1-5, полученный из сыворотки крови трески, оказывает положительное криопротекторное действие — активность спермы повышается в 2-2,5 раза по сравнению с контролем.
Криозащитный материал КПС, полученный из тканей рыб и морских млекопитающих, показал хорошие результаты при криоконсервации спермы форели, осетра и белорыбицы (Андреев и др., 2000). В настоящее время разработаны основные приемы и методы замораживания спермы осетровых, карповых, лососевых рыб. Криоконсервация спермы может оказаться удобным, надежным и единственно возможным способом искусственного воспроизводства и генетического улучшения некоторых видов рыб при определенных условиях: резком сокращении численности, уменьшении ареалов обитания, нарушении процессов воспроизводства (отсутствие самцов, разное время созревания самок и самцов и т.п.), деградации популяционной и генетической структуры, гибридизации территориально удаленных пород (групп, видов), необходимости сохранения уникальных объектов, полученных специальными генно-инженерными и другими специфическими методами (Цветкова и др., 2004). Известны методы криоконсервации спермы рыб более 200 видов. Установлено, что сперматозоиды морских видов рыб более устойчивы к криоконсервации по сравнению с пресноводными, хотя причины этого явления до конца не выяснены (Labbe, Maisse, 2001). При этом имеются значительные индивидуальные и внутривидовые различия по криоустойчивости сперматозоидов морских рыб, а их сперма замораживается относительно легко. Число публикаций по разработкам и совершенствованию методов криоконсервации спермы рыб, их практическому использованию растет с каждым годом (Ананьев и др., 1998 а, б). В основном внимание исследователей сконцентрировано на лососевидных рыбах. Это объясняется ценностью последних как важнейших объектов аквакультуры, а также наблюдающимся повсеместно обеднением генофондов естественных популяций, в связи с чем, необходимы срочные меры по восстановлению генетической гетерогенности деградированных стад. Разработки в области низкотемпературного консервированиях репродуктивных клеток осетровых рыб сложнее по ряду причин. Они стали возможными уже после накопления опыта работы по криоконсервации спермы лососевых и карповых рыб.
Подбор криопротекторов для глубокого замораживания половых клеток в жидком азоте
У спермиев осетровых имеются структурные и метаболические особенности, которые при неблагоприятных условиях резко меняют их криоустойчивость, поэтому с ними довольно трудно работать и получать стабильные высокие результаты выживаемости дефростированных клеток. Составы криосред, показавшие хорошие результаты на этапе начальной заморозки (-20), не оказали необходимого протекторного действия. В связи с этим, для глубокого замораживания потребовалось разработать оптимальный состав криосред для исследуемых видов на основе литературных данных и собственных исследований. Во избежание преждевременной активации при разбавлении криозащитной .средой рекомендуется добавление хлорида калия перед замораживанием (Ананьев и др., 1998 а, б). Однако хлорид калия может оказывать негативное влияние на репродуктивные клетки рыб. Для смягчения действия этого вещества необходимо в состав криосред вводить хлорид натрия, гидрокарбонат натрия, которые оказывают положительное влияние на подвижность сперматозоидов (Турдаков, 1972). Хлорид кальция, наоборот, способствует активации сперматозоидов. Однако установлено (Alavi, 2009), что без добавления в криораствор этого компонента сперматозоиды меняют траекторию движения, совершая круговые скачкообразные перемещения. Такие сперматозоиды не смогут оплодотворить яйцеклетку, а значит, не пригодны для целей искусственного воспроизводства. Присутствие хлорида кальция в составе криосред способствует увеличению двигательной активности сперматозоидов. Кальций необходим для нормального функционирования клеточных мембран, ядерного аппарата. Сахароза является важным компонентом криозащитных сред, выполняет роль антиоксидантов (Scott, Baynes, 1980): Желток куриного яйца имеет сродство с липидами сперматозоидов (Турдаков; 1972), поэтому стабилизирует мембраны в процессе криоконсервации, предохраняя их от повреждений. Высокая защитная эффективность диметилсульфоксида (ДМСО), относительно низкая токсичность, обратимость биологических эффектов способствовали широкому его использованию для консервации разнообразных биологических объектов. Наряду со способностью изменять физическое состояние воды, растворимость солей и органических растворителей, обладает выраженными антиоксидантными свойствами (Karow, 1969; Mazur, 1981; Shlafer, 1981). Существует гипотеза о влиянии ДМСО на микрокапиллярную систему клетки, через которую он не только проникает, но и циркулирует в ней, взаимодействуя с ее органеллами (Mazur, 1981; Shlafer, 1981). Микрокапиллярная система клеток обеспечивает не хаотическое распределение поступающих