Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 15
1.1. Преимплантационное развитие зародышей млекопитающих 15
1.2. Репродуктивная система животных, как среда для раннего развития и как мишень репродуктивных технологий 21
1.2.1. Репродуктивная система самцов в качестве индикатора влияния гормонально активных соединений 21
1.2.2. Репродуктивная система самок млекопитающих в связи с преимплантационными этапами развития зародышей 25
1.3. Раннее поснатальное развитие млекопитающих. Взаимодействие матери и новорожденных в период вскармливания 29
1.3.1. Изменение материнской среды в раннем постнаталыюм онтогенезе. Приемное воспитание 34
1.4. Изменение материнской среды в преимплантационный период: инструмент изучения онтогенеза млекопитающих и подход к сохранению генофонда 40
1.4.1. Трансплантация эмбрионов и базирующиеся на ней технологии в сельскохозяйственной биотехнологии 40
1.4.2. Межвидовая трансплантация эмбрионов: общий обзор в исторической ретроспективе 52
1.4.3. Межвидовая трансплантация и криоконсервация эмбрионов -как подход к сохранению исчезающих видов млекопитающих 53
1.4.3.1. Влияние комплекса процедур криоконсервации на состояние ядерной ДНК в различных клетках, а также на последующую судьбу эмбрионов, ооцитов и клеточных популяций 58
1.4.4. Репродуктивное клонирование в сочетании с трансплантацией эмбрионов - как метод сохранения исчезающих видов млекопитающих 60
1.4.5. Программа экстракорпорального оплодотворения; ее применение
в медицине и с целью сохранения исчезающих видов млекопитающих 63
1.5. Роль гормональной среды в раннем развитии млекопитающих 65
1.5.1. Эффекты воздействия гормонов на раннее развитие млекопитающих (преимплантационные эмбрионы и имплантация) 67
1.5.2. Влияние эстрадиола и ксеноэстрогенов на поздние этапы пренатального онтогенеза млекопитающих 73
1.5.3. Влияние эстрадиола и ксеноэстрогенов на формирующуюся репродуктивную систему в постнаталыюм онтогенезе млекопитающих 77
1.5.4. Использование гормональных препаратов при вызывании суперовуляции 80
1.5.5. Отдаленные эффекты гормональных воздействий 85
1.6. Европейская норка - исчезающий вид млекопитающих. Существующий статус и стратегии сохранения 87
1.6.1. Характеристика европейской норки в сравнении с другими видами куницеобразных 88
1.6.2. Причины исчезновения европейской норки 90
1.6.3. Сохранение европейской норки - достижения, проблемы и перспективы 91
1.7. Заключение по обзору литературы 93
ГЛАВА II. Материалы и методы 96
2.1. Экспериментальные животные и экспериментальные модели 96
2.1.1.Мыши 96
2.1.2. Крысы 96
2.1.3. Куницеобразные 103
2.2. Методы получения/трансплантации/криоконсервации эмбрионов 103
2.3. Методы оценки преимплантационных зародышей млекопитающих 110
2.3.1. Общие методы 110
2.3.2. Специальные методики при изучении и оценке эмбрионов мышей и крыс 111
2.3.2.1. Изготовление препаратов зародышей и их оценка 111
2.3.3. Специальные методики при изучении и оценке эмбрионов куницеобразных 112
2.3.3.1. Культивирование зародышей после криоконсервации 112
2.3.2.1. Инкубация с флюоресцентным красителем ФДА и последующей оценкой на люминисцентном микроскопе 113
2.4. Изучение отдаленных эффектов изменения гормональной среды в ходе раннего развития 113 2.4.1. Экзогенные гормональные воздействия в ходе преимплантациопного онтогенеза 113 2.4.2 .Методы оценки отдаленных эффектов после ранних гормональных воздействий 114
2.5. Изучение последствий изменения материнской среды в ходе преимплантационного (трансплантация эмбрионов) или постнатального (кросс-фостеринг) развития 117
2.5.1. Физиологические тесты 117
2.5.2. Поведенческие тесты 118
2.6. Статистическая обработка результатов 119
ГЛАВА III. Результаты исследования 120
3.1. Раннее развитие европейской норки и эмбриотехнологические подходы к сохранению этого исчезающего вида 120
3.1.1. Сравнительное изучение преимплантационного развития эмбрионов куницеобразиых: европейская норка, черный хорек и горностай 120
3.1.1.1. Европейская норка- преимплантациониое развитие бездиапаузы 120
3.1.1.2. Горностай - преимплантациониое развитие с облигатной диапаузой 122
3.1.1.3. Преимплантациониое развитие у черного хорька 124
3.1.1.4. Черный хорек - как «репродуктивная модель» европейской норки 125
3.1.2. Трансплантация эмбрионов куницеобразиых 126
3.1.2.1. Внутривидовая трансплантация эмбрионов на хорьках 126
3.1.2.2. Преодоление межвидового барьера. Хонорики и нохорики в качестве реципиентов при трансплантации эмбрионов от европейской
норки 130
3.1.3. Криоконсервация эмбрионов куницеобразиых 136
3.1.4. Суперовуляция у куницеобразиых 141 Резюме раздела 3.1 142
3.2. Влияние процедур криоконсервации на эмбрионы у
млекопитающих 144
3.2.1. Криоселекция при криоконсервации эмбрионов мышей 144
3.2.2. Криоселекция при криоконсервации эмбрионов крыс 145 Резюме раздела 3.2. 147
3.3. Онтогенетические и эмбриотоксические эффекты гонадотропных,
эстрогенных и ксеноэстрогенных воздействий на преимплантациониое
развитие млекопитающих in vivo 148
3.3.1. Применение стандартной суперовуляторной схемы как модель изменения гормональной среды в ходе раннего развития животных 148
3.3.2. Характер суперовуляции у половозрелых мышей в зависимости от собственного эндокринного статуса 150
3.3.3. Влияние эстрогенов, ксеноэстрогенов и гонадотропинов на развитие зародышей и их миграцию из яйцеводов в матку 152
3.3.4. Отдаленные эффекты на общее и половое развитие в период вскармливания 158
3.3.4.1. Демаскулинизация полового развития самцов Маскулинизация
самок. Уменьшение полового диморфизма 160
3.3.4.2. Ускорение полового созревания самок 162
3.3.5. Отдаленные эффекты на репродуктивный статус во взрослом состоянии 163
3.3.5.1. Отдаленные эффекты на репродуктивный статус взрослых самцов после воздействий эстрадиола или ксеноэстрогена МКХ на стадии преимплантационного зародыша 163
3.3.5.2. Отдаленные эффекты на репродуктивный статус взрослых самцов после воздействий эстрадиола или ксеноэстрогена МКХ на стадии имплантирующегося зародыша 166
3.3.5.3. Отдаленные эффекты на репродуктивный статус взрослых самок после воздействий эстрадиола или ксеноэстрогена МКХ на стадии преимплантационного зародыша 168
Резюме раздела 3.3 171
3.4. Физиологические и поведенческие эффекты изменения материнской среды в раннем пренаталыюм/ раннем постнатальном развитии млекопитающих 172
3.4.1. Последствия изменений материнской среды в раннем пренаталыюм онтогенезе для формирования гипертензивного фенотипа у крыс НИСАГ 172
3.4.2. Обратное влияние трансплантации эмбрионов и/или приемного воспитания на приемную мать 177
3.4.3. Изменение материнской среды во время постнатального развития крыс ГК: отдаленные эффекты приемного воспитания 182
