Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1. Основные понятия и термины, используемые при описании морфологии лобозных амеб 8
2. Морфология, биология и систематика рода Cochliopodium Hertwig et Lesser, 1874.$enswKudryavtsev, 1999 11
2.1 Строение клетки представителей рода Cochliopodium 11
2.1.1 Особенности светооптической морфологии клетки представителей рода Cochliopodium 11
2.1.2 Особенности ультраструктуры представителей рода Cochliopodium 18
2.2 Некоторые особенности биологии представителей рода Cochliopodium 22
2.2.1 Питание 22
2.2.2 Строение цисты, эксцистирование и формирование тектума 23
2.3 Диагноз и систематический состав рода Cochliopodium 27
2.3.1 Диагноз рода Cochliopodium и история его изменения.27
2.3.2 Систематический состав рода Cochliopodium 34
3. Особенности морфологии, биологии и систематики рода Gocevia Valkanov, 1932 sensuPage, 1987 36
3.1 Строение клетки представителей рода Gocevia 36
3.1.1 Особенности светооптической морфологии представителей рода Gocevia 36
3.1.2 Особенности ультраструктуры представителей рода Gocevia 39
3.2 Некоторые особенности биологии представителей рода Gocevia . 42
3.2.1 Питание 42
3.2.2 Размножение 42
3.2.3 Строение цисты и инцистирование.. 43
3.3 Систематика рода Gocevia 45
3.3.1 Диагноз рода Gocevia и история его изменений 45
3.3.2 Систематический состав рода Gocevia 46
4. Особенности морфологии, биологии и систематики рода Paragocevia Page, 1987 47
4.1 Светооптические особенности строения клетки и некоторые особенности биологии представителей рода Paragocevia 47
4.2 Ультраструктура представителей рода Paragocevia 51
4.3 Систематика рода Paragocevia v 52
5. Морфология, ультраструктура и систематика рода Ovalopodium Sawyer, 1980; 53
5.1 Особенности морфологии представителей рода Ovalopodium 54
5.2 Систематика рода Ovalopodium 55
6. Систематическое положение отряда Himatismenida 56
Глава 2. Обсуждение литературных данных.. 64
1. Биоразнообразие отряда Himatismenida 64
2. Проблематичность нынешнего систематического положения отряда Himatismenida 66
3. Проблема филогенетической целостности отряда Himatismenida 68
4. Использование различных признаков для реконструкции филогенетических взаимоотношений отряда Himatismenida 69
Цель и задачи работы 73
Глава 3. Материал и методы 74
1. Штаммы амеб 74
2. Светооптические исследования амеб 78
3. Электронномикроскопические наблюдения амеб. 79
4. Секвенирование последовательностей гена малой субъединицы рибосомальной РНК.. 80
Глава 4. Результаты и обсуждение 85
1. Описания изученных видов и обсуждение их идентификации 85
1.1Cochliopodium bilimbosum (Auerbach, 1856) Leidy, 1879 85
1.2 Cochliopodium actinophorum (Auerbach, 1856) Page, 1976 89
1.3 Cochliopodium barki Kudryavtsev, Brown et Smirnov, 2004 96
1.4 Cochliopodium digitatum (Greeff, 1866)Penard, 1902 102
1.5 Cochliopodium gulosum Schaeffer, 1926 sensu Kudryavtsev, 2000 109
1.6 Cochliopodium larifeili Kudryavtsev, 1999 113
1.7 Cochliopodium minus Page, 1976 (штаммы CCAP 1537/1A H4/lAb/6D) 118
1.8 Cochliopodium spiniferum Kudryavtsev, 2004 124
1.9 Cochliopodium vestitum (Archer, 1871) Archer, 1877 1 1.10 Cochliopodium sp. 1 137
1.11 Cochliopodium sp. 2 142
1.12 Cochliopodium sp. 3 147
1.13 Cochliopodium sp. 4 152
1.14 "Gocevia ponticcT Valkanov, 1932 156
1.15 "Himatismemda f. g. sp." 162
2. Особенности морфологии и биологии различных групп химатисменид 166
2.1 ЦОМТ представителей рода Cochliopodium.. 166
2.2 Движение химатисменид 168
2.3 Питание представителей рода Cochliopodium 170
2.4 Деление клетки представителей рода Cochliopodium 170
3. Реконструкция филогении рода Cochliopodium на основании последовательностей 18SpPHK 174
3.1 Последовательности 18SpPHK представителей рода Cochliopodium 174
3.2 Филогенетический анализ и построение филогенетического древа 176
4. Ревизия систематического состава родов отряда Himatismemda 182