через мембрану в клетку ионов, а направленный их транспорт к центру клетки, обеспечивая метаболизм внутри клетки за счет проникновения необходимых соединений в ее органеллы (Чуйко, 1989). Использование ДМСО в качестве криопротектора обусловлено его коллигативными свойствами, то есть способностью снижать температуру начала кристаллизации жидкой фазы и нивелирования осмотических эффектов (Karow, 1969; Mazur, 1981). Кроме того, диметилсульфоксид может повышать вязкость и существенно снижать температуру фазового перехода липидов, способствуя увеличению сопротивляемости мембран осмотическому стрессу и появлению микротрещин и микроразрывов в клеточной мембране (Fujita et al., 1982; Herskovitz, 1962). Диметилсульфоксид повышает растворимость обычно плохо растворимых и выпадающих в осадок ионов (бикарбонатов, фосфатов, кальция и магния (Eharaech, Thyagarajen, 1984; Gordon, Wise, 1984), восстанавливает структуру белков (Fujita et al., 1982; Karow,. 1969), способствует функционированию транспортных процессов в мембране, направленных на поддержание ионной асимметрии и сохранение клеточного объема (De Beran, 1979; De Bruijne, Steveninck, 1970). После обобщения литературных данных по воздействию веществ на половые клетки осетровых рыб были подобраны оптимальные протекторы. Действие криопротекторов на спермин русского осетра после эквилибрации представлено на рисунке 5. В результате исследований было установлено, что действие протекторов на активность сперматозоидов в период эквилибрации неодинаково. Лучшие результаты были получены при использовании протектора № 3, в составе которого содержится сахароза и маннит по сравнению с нативной спермой.
Протектор № 1, который также содержит сахарозу, но в большем количестве, оказал негативное воздействие. Однако достоверность различий между действием протекторов оказалась незначимой (FKp=0,66; Р 0,05). Поэтому оценку качества спермы проводили по еще одному показателю -времени жизни сперматозоидов (рис. 6).
Оценка качества спермы с разными протекторами по времени жизни спермиев показала достоверные различия (FKp=3,54; Р 0,01). Все протекторы положительно подействовали на сперму русского осетра, о чем свидетельствует более низкий показатель времени жизни нативной спермы.
Определение оптимальных параметров усовершенствованной схемы криоконсервации половых клеток осетровых рыб
Первоначально работы проводили в лабораторных условиях в чашках Петри с малым количеством икры. Оплодотворение яйцеклеток осуществляли по четыре повторности для русского осетра и севрюги. Результаты представлены в таблице 8.
Полученные результаты в сравнении с заводскими при использовании тех же партий икры оказались высокими (принятый стандарт 75-80%). Объяснением этого факта может служить гипотеза В.И. Вернадского (2004) о том, что к каждой партии спермы от одного самца необходимо подходить с позиций отдельной популяции. Как показали наши исследования, при оценке качества спермы разных самцов осетровых рыб, партии достоверно отличались друг от друга. В этом случае для каждой партии спермы свойственна гетерогенность структуры. Последняя заключается в том, что сперматозоиды в порции спермы от одного самца не одинаковы по качеству. Наиболее активные спермии, способные к высокому проценту оплодотворения составляют, как правило, 25%; 60% партии — сперма среднего качества, спермии которой способны к оплодотворению, и третья составляющая 15% - нежизнеспособная сперма. Учитывая тот факт, что при криоконсервации часть спермиев погибает, можно предположить, что в первую очередь гибели подвержены слабо подвижные спермии. Этим можно объяснить высокий процент оплодотворения в лабораторных условиях. При использовании дефростированной спермы для оплодотворения всей икры самки, вероятность получения аналогичного эффекта необходимо установить экспериментально. В данном случае потребуется установить необходимое количество криоконсервированной спермы для оплодотворения партии икры в зависимости от ее качества после двойного температурного шока. Последнее возможно лишь при проведении экспериментов в заводских условиях на больших партиях икры по строго установленной схеме. В процессе реализации эксперимента на Александровском ОРЗ было необходимо провести исследования по оттаиванию малых и больших партий спермы. При размораживании малых партий спермы (до 5 ампул) не происходит резкого снижения температуры воды (среда для оттаивания при температуре 38С). Время оттаивания составляло при этом 25-30 с, при этом качество спермы остается высоким. Однако, при разморозке больших партий материала (от 20 ампул и выше) при данном режиме наблюдали резкое снижение температуры воды, за счет чего время оттаивания увеличивается до 5 мин. Последнее приводит к росту кристаллов внутри клеток спермиев, и, как следствие, к ухудшению качества половых продуктов. При этом качество спермы снижалось в 5 раз.