Резюме раздела 3.4 184
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 186
4.1. Эффекты изменения материнской среды (криоконсервация, гормоны) па развивающиеся in vivo эмбрионы млекопитающих 186
4.2. Особенности раннего развития европейской норки в сравнении с горностаем и хорьком 193
4.3. Особенности применения метода трансплантации эмбрионов у куницеобразных 197
4.4. Криоконсервация зародышей куницеобразных 202
4.5. Последствия изменения гормональной среды во время преимплантационного развития in vivo (экзогенные эстрогены, ксеноэстрогеиы, гонадотропины) для дальнейшего онтогенеза млекопитающих 207
4.6. Влияние трансплантации эмбрионов и приемного воспитания на проявление генетически обусловленных признаков. Роль материнской среды в формировании гипертензивного фенотипа у крыс НИСАГ и
каталептическогофенотипа у крыс ГК 216
Заключение 228
Выводы 230
Список литературы
- Репродуктивная система животных, как среда для раннего развития и как мишень репродуктивных технологий
- Трансплантация эмбрионов и базирующиеся на ней технологии в сельскохозяйственной биотехнологии
- Методы получения/трансплантации/криоконсервации эмбрионов
- Сравнительное изучение преимплантационного развития эмбрионов куницеобразиых: европейская норка, черный хорек и горностай
Введение к работе
Многие виды млекопитающих, обитавшие ранее на нашей планете, безвозвратно исчезли. В XIX в. было зарегистрировано вдвое больше исчезнувших видов млекопитающих по сравнению с веком XVIII (Flesness, 1989). Процесс принял особенно угрожающие размеры в конце XX (Woodford, 1990) и в начавшемся XXI веке. Существует два принципиальных подхода к сохранению исчезающих видов млекопитающих. Первый заключается в сохранении жизнеспособных популяций in situ - т.е. в местах их обитания, включая охранные мероприятия и создание благоприятных условий для существующих в природе популяций. Второй подход основан на сохранении видов ex situ - т.е. вне их мест обитания. Сюда относится как сохранение небольших популяций в зоопарках, питомниках и т.п., так и создание криобанков эмбрионов и гамет (Wildt, 1992; Holt, Pickard, 1999). Имеется ряд публикаций, в которых перечислены существенные ограничения традиционных методов сохранения животных из дикой природы (Wildt, 1992; Lasley et al., 1994; Loskutoff, 1998). Подавляющее большинство специалистов согласны с тем, что оптимальной стратегией для сохранения биоразнообразия видов млекопитающих является сочетание традиционных мероприятий и арсенала современных методов, основанных на достижениях репродуктивной биологии (Wildt, 1992; Loskutoff, 1998;2003; Pukazhenthi, Wildt, 2004). Применение последних позволяет преодолеть целый ряд ограничений, свойственных традиционным методам сохранения генофонда животных (Bainbridge, Jabbour, 1998; Pukazhenthi, Wildt, 2004). Так, например, путем сочетания традиционных мероприятий и репродуктивных технологий удалось предохранить от полного исчезновения черноногого хорька (Mustela nigripes) (Wildt et al., 1992; Howard et al., 2001). Подобных успешных примеров, однако, не очень много. Более общим случаем является ситуация, когда при попытках применения эмбриотехнологий при работе с дикими и исчезающими видами млекопитающих возникают серьезные проблемы (Loskutoff, 2003). В каждом из успешных случаев применения эмбриотехнологий по отношению к конкретному виду млекопитающих из дикой фауны учитывается видовая специфика, а успеху предшествует детальное изучение репродуктивной биологии данного вида (Wildt et al., 1992; Pukazhenthi, Wildt, 2004).
В семействе куницеобразных исчезающих видов достаточно много (Schreiber et al., 1989; Терновский, Терновская, 1994). В частности, в России и в Европе широко обсуждается проблема европейской норки (Mustela lutreola) (Терновский, Туманов, 1973; Терновский, Терновская, 1994; Maran, Henttonen, 1995; Sidorovich, 2000). В 2003 году состоялась первая международная конференция, целиком по-
8 священная этой проблеме. В резолюциях этой конференции, в качестве приоритетных направлений, наряду с традиционными подходами было намечено изучение особенностей репродуктивной биологии и разработка современных биотехнологических методов для сохранения этого вида куницеобразных (1st International Conference on Conservation of the European mink. Logrono, Spain, 2003).
Актуальность предложенной темы обусловлена, прежде всего, актуальностью разработки новых подходов к сохранению исчезающих видов млекопитающих. В последнее время, однако, накапливается достаточно много данных о том, что применение некоторых репродуктивных технологий может сопровождаться весьма заметными побочными эффектами и негативно сказываться на последующем развитии индивида (McEvoy et al., 1998, 2001). В нашей работе мы сосредоточились на базовых репродуктивных технологиях, имеющих достаточно длительную историю применения, таких, как трансплантация и криоконсервация эмбрионов и вызванная введением гормонов суперовуляция. Несмотря на то, что вопросы о возможных длительных побочных эффектах этих репродуктивных технологий первого поколения поднимались ранее (Dulioust et al., 1995; Foote, Ellington, 1998), эти вопросы до настоящего времени остаются все ещё открытыми. Актуальность этой части работы определяется тем, что при применении репродуктивных технологий эмбрион подвергается комплексу базовых процедур, которые являются более или менее жестким изменением среды эмбрионального развития. Неизбежным элементом при трансплантации эмбрионов, например, является изменение как пре-натальной, так и постнатальной компоненты материнской среды. Зачастую эмбрионы подвергаются также гормональному воздействию (в случае суперовуляции) и комплексу процедур, связанных с криоконсервацией (т.е. замораживанию, размораживанию и воздействию криопротекторов).
Таким образом, актуальность данного исследования определяется не только разработкой видоспецифичных репродуктивных технологий, но и попыткой изучить последствия изменения материнской среды для потомков (в связи с современными эмбриотехиологиями). Актуальным является также изучение обратного влияния кросс-фостеринга и трансплантации эмбрионов на приемную мать. Кроме того, в рамках данной работы впервые изучено раннее развитие у исчезающего вида - европейской норки в сравнении с другим малоизученным видом куницеобразных - горностаем и в сравнении с ближайшим родственником европейской норки -черным хорьком. Цели и задачи исследования. Цели:
1. Разработка подходов к сохранению европейской норки на основе сравни-
тельного изучения особенностей раннего развития этого исчезающего вида куни-цеобразных и применения методов эмбриотехнологии.
2. Изучение последствий изменения материнской среды в результате применения таких репродуктивных технологий, как криоконсервация и трансплантация эмбрионов, а также гормональных воздействий (гонадотропины, эстрогены).
Для достижения указанных целей были поставлены и решены следующие основные задачи:
Изучить особенности преимплантациоииого развития европейской иорки (М lutreola) в сравнении с двумя другими видами куницеобразных - черным хорьком (М putorius) и горностаем (М erminea).
Разработать эмбриотехнологические подходы к сохранению биоразнообразия исчезающего вида - европейской норки.
Изучить последствия гормональных (гонадотропных, эстрогенных) воздействий во время преимплантациоииого развития млекопитающих in vivo: как на уровне развивающегося зародыша, так и на более поздних этапах онтогенеза.
На различных линиях лабораторных мышей и крыс определить последствия применения комплекса процедур криоконсервации по отношению к преим-план-тационным зародышам.
Изучить роль материнской среды в формировании фенотипических характеристик, свойственных определенным линиям лабораторных крыс (гипертензив-ная линия НИСАГ и линия крыс ГК с аномальным поведением).
Изучить обратные влияния кросс- и ин-фостеринга, а также трансплантации эмбрионов на физиологический статус приемной матери.
Положения, выносимые на защиту.
Результаты работы свидетельствуют о том, что методы репродуктивной биологии, такие, как криоконсервация и трансплантация эмбрионов, представляют собой дополнительную возможность для сохранения генофонда исчезающих видов куницеобразных.
Раннее развитие европейской норки (М. lutreola) сходно с ранним развитием черного хорька (М putorius). В связи с этим, хорька следует использовать в программах сохранения европейской норки ex situ, в частности, хонорики и нохо-рики подходят в качестве реципиентов для трансплантации эмбрионов европейской норки.
Различные эстрогенные и гонадотропные воздействия в ходе ранней беременности млекопитающих приводят к сходным нарушениям в пре- и постнаталь-ном онтогенезе, вызывая характерные изменения развития эмбрионов и полового созревания потомков, такие, как изменение темпов развития зародышей и их ми-
грации в матку, уменьшение полового диморфизма в ходе раннего постпатального онтогенеза и ускорение полового созревания самок, а также функциональные нарушения репродуктивной системы у взрослых животных.
4. При применении методов репродуктивной биологии с целью сохранения исчезающих видов млекопитающих следует учитывать, что как пренатальные (трансплантация эмбрионов, гормональные воздействия), так и постнатальные (приемное воспитание) изменения материнской среды отражаются на поведении/физиологии потомков. Таким образом, при восстановлении популя-ций/видов из криобанка первое поколение может обладать особыми свойствами и характеристиками, а у самок-реципиентов могут возникать транзиторные изменения их физиологического статуса. Научная новизна.
Впервые изучено преимплантационное развитие у исчезающего вида куни-цеобразных - европейской норки {М. lutreola). Также впервые было систематически изучено преимплантационное развитие горностая, о котором до начала данной работы имелись лишь фрагментарные сведения.
Впервые показана принципиальная возможность успешной криоконсервации эмбрионов у куницеобразных. Разработана модель преодоления межвидового барьера в семействе куницеобразных при трансплантации эмбрионов европейской норки межвидовым гибридам хорька и норки (хонорикам и нохорикам).
Впервые системно изучены эффекты воздействия различных эстрогенных и гонадотропных препаратов в ходе преимплантационного развития in vivo у млекопитающих. На мышах выявлены отдаленные эффекты этих воздействий как на уровне самих преимплантационных зародышей, так и на постимплантационных этапах онтогенеза, а именно:
а) впервые показано, что воздействия на ранних стадиях беременности эстрадио-
лом (Э), ксеноэстрогеном метоксихлором (МКХ), а также человеческим хориони-
ческим гонадотропином (ЧХГ) (в комбинации с гонадотропином сыворотки жере
бых кобыл (ГСЖК) либо самостоятельно) приводят к задержке части зародышей в
яйцеводах и угнетающе влияют на их развитие, вызывая характерные аномалии;
б) впервые продемонстрировано, что воздействие перечисленными выше гормо
нальными препаратами на ранних стадиях беременности у мышей сопровождается
нарушениями полового развития у потомков в постнаталыюм онтогенезе (демаску-
линизация у самцов; маскулинизация и ускоренное половое созревание у самок),
что приводит к репродуктивным нарушениям при взрослении этих потомков.
Впервые изучена роль материнской среды в проявлении артериальной ги-пертензии у крыс линии НИСАГ и каталепсии у крыс линии ГК. Было показано,
что характерный для каждой из этих двух линий фенотип развивается в наиболее полной форме лишь тогда, когда вскармливание производится матерями этой же линии. Если же крысят НИСАГ или ГК вскармливают приемные матери «нормальной» линии Вистар, то формирование артериальной гипертензии или генетической каталепсии (соответственно) замедляется и смягчается. Кроме того, как в том, так и в другом случае, при воспитании крысят НИСАГ или ГК приемными матерями Вистар их поведение в тесте «открытое поле» изменялось и становилось более похожим на поведение крыс Вистар. В то же время, крысы линии Вистар не становились гипертониками или каталептиками при вскармливании их, соответственно, приемными матерями линии НИСАГ или ГК.
Впервые обнаружено, что физиология приемной матери/самки-реципиента может меняться в результате приемного воспитания и/или трансплантации эмбрионов. Так артериальное давление самок-реципиентов Вистар было повышенным в течение четырёх месяцев после окончания вскармливания крысят НИСАГ, родившихся в результате трансплантации эмбрионов, что является новой моделью для изучения взаимодействия эмбриона/новорожденного и приемной матери. Научно-практическая значимость. Основным вкладом исследования в зоологию является систематическое изучение наиболее ранних этапов развития европейской норки (преимплантационное развитие которой до начала данной работы вообще не изучалось) и горностая (о раннем развитии которого имелись лишь фрагментарные сведения). Полученные данные по раннему развитию европейской норки открывают новые подходы к сохранению этого исчезающего вида млекопитающих. Технологии вымывания, трансплантации и криоконсервации эмбрионов куницеобразных были отработаны на хорьках. Продемонстрирована практическая возможность их применения по отношению к европейской норке. В частности, практическое значение имеет создание технологии трансплантации эмбрионов европейской норки межвидовым гибридам (хонорикам и нохорикам). Практическое значение также имеет цикл работ по криоконсервации эмбрионов куницеобразных, в ходе которого было показано, что зародыши куницеобразных выживают после глубокого замораживания и криохранения и способны к дальнейшему развитию как in vitro, так и in vivo. Было показано, что такие известные криопротекторы, как ДМСО и глицерин не пригодны для использования в процессе замораживания эмбрионов куницеобразных, однако этиленгликоль пригоден для этих целей.