Для установления оптимальных режимов оттаивания больших партий спермы осетровых рыб был поставлен эксперимент. В результате исследований получены следующие показатели в пересчете на 20 ампул объемом 1,5 мл замороженных проб/, объем воды 1 литр, температура - 42-43С. Время оттаивания при данных параметрах составляет 35-45 с, качество спермы не отличается от стандартной дефростированной.
Для проведения эксперимента по искусственному оплодотворению взяли самку русского осетра массой 17 кг, длина составила 115/133 см, рабочая плодовитость 187000 шт. икринок, масса икры 3,4 кг. Половину икры (1,7 кг) оплодотворили нативной спермой (активность 95%, время жизни 320 с) из расчета 10 мл на 1 кг икры - 17 мл. Вторую часть (1,7 кг) оплодотворили дефростированной спермой (активность 40%, время жизни 280 с). Так как при проведении криоконсервации и подготовительных работ к процессу оплодотворения разбавление спермы происходит в 4 раза;, то дефростированной спермы было взято из расчета 40 мл на 1 кг икры - 68 мл.
Процент оплодотворения в контрольной партии икры составил 90%, а в опытной партии - 30%. Процесс инкубации продолжался 5 суток. В этот период важную роль играет температурный режим. Температура воды в период инкубации составила 14,5-18,3С, суточные колебания в среднем 1,9С.
В результате исследования раннего онтогенеза русского осетра было установлено, что эмбриональное развитие икры в контроле идет с небольшим опережением по сравнению с опытом (рис. 26). Однако длительность эмбриогенеза в опыте не выходит за пределы установленных норм.
Вылупление предличинок в контрольной партии началось на три часа раньше, чем в опытной и составило 75% и 20% от заложенной на инкубацию икры, соответственно.
Низкий процент выхода предличинок от икры в опыте связан с невысоким процентом оплодотворения. В связи с этим в дальнейшем необходимо совершенствовать методику подготовки дефростированных половых клеток к осеменению икры.
На пятые сутки после вылупления предличинка начала переходить на смешанное питание дафнией. Это на два дня раньше, чем аналогичные партии предличинок русского осетра, содержащиеся в заводских условиях. В этот период наблюдали незначительный отход, который составил 2,8% в контроле и 9,8% в опыте. Морфометрические показатели представлены в таблице 9.
За период выдерживания предличинки исследуемых партий незначительно отличались по морфометрическим показателям, что не выявило различий в раннем онтогенезе. Достоверные различия отмечены лишь в длине желточного мешка, что может указывать на большее содержание питательных веществ у группы личинок в опыте в конце периода выдерживания. Это свидетельствует об интенсивном протекании обменных процессов у группы в контроле по сравнению с опытом.
Поведенческие реакции молоди русского осетра, полученной с помощью нативнои и криоконсервированнои спермы
Сравнение изменений двигательной активности молоди русского осетра в ответ на различного рода раздражители, выращенной из нативной и дефростированной спермы, является одним из основных показателей пригодности технологии криоконсервации для использования в аквакультуре.
Согласно литературным данным (Касимов, 1980; Кокоза, 1983; Лукьяненко и др., 1984; Никоноров, Витвицкая, 1993), одной из основных причин гибели заводской молоди после выпуска из выростных прудов является интенсивное выедание хищниками, практически не зависящее от размера молоди, а связанное со слабым развитием у рыб от искусственного воспроизводства оборонительного поведения и способности быстро реагировать на внешние раздражители. В связи с этим, наиболее адекватным показателем реактивности молоди на раздражители будет являться методика «открытое поле» (Никоноров, Витивицкая, 1993) с помощью которой регистрируют реактивность ЦНС и, следовательно, готовность молоди к жизни в естественных водоемах.