Изучение характерных последствий воздействия гонадотропных и эстроген-ных гормонов на стадии преимплантационного зародыша может рассматриваться как теоретическая база метода суперовуляции, широко используемого в сельском хозяйстве и в медицине. Учет описанных в работе эффектов применения гонадо-
тропных и эстрогенных гормонов дает возможность принимать практически важные решения о применимости (или неприменимости) этого метода в зависимости от целей программы/эксперимента. Другим важным аспектом является усиление гормональных влияний на млекопитающих и человека со стороны окружающей среды в современном мире. В данной работе показано, что развивающиеся in vivo зародыши млекопитающих являются чувствительной мишенью этих влияний. Описание последствий ранних гормональных воздействий имеет важное теоретическое значение не только для зоологии, экологии и эмбриологии, но и для осознания возможных перспектив репродуктивного здоровья различных видов млекопитающих и человека.
Изучены эффекты комплексной процедуры криоконсервации и отдельных ее компонентов по отношению к зародышам млекопитающих и выявлена роль генотипа в криорезистентности. Это является экспериментальным обоснованием крио-селекции при создании криобанков. Таким образом, появляется возможность понять механизм улучшения характеристик некоторых клеточных культур после криоконсервации.
Многочисленные эксперименты по гормональным воздействиям на ранних этапах развития зародышей, перекрестному воспитанию и трансплантации эмбрионов позволили сформулировать важное положение о том, что эти широко применяемые на практике биотехнологические приемы (приемное воспитание является неотъемлемым компонентом трансплантации эмбрионов) сопровождаются характерными изменениями в дальнейшем онтогенезе потомков первого поколения, что важно практически учитывать в программах сохранения редких и исчезающих видов и пород. Изучение роли материнской среды в ходе ранних периодов пренатального и постнаталыюго развития у крыс НИСАГ и ГК имеет существенное значение для понимания механизмов формирования артериальной гипертензии и каталепсии, а в более широком контексте имеет прямое отношение к важнейшей теоретической проблеме современной биологической науки: изучению роли ранней среды развития в реализации генетически обусловленных признаков.
Основные экспериментальные результаты и теоретические выводы работы используются в курсе лекций, читаемом на факультете естественных наук в Новосибирском госуниверситете. Кроме того, результаты диссертации, касающиеся изучения репродуктивной биологии европейской норки, хорька и горностая, используются в курсе лекций для студентов университета города Куопио (Финляндия). Методические приемы и новые данные, полученные в ходе выполнения данной диссертации, используются в научных исследованиях, проводимых в ИЦиГ и ИСЭЖ СО РАН, Институте прикладной биотехнологии университета Куопио
(Финляндия) и в университете Айдахо (США). Областями применения экспериментальных результатов и теоретических выводов диссертации являются зоология, эмбриология, генетика, а также практика сохранения исчезающих видов и пород млекопитающих. Апробация работы.
Основные результаты диссертации обсуждены на всероссийских и международных конгрессах: 2-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, 1995 (Новосибирск) International Conference: Frontiers in Laboratory Animal Science, Joint Conference of ICLAS, ScandLas and FinLAS ,1995 (Helsinki, Finland) 6-th International Scientific Congress in Fur Animal Production, 1996 (Warsaw, Poland). международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики", посвященной 80-летию акад. Д.К.Беляева, 1997 (Новосибирск) 15-м рабочем совещании по консервации генетических ресурсов, 1998 (г. Пущино, Московская область) Международном симпозиуме «Генетика и развитие психонейроэндокрин-ных механизмов», посвященном памяти проф. Е.В. Науменко, 1999 (Новосибирск) 14th International Congress on Animal Reproduction (ICAR), 2000 (Stockholm, Sweden) 17-м рабочем совещании по консервации генетических ресурсов, 2002 (г. Пущино, Московская область) научной конференции «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии», посвященной 80-летию со дня рождения проф. М.Г.Колпакова, 2002 (г. Новосибирск) International Conference on the Conservation of the European Mink, November 5-8 (Logrono, Spain) международной научной конференции «Сохранение генетических ресурсов», 19-22 октября 2004 (Санкт - Петербург).
Сотрудничество. Все основные результаты представленные в диссертации получены автором самостоятельно. Эксперименты по разработке подходов к сохранению исчезающих видов куницеобразных ex situ были начаты нами в Новосибирске в сотрудничестве с Л.Ф. Максимовским, Д.В. Терновским Ю.Г. Терновской (на хорьках и горностае), а затем продолжены (на хорьках) в университете Куопио (Финляндия) в сотрудничестве с Хели Линдеберг, Юсси Аальто, Микко Ярвинен и Майей Валтонен. Впоследствии эти разработки были использованы при работе с европейской норкой, которая проводилась в сотрудничестве с Ю.Г. Терновской Е.А. Кизиловой, Г.А. Зудовой, Хели Линдеберг, Юсси Аальто, Микко Ярвинен и Майей Валтонен.
В проведении экспериментов на других моделях, таких, как мыши и крысы, ряд опытов был выполнен в сотрудничестве с Т.Г. Амстиславской, Е.А. Кизиловой, О.Е. Рединой, А.Н. Голубицей, В.Г. Колпаковым, Т.А. Алехиной, Н.Н. Барыкиной, В.Ф. Чугуй, О.И. Петренко, Л.Н. Масловой и В.А.Булыгиной. В проведении экспе-
риментов на крысах НИСАГ существенную помощь оказывали студенты-дипломники М. А. Штейн и И. Ю. Басова. Особенной благодарности заслуживает внимательное отношение к работе зав. лабораторией эволюционной генетики профессора А.Л. Маркеля, который предоставил возможность работы на полученных им путем селекции крысах НИСАГ, а кроме того, своей личностью и отношением к науке, задавал высокий научный стандарт на всем протяжении выполнения данного исследования.
Гранты. Работа была поддержана программой "Биоразнообразие" в 1993-1995 гг., грант: "Создание криобанка зародышей и спермы редких и исчезающих видов хищных животных". В 1995-1997 гг. работа была поддержана грантом РФФИ "Влияние криоконсервации и трансплантации эмбрионов на артериальное давление и другие физиологические функции у крыс с наследственной артериальной гипертензией". В 1999-2001 гг. работа проводилась в соответствии с программой гранта РФФИ "Влияние изменения материнской среды в ходе пренатального и раннего постнатального онтогенеза на формирование некоторых аномальных форм поведения у крыс". Та часть исследований данной диссертации, которая связана с изучением влияния гормональных воздействий на преимплантационные зародыши, поддержана двумя грантами программы "Университеты России". В 1999-2001 гг. работа была поддержана грантом «Изучение эмбриотоксических и генотоксиче-ских эффектов экоэстрогенов в развитии эмбрионов млекопитающих: поиск безопасных репродуктивных технологий". В 2002-2003 гг. это направление исследование было продолжено в соответствии с планом гранта «Ранние стадии развития зародышей млекопитающих и рыб как возможная мишень экоэстрогенов: влияние на соотношение полов в потомстве и половое развитие». Исследование европейской норки и разработатка репродуктивно-биологических подходов направленных на сохранение этого исчезающего вида млекопитающих поддержано совместным грантом российской и финской академий наук: "Embryo cryobanking and assisted reproductive techniques in Mustelidae species with special emphasize on the preservation and propagation of endangered European mink» (2000-2005 гг.). Структура и объем диссертации.