Результаты биологического тестирования молоди русского осетра, полученной с использованием нативной и дефростированной спермы, представлены в таблице 11. После статистической обработки установлено, что между партиями в контроле и в опыте нет достоверных различий ни в одном тесте. По средним значениям построен график изменения реакций молоди русского осетра обеих партий в ответ на разные воздействия (рис. 29). Отсутствие различий в поведении молоди в контроле и в опыте свидетельствует о нормальном развитии центральной нервной системы русского осетра в обеих партиях. Однако необходимо проследить динамку реакций на раздражители (рис. 30). На все тестовые раздражители реакция молоди в опыте несколько превышала контроль. Динамика изменений реактивности исследуемых групп свидетельствует о том, что в контрольной группе рыбы более возбудимы (ОА, ФА). Это является причиной более низких ответных реакций при возбуждении органа слуха (Р1) и рецепторов боковой линии (Р2). По итогам тестирования можно сделать вывод, что молодь, полученная из криоконсервированной спермы, после длительного хранения в жидком азоте, не отличается по реактивности центральной нервной системы от контрольной партии. Вместе с тем, динамика двигательной активности демонстрирует более интенсивную реакцию молоди в опыте на раздражители, что имеет большое значение при адаптации молоди к условиям естественных водоемов. В результате проведения научных исследований по оптимизации методов криоконсервации половых клеток осетровых видов рыб были введены новые звенья в биотехнологию замораживания и длительного хранения биологического материала. Разработаны новые методы низкотемпературного консервирования спермы осетровых рыб, которые дают стабильные результаты и способствуют сохранению репродуктивных качеств половых клеток на высоком уровне.
Подобраны криосреды, предохраняющие от разрушений клетки на начальных этапах замораживания и во время краткосрочного хранения при температурах до -20С, обеспечивающие выживаемость спермиев до 50% после дефростации.
При проведении исследований процесса глубокого замораживания и долгосрочного хранения при температуре -196С подобраны оптимальные криопротекторы для русского осетра и севрюги. Установлено, что больший процент выживших активных спермиев русского осетра наблюдается при использовании в качестве протектора состава №4, а для севрюги - состава №3, что подтвердило гипотезу о видоспецифичности криосред и протекторов.
Установлено, что при использовании электростимуляции на этапе эквилибрации увеличивается проницаемость мембран, и криопротекторы, проникая внутрь клеток, предохраняют их от повреждений в процессе замораживания. Выживаемость сперматозоидов с применением электростимуляции после дефростации увеличивается по сравнению со спермой, замороженной по традиционной методике, в 1,5 раза.
При дефростации образцов спермы наблюдается разрушение мембран клеток вследствие постгипертонического лизиса. Для предотвращения данного явления в качестве отмывающего раствора использовали физиологический раствор (0,65% раствор NaCl). При этом выживаемость дефростированных половых клеток увеличилась в 1,4 раза для русского осетра и в 1,6 раза для севрюги, время жизни - в 1,5 раза у русского осетра и в1,1 раза у севрюги.
В результате усовершенствования технологии криоконсервации половых клеток осетровых рыб удалось получить выживаемость дефростированных спермиев до 70-80%, что значительно превышает выживаемость при использовании существующей технологии - 50%.
Проведение опытов по использованию криоконсервированного материала для искусственного оплодотворения икры в лабораторных и заводских условиях подтвердило эффективность разработанных методов. В лабораторных испытаниях получена высокая степень оплодотворения — до 90%. При испытаниях на больших партиях икры в условиях рыбоводного завода получено оплодотворение дефростированной спермой 30% от контроля, которым служила нативная сперма, выход предличинок от икры составил 27% от контроля. Отмечено, что дефростированный генетический материал не оказывает негативного влияния на развитие осетровых рыб в раннем онтогенезе.
При проведении биологического тестирования молоди русского осетра методом «открытое поле» не выявлено достоверных различий в поведенческих реакциях на раздражители в контроле и опыте, что указывает на нормальное развитие центральной нервной системы молоди в опыте.
Похожие диссертации на Оптимизация методов криоконсервации спермы для сохранения генофонда осетровых рыб