Материалы диссертации изложены на 265-ти страницах и включают 21-ну таблицу и 35 рисунков. Список цитированной литературы содержит 644 ссылки на статьи и монографии, в том числе 68 отечественных и 576 зарубежных. Публикации.
Основные результаты представлены в монографии и 35 научных статьях, опубликованных в рецензируемых отечественных и международных журналах.
Репродуктивная система животных, как среда для раннего развития и как мишень репродуктивных технологий
Придаток семенника - это парная железа, примыкающая к семеннику и со-стояцая из головки {caput epididimis), переходящей в тонкое тело придатка (corpus epididimis), которое, однако, у каудального конца вновь расширяется, образуя хвост (cauda epididimis). От хвостового конца отходит семявыносящий проток (vas deferens). В эпидидимисе происходит дозревание сперматозоидов с образованием зрелых форм (Cupps, 1991). Известно, что как развитие эпидидимиса (Thomson, 2001), так и его функция (Cupps, 1991) в большой мере зависимы от андрогенов. В эпидидимисе мышей, крыс и обезьян обнаружены рецепторы к эстрадиолу (ЭР) как альфа, так и бета подтипов, причем плотность рецепторов альфа подтипа даже выше, чем в матке (Fisher et al., 1997; Hess et al., 1997 a,b). Наличие эстроген- зависимого механизма в эпидидимисе делает эту структуру потенциальной мишенью эс-трогенных воздействий окружающей среды.
Придаточными железами мужской половой системы у мышей являются предстательная железа, семенные пузырьки, ампулярные железы, бульбо-уретральные (Куперовы) железы, ампулярные железы, препуциальные железы (Hummel, Richardson, 1968). Все эти железы играют важную роль в формировании секрета спермы (Cupps, 1991), однако у некоторых видов млекопитающих могут отсутствовать некоторые из этих желез (Hafez , 1987; Cupps, 1991). Например у кобелей имеется лишь предстательная железа (Christiansen, 1984; Cupps, 1991). Ниже мы остановимся более подробно на предстательной железе и семенных пузырьках, поскольку современными исследованиями продемонстрировано, что эти железы являются чувствительными мишенями гормонов и гормоноподобных соединений эстрогенной природы и, таким образом, могут служить индикаторами влияния ксеноэстрогенов и других гормонов, влияющих на уровень эндогенного эстрадиола.
Предстательная железа (простата) начинает формироваться у мышей на 17-й день развития путем врастания эпителия урогенитального синуса в в окружающую мезенхиму (Thomson, 2001). У мышей простата состоит из долек и морфологически подразделяется на дорзальную и вентральную. Простата у мышей является важной мишенью андрогенов, которые влияют на ее развитие (Thomson, 2001), однако эстрогены (Vom Saal et al., 1989; 1997; Nonneman et al., 1992) и ксе-ноэстрогены (Welshons et al., 1999) существенным образом модулируют чувствительность этой железы к андрогенам.
Многочисленные исследования показали, что андрогены необходимы как для инициации развития и первых этапов роста простаты в ходе пренатального онтогенеза, так и для продолжения роста и развития простаты в ходе постнатального онтогенеза (Bigsby et al., 1999; Thomson, 2001). Кроме того, исследования in vitro проведенные на крысах показали, что добавление андрогенов вызывает начало формирования простаты даже у самок (Takcda et al., 1986). Таким образом, роль андрогенов, главным образом, 5-альфа- дигидротестостерона, в формировании и развитии простаты в онтогенезе вполне доказана. Более того, мужские гормоны необходимы и для поддержания секреторной активности и цитоархитектоники простаты и у взрослых животных, при прекращении действия андрогенов, активируются процессы апоптоза в этой железе, и простата подвергается регрессии (Isaacs et al., 1994).
Было сделано следующее наблюдение. Если плод мужского пола находится между двумя плодами женского пола (так называемые 2F плоды) и, соответственно, подвергается во время пренатального онтогенеза дополнительной эстрогениза-ции по сравнению с плодами, у которых непосредственные соседи в матке - мужские плоды (2 М позиция), то у первых, во взрослом состоянии простата увеличена по сравнению со вторыми (Vom Saal et al., 1989). Это связали с тем обстоятельством, что 2F плоды подвергаются примерно на 35% более высокой концентрации эстрадиола. Последующие эксперименты подтвердили и более точно охарактеризовали модулирующую роль эстрогенов в развитии предстательной железы. Вживление имплантов, выделяющих эстрадиол, беременным самкам мышей позволило
установить, что увеличение уровня эстрадиола на 50% приводило к увеличению веса простаты во взрослом состоянии на 30% (за счет гиперплазии), при этом число андрогеновых рецепторов также было увеличено вдвое по сравнению с контролем (Vom Saal et al., 1997). Позже было показано, что ксеноэстроген метоксихлор, при скармливании мышам во время беременности (с 11 по 17 день ), приводил к сходным последствиям у потомков мужского пола: увеличению веса простаты и семенных пузырьков (Welshons et al., 1999). Однако если содержание эстрадиола увеличивали не на 50 % , а в разы (от 2 до 8 раз), то вес простаты у взрослых потомков мужского пола был, наоборот, существенно меньше, чем у контрольных животных (Vom Saal et al., 1997).
Семенные пузырьки являются важной железой мужской половой системы, а их секрет является важной составной частью спермы. Название имеет исторические корни, так как ранее полагали, что семенные пузырьки являются местом хранения семени. Впоследствии эта гипотеза не подтвердилась, однако у некоторых животных, например, у хряков, в семенных пузырьках формируется основная фракция жидкой части спермы (Cupps, 1991), хотя у кобелей семенные пузырьки вообще отсутствуют (Christiansen, 1984). У самцов мышей семенные пузырьки четко идентифицируются и легко выделяются так как являются отдельно расположенной железой, и, кроме всего прочего отличающейся цветом от остальных (имеет характерный белесый цвет).
Семенные пузырьки, эпидидимис (придаток семенника) и семявыносящие протоки имеют мезодермальное происхождение и являются производными Воль-фового протока. Однако развитие семенных пузурьков, как и развитие предстательной железы, зависимо от андрогенов (Thompson, 2001). Кроме того, на морских свинках показано, что и функциональная активность секреторного эпителия семенных пузырьков зависит от андрогенов, что, однако модулируется эстрадио-лом или диэтилстильбестролом (Burns et al., 1979). В работе на крысах показано, что воздействие в раннем постнатальном онтогенезе такими эстрогенами, как ди-этилстильбэстрол (ДЭС) и этинилэстрадиол (ЭЭ), изменяет соотношение стромы и эпителия в семенных пузырьках, а также изменяет соотношение андрогенных и эс-трогенных рецепторов в этой железе (Williams et al., 2001). У мышей воздействие ксеноэстрогеном метоксихлором в определенных дозах в ходе пренатального онтогенеза, (в период органогенеза), приводило к увеличению веса семенных пузырьков (Welshons et al., 1999).
Трансплантация эмбрионов и базирующиеся на ней технологии в сельскохозяйственной биотехнологии
Трансплантация эмбрионов - это процесс, в результате которого эмбрионы вымывают из репродуктивных путей животных-доноров, находящихся на ранних стадиях беременности, а затем пересаживают в яйцеводы или матку других самок (реципиентов эмбрионов), эстральный цикл которых, как правило, синхронизирован с донорами.
Впервые успешная трансплантация эмбрионов была осуществлена на кроликах (Heap, 1891), но прошло более 40 лет, прежде чем эта методика была применена к другим лабораторным животным, а именно - крысам (Nicholas, 1933) и мышам (Fekete, Little, 1942). Примерно в то же самое время метод трансплантации эмбрионов уже начали применять в сельском хозяйстве. Были осуществлены первые успешные трансплантации эмбрионов на овцах (Warwick, Berry, 1949), козах (Warwick et al., 1934; Warwick, Berry, 1949), крупном рогатом скоте (Umbaugh, 1951) и лошадях (Oguri, Tsutsumi, 1974). Чуть позже были совершены первые трансплантации эмбрионов на хорьках (Chang, 1968), кошках (Schriver, Kraemer, 1978) и собаках (Kinney et al., 1979). Более подробный обзор истории развития метода трансплантации эмбрионов можно найти в обзорной статье Betteridge (1981).
В настоящее время этот подход широко применяют как с исследовательскими, так и с практическими целями (в частности, в сельском хозяйстве и в медицине, а также для сохранения видов и пород животных). Трансплантацию эмбрионов, как правило, используют в сочетании с другими методами, такими, как суперовуляция, криоконсервация эмбрионов, клонирование, экстракорпоральное оплодотворение и другие. Так, например, в животноводстве получила развитие программа МОЭТ -множественная овуляция и эмбриотрансплантация. По мировым данным, 80 % всех эмбрионов крупного рогатого скота используются именно в этой программе (Galli et al., 2003). Альтернативой получению зародышей in vivo (программа МОЭТ) является экстракорпоральное оплодотворение (in vitro). Программа IVF (in vitro fertilization), известная в отечественной литературе, как программа экстракорпорального оплодотворения, получила большое распространение в медицине для преодоления женского и мужского бесплодия (Winston, Handiside, 1993; Hardy et al., 2002), но также получает все больше сторонников и в животноводстве. В некоторых ситуациях, как, например, в современных стратегиях сохранения исчезающих видов животных, акцент делается на криоконсервации эмбрионов и гамет, а трансплантация эмбрионов рассматривается как необходимый, но все же вспомогательный метод (Wild et al., 1992; Jalkanen, 1993; Amstislavsky et al., 2000). При этом принимается во внимание не только внутривидовая, но и межвидовая трансплантация (Amstislavsky et al., 2004). Подобным же образом, при сохранении генетических коллекций лабораторных мышей и крыс в виде криобанков эмбрионов, трансплантация также рассматривается как вспомогательный метод (Mobraaten, 1986), а основной упор делается на их криоконсервацию. В настоящее время, после рождения знаменитой овцы Долли- первого клонированного млекопитающего (Wilmut et al., 1997), клонирование становится все более популярным занятием. Однако не следует забывать, что как в этой, ставшей классической работе Wilmut et al. (1997), так и во всех других работах по клонированию млекопитающих, трансплантация эмбрионов является важнейшим элементом. Кроме всех перечисленных практических аспектов применения метода трансплантации эмбрионов, существует еще один немаловажный аспект: трансплантация эмбрионов - это научный метод, позволяющий на самых ранних этапах вырвать развивающийся организм из привычного контекста развития, воздействовать на него (или не воздействовать), а затем трансплантировать в иную материнскую среду. Напомним, что Walter Heap в своей основополагающей работе, в которой он, впервые в мировой практике, применил метод трансплантации эмбрионов (Heap, 1891), ставил именно исследовательские, а не практические цели.
В качестве примера удачного применения метода трансплантации эмбрионов для решения фундаментальных вопросов биологической науки можно привести цикл работ проводимый В.И.Евсиковым в сотрудничестве с Т.Д. Осетровой, Л.А. Герлинской, М.П. Мошкиным, Л.М. Морозовой и другими представителями этой школы (Евсиков, Морозова, 1997; 1998; Евсиков и др., 1991;1998; Evsikov et al., 2000; Gerlinskaya, Evsikov, 2001). Изначально был отмечен эффект гетерозиса у потомства в том случае, если самки мышей линии BALB/c вынашивают и воспитывают межлинейных гибридов между мышами линий C57BL/6 и BALB/c (по Евсиков и др., 1998). Для того, чтобы понять причину и механизмы этого явления были предприняты эксперименты по перекрестному воспитанию и по трансплантации эмбрионов. Эти эксперименты не только решили поставленную задачу, но и выявили новый интересный феномен. Оказалось, что если реципиентами эмбрионов служат антигенно чужеродные матери, в некоторых случаях имеет место существенное увеличение массы тела потомков (Евсиков, Морозова, 1977; 1978).
Т.о. в случае аллогенных трансплантаций эмбрионов наблюдали эффект гетерозиса, причем уже в ходе пренатального развития. В дальнейшем выяснилось, что одним из важных механизмов, лежащих в основе этого явления, является уси ление продукции прогестерона в организме самок во время периимплантационпого периода (т.е. в период имплантации и сразу после него) при аллогенных трансплантациях эмбрионов, когда мать и плод антигенно отличны друг от друга (Евси-ков и др., 1991; 1998; Gerlinskaya, Evsikov, 2001). Оказалось, что мышата родившиеся в результате аллогенных трансплантаций сопровождаемых повышением уровня прогестерона не только быстрее развиваются, но и более адекватно реагируют в стрессовых ситуациях (Gerlinskaya, Evsikov, 2001). Более того, иммунизация путем введения чужеродных антигенов во время ранней беременности аналогичным образом влияет на потомство (Evsikov et al., 2000). Таким образом, сочетание метода трансплантации эмбрионов с другими подходами позволило решить важные вопросы генетико-физиологических взаимоотношений мать-плод.
Существует три принципиальных подхода к получению (вымыванию) зародышей млекопитающих. Первый подход, схематично представленный на Рис. 5А (а) заключается в вымывании зародышей из репродуктивных путей post mortem при забое животных. Этот способ позволяет легко получить зародыши из матки и яйцеводов, но при этом само животное не сохраняется. Именно так обычно вымывают зародыши у мелких лабораторных животных, таких, как мыши или крысы, поскольку другие подходы на этих мелких животных весьма трудоемки и не столь надежны. Разновидностью этого подхода является способ, когда жизнь животного донора сохраняется, но репродуктивные пути (матка и яйцеводы) удаляются, то есть воспроизводительная функция утрачивается.
Второй подход, схематично представленный на рис. 5А (б), заключается в том, что матку или яйцевод (или яйцевод и матку), промывают, вводя среду через систему трубок в яйцевод/ матку и принимая эту среду в приемную трубку после прохождения ею репродуктивных путей. Данный подход применяют на достаточно крупных животных, таких, как овцы, козы, олени и др. Имеется множество разновидностей данного подхода, адаптированных к тем или иным видам млекопитающих, в частности, различаются способы хирургического доступа к рогам матки/ яйцеводам, оборудование, применяемое для промывания репродуктивных путей, методы наркотизации и т.д.
Методы получения/трансплантации/криоконсервации эмбрионов
Замораживание зародышей осуществляли при помощи программного замо-раживателя на основе "стандартного метода программного замораживания" (Wil-ladsen, 1977; Leibo, Songassen, 2002). В процессе замораживания и криоконсерва-ции эмбрионы находились в пластиковых соломинах 0,25 мл (IMV, France). Этот базовый подход был применен в двух разных модификациях. Замораживание зародышей мышей и крыс и первые эксперименты по замораживанию эмбрионов куни-цеобразных (хорьки) осуществляли при помощи метода 1. В этом случае в качестве криопротектора использовали раствор ДМСО. Уравновешивание (эквилибра-цию) производили при + 4 С до достижения конечной концентрации 1,5 М. Затем соломины с зародышами охлаждали на программном замораживателе производства СКТБ Института Криобиологии и Криомедицины (Харьков, Украина) со скоростью 0,5С/ мин до температуры минус 6С, термостатированием в течение 10 минут при этой температуре, сидингом (принудительной кристаллизацией) и дальнейшим охлаждением со скоростью 0,3С/мин до температуры минус 40 С, после чего быстро переносили соломины с эмбрионами в жидкий азот (-196С). Размораживали эмбрионы в водяной бане при + 38С и производили отмывку от криопротектора при комнатной температуре.
Успешное замораживание эмбрионов куницеобразных было осуществлено при помощи метода 2. В этом случае охлаждение зародышей осуществляли при помощи программного замораживателя (Freeze Control CL856, Biogenics, Napa, CA, USA) и этиленгликоля (ЭГ, 1,5 M) в качестве криопротектора.
Эмбрионы, предназначенные для заморозки, отмывались в среде Emcare (ЕСНМ-100, Immuno-Chemicals Ltd.) и переносились в ту же самую среду, но с добавлением этиленгликоля в концентрации 1,5 моля (Emcare, ECEG-100, Immuno-Chemicals Ltd.). После эквилибрации в течение 15 минут, эмбрионы помещали в пластиковые соломины 0,25 мл (IMV, L Aigle, Франция) в той же самой среде. Соломины закрывали пластиковыми пробками и помещали в программный замораживатель (Freeze Control CL856, Biogenics, Napa, CA, USA). Число эмбрионов помещаемых в одіту соломину было в пределах 1-11.
Охлаждение эмбрионов от +15 до -6 С осуществляли со скоростью 3,0 С/мин. При -6 С производили термостатирование в течение 10 , во время которого осуществляли сидинг (инициацию кристаллизации) прикосновением охлажденным в жидком азоте пинцетом к стенкам соломины. После этого эмбрионы продолжали охлаждать, но уже со скоростью 0,3 С/ до -32 С, после чего погружали соломины с эмбрионами в жидкий азот.
Размораживание зародышей. После хранения в сосуде с жидким азотом соломины размораживали и выдавливали содержимое пайеты в чашку Петри, производили быстро: либо путем активного разогревания вытащенной из азота соломины с эмбрионами выдыхаемым воздухом, либо помещая их на 10 мин в воду с температурой + 38 С. В некоторых случаях зародыши сразу же трансплантировали самкам-реципиентам. В других случаях их подвергали обратной проводке - отмывке от крио-протектора. Для этого их переносили в 0, 5 М раствор сахарозы приготовленный на основе среды Emcare1M (ЕСНМ-100, Immuno-Chemicals Ltd.) на 6-7 минут, а затем переносили в эту же среду, но без сахарозы.
Трансплантацию зародышей (как куницеобразных, так и крыс) осуществляли всегда в рог матки самки-реципиента. При этом оперативно осуществляли доступ к рогу матки через небольшой разрез и прокалывали матку заостренным стеклянным капилляром, содержащим зародыши в небольшом количестве той же среды (Рис.6). Капилляр был соединен трубкой с мундштуком; при помощи этой системы производилось медленное выдавливание зародышей в просвет матки.
У куницеобразных реципиентами служили псевдобеременные самки (псевдобеременность вызывали спариванием этих самок со стерильными самцами; наличие псевдобеременности определяли по влагалищным мазкам). У крыс трансплантацию осуществляли беременным самкам, при этом собственное потомство отличалось от потомков-трансплантантов окраской меха.
Технически во всех случаях эмбрионы трансплантировали в матку наиболее универсальным способом, а именно - через прокол стенки матки, как схематично показано на Рис 5Б(б) главы 1 (Обзора литературы). Оперативная техника подхода к рогу матки в случае куницеобразных (в качестве реципиентов использовали либо хорьков либо хонориков/нохориков) была точно такая же, как описано для доноров эмбрионов. После того как был найден яичник, в жировой комок над яичником вводили
нитку и приподнимали за эту нитку данную половину репродуктивного тракта, таким образом, чтобы яичник, яйцевод и кончик рога матки были выше раневой поверхности. Придерживая одной рукой за эту нитку, другой рукой в матку вводили стерильный стеклянный капилляр (прокалывая стенку матки), содержащий эмбрионы в небольшом количестве среды. Этот капилляр предварительно заострялся, причем он был по диаметру подобран по размеру эмбрионов. Капилляр был соединен трубкой с мудтштуком, через который производилось (очень медленно и осторожно) выдувание содержимого этого капилляра в матку. Эту очень деликатную операцию выдувания необходимо производить, следя за мениском жидкости в капилляре таким образом, что по мере выхода жидкости с эмбрионами в просвет рога матки, капилляр осторожно вынимается из матки. При этом, в подавляющем большинстве случаев, удавалось ввести все эмбрионы с минимальным количеством среды в матку и избежать попадания туда воздуха, как рекомендовано соответствующим руководством (Hogan et al., 1986). Во всех случаях эмбрионы вводили лишь в один рог матки и, соответственно, разрез делали лишь на одном бок.
Особенности проведения трансплантации эмбрионов на куницеобразных.
Для определения эструса у самок-доноров и самок-реципиентов состояние их половых органов инспектировали во время гона, причем начинали за несколько недель до ожидаемого срока начала гона. Период проэструса характеризовался набуханием половой кожи вокруг влагалища. Однако мы не полагались исключительно на этот звероводческий коррелятивный признак состояния проэструса/эструса, а более полагались на содержимое влагалищных мазков. Метод влагалищных мазков достаточно известен, применительно к куницеобразным этот метод описан в монографии Терновского и Терновской (1994).
Самок считали эстральными, когда влагалищные мазки содержали, главным образом, лишь эстральные чешуйки, а другие клеточные типы практически отсутствовали. Эстральных самок-доноров спаривали с самцами того же вида. Эстральных самок-реципиентов спаривали со стерильными самцами. Стерильных самцов либо готовили хирургически (путем двусторонней перевязки и удаления части vas defferens), либо использовали для этих целей генетически стерильных гибридных самцов (Amstislavsky et al., 2000).
В основных своих чертах трансплантация эмбрионов от европейской норки соответствовала трансплантации эмбрионов у хорька. Основным отличием было использование хонориков и нохориков При этом показано, что самки хонорика фертильны, а самцы хонорика стерильны (Терновский, Терновская, 1994). Поскольку это идеальная ситуация для трансплантации эмбрионов, мы использовали самок хонорика в качестве реципиентов эмбрионов, а самцов хонорика (наряду с хирургически стерилизованными самцами хорька) в качестве стерильных самцов для спаривания с этими самками и вызывания у них псевдобеременности (см. также Amstislavsky et al., 2000). Наряду с самками хонорика, в качестве реципиентов мы использовали самок нохорика.
Так же, как и в экспериментах по внутривидовой трансплантации эмбрионов у хорька, в этих экспериментах по трансплантации эмбрионов европейской норки хонорикам и нохорикам, реципиент либо имел стадию беременности на одни сутки более раннюю, чем имел соответствующий донор (то есть стерильное спаривание реципиента производили на одни сутки позже, чем фертильное спаривание донора), либо стадия беременности донора и стадия псевдобеременности реципиентов были полностью синхронны.
Сравнительное изучение преимплантационного развития эмбрионов куницеобразиых: европейская норка, черный хорек и горностай
Европейская норка - преимплантационное развитие без диапаузы Овуляция у европейской норки провоцируется спариванием с самцом. В первый день после спаривания в яичниках были обнаружены преовуляторные фолликулы, однако в яйцеводах и матке - лишь сперматозоиды. На второй день после спаривания в яичниках имеются желтые тела, а в яйцеводах - овулировавшие яйцеклетки и двухклеточные зародыши. Дробление эмбрионов продолжается до 6-го дня, когда зародыши мигрируют в матку, будучи на стадии морулы/ранней бластоцисты. Начиная с 7-го дня бластоциста быстро увеличивается в размерах, а на 10/11-й дни заметны процессы дифференцировки в ВКМ, причем к этому сроку бластоциста достигает 1,5 мм в диаметре (Рис.7,8). По нашим наблюдениям, имплантация у европейской норки происходит на 12-й день развития. Эксперименты подтвердили предположение об отсутствии диапаузы у этого вида куницеобразных.
Среди куницеобразных существует достаточно большое число видов для которых характерна облигатная диапауза (Mead, 1989; Терновский, Терновская, 1994; Renfree, Shaw, 2000). Для характеристики преимплантационного развития у этой группы куницеобразных был изучен горностай (Mustela erminea). Ранее было показано, что для горностая характерно оплодотворение юных самок взрослыми самцами, начиная с периода вскармливания (Терновский, 1983; King, 1990; Терновский, Терновская, 1994). Эксперимент по изучению преимплантационного развития был проведен именно на таких беременных самках спаренных в юном возрасте (Табл. 6, Рис. 9).
После попадания в матку зародыши не имплантировались в течение 8-9 мес. (диапауза). Во время диапаузы зародыши горностая увеличиваются в диаметре примерно в 10 раз. Диаметр семи овулировавших яйцеклеток, извлеченных из яйцевода горностая на 3-й день после копуляции, составил 137 +16 мкм. Перед имплантацией диаметр зародышей был существенно больше. Средний диаметр шести бластоцист, извлеченных на 251-й день после спаривания с самцом, составил 981+45 мкм. В возрасте три месяца было замечено, что зародыши уже не шарообразны, а принимают яйцевидную форму. На рисунке 9 показан больший и меньший диаметры зародышей.
Имплантация была нами зафиксирована у двух самок горностая. Это событие происходило в начале апреля. В конце периода эмбриональной диапаузы, в условиях Сибири это наблюдается в начале апреля, наблюдаются первые признаки линьки самок горностая. На белом мехе появляются темные пятна. По нашим наблюдениям, это является индикатором имплантации зародышей. Наши экспериментальные наблюдения согласуются с гипотезой Д.В. Терновского, который впервые предположил, что имплантация у горностая соответствует по срокам началу линьки. Две беременные самки были исследованы 6 апреля, когда у них появились темные пятна на шкурке. У этих самок (270 и 272 день после спаривания) наблюдались места имплантации в матке. Другая беременная самка горностая была исследована 2 апреля на 234 день после спаривания. На рисунке 9 представлена фотография бластоциста именно этой самки горностая. Зародыши находились на стадии активации, которая предшествует их имплантации. О том, что зародыши вступили в стадию активации, свидетельствовало, в частности, начало процесса дифференци-ровки в ВКМ бластоциста, что является признаком активации у куницеобразиых (Enders et al., 1986). Первые признаки линьки появились у этой самки через 5 дней после операции. Через 27 дней после начала линьки эта самка принесла потомство.
С целью исследования темпов развития зародышей черного хорька и характеристик их миграции из яйцеводов в матку было исследовано содержимое репродуктивных путей с 3-го по 10-й день беременности (Табл.7). Эти эксперименты показали, что до 5-го дня развития в репродуктивных путях у хорька преобладают дробящиеся зародыши, которые находятся в яйцеводах. На 6-й день развития большинство зародышей хорька достигает стадии морулы. В этот день происходит активная миграция зародышей из яйцеводов в матку, где обнаруживается уже 77% зародышей. На 7-й день развития большая часть зародышей хорька уже достигает стадии бластоциста, зародыши находятся главным образом в матке. На 8-й день развития подавляющее большинство зародышей уже мигрирует в матку (96%), ос-новнной стадией развития в этот день является стадия бластоциста. На 10-й день развития все без исключения зародыши уже находятся в матке и исключительно на стадии бластоциста. Дополнительные эксперименты показали, что имплантация у хорька происходит на 12-й день после спаривания.
Наши данные позволяют сделать заключение о том, что динамика развития зародышей у европейской норки, сроки овуляции, перехода зародышей в матку и имплантации совпадают, в целом, с таковыми у хорька, преимплантациониое развитие которого достаточно хорошо изучено (Robinson, 1918; Hamilton, 1934; Lindeberg, 2003).
Ниже приведена сводка основных репродуктивных характеристик черного хорька и европейской норки составленная на основе собственных наблюдений и данных литературы (Табл. 8). Это сравнение свидетельствует о репродуктивном сходстве этих видов куницеобразных, что позволило использовать хорька для отработки эм-бриотехнологий, направленных на европейскую норку, а также применять межвидовых гибридов хорька и норки (хонориков и нохориков) в качестве реципиентов при трансплантации эмбрионов норки.