4.1 Von. Cochliopodium 183
4.1.1 Попытка ревизии видового состава рода 183
4.1.2 Морфологическое разнообразие и филогения в пределах рода Cochliopodium 2
4.2 Род Gocevia. Попытка ревизии видового состава 212
4.3 Систематический состав рода Paragocevia 214
4.4 Систематический состав и валидность рода Ovalopodium 214
5. Систематическое положение и филогения отряда Himatismemda 215
5.1 Отряд Himatismenida — раковинные лобозные амебы? 216
5.2 Отряд Himatismenida— монофилетический таксон? 224
5.3 Систематическое положение и возможные филогенетические связи рода Cochliopodium 227
5.4 Систематическое положение и возможные филогенетические связи рода Gocevia Valkanov, 1932 sensu Page, 1987 233
5.5 Систематическое положение и возможные филогенетические связи рода Paragocevia 235
Выводы 237
Вместо послесловия 238
Благодарности 239
Список литературы 241
- Особенности светооптической морфологии клетки представителей рода Cochliopodium
- Некоторые особенности биологии представителей рода Gocevia
- Использование различных признаков для реконструкции филогенетических взаимоотношений отряда Himatismenida
- Реконструкция филогении рода Cochliopodium на основании последовательностей 18SpPHK
Введение к работе
Отряд Himatismenida создал в 1987 году Пэйдж (Page, 1987) в составе подкласса Testacealobosia De Saedeleer, 1934 класса Lobosea Carpenter, 1861, включив в него семейство Cochliopodiidae De Saedeleer, 1934, объединяющее четыре рода амебоидных протестов — Cochliopodium Hertwig et Lesser, 1874, Gocevia Valkanov, 1932, Paragocevia Page, 1987 и Ovalopodium Sawyer, 1980.
Основным диагностическим признаком химатисменид является наличие у этих амеб гибкого прозрачного клеточного покрова, накрывающего клетку только с дорзальной стороны. У представителей рэпа. Cochliopodium этот клеточный покров представляет собой слой полисахаридных чешуек на поверхности плазматической мембраны и называется "текгум". Амебы родов Gocevia и Paragocevia несут фиброзный клеточный покров, который в современной литературе обозначается как "кутикула". Род Ovalopodium с этой точки зрения до сих пор изучен недостаточно.
Первая находка представителей этого отряда была сделана почти 150 лет назад (Auerbach, 1856). Впоследствии с химатисменидами сталкивалось довольно значительное число исследователей, особенно в ХГХ-первой половине XX века (например, Archer, 1871, 1877; Leidy, 1879; Penard, 1902; Cash, Hopkinson, 1909; Schaeffer, 1926; De Saedeleer, 1934; Valkanov, 1936; Pussard, 1965; Bark, 1973; Pussard et al., 1977; Page, Willumsen, 1980; Sawyer, 1980; Dykova et al., 1998; Kudryavtsev, 1999a, 1999b, 2000). Химатисмениды чрезвычайно широко распространены в природе и изолированы из самых разных местообитаний. Тем не менее, наши современные знания о биоразнообразии отряда Himatismenida далеки от полноты, а вопрос о создании системы этого отряда, которая отражала бы его филогенетические взаимоотношения с другими протистами, никогда серьезно не поднимался в литературе.
В состав родов, объединенных в отряд Himatismenida, разные авторы включали 26 видов и несколько неидентифицированных до вида изолятов, обладающих характерными признаками этих родов. Самым надежным критерием родовой принадлежности вида в пределах химатисменид является ультраструктура клеточного покрова. Для идентификации видов рода Cochliopodium ключевую роль играет строение чешуек тектума. Вместе с тем, на сегодняшний день известна ультраструктура лишь шести видов, относящихся к этому отряду. Большая же часть видов изучена только на светооптическом уровне
и не реизолировалась с момента первоописания. Ультраструктура клеточного покрова амеб этих видов неизвестна, поэтому их систематическое положение и, в ряде случаев, валидность являются спорными.
Анализ морфологических и ультраструктурных признаков химатисменид заставляет поставить под сомнение филогенетическую целостность этого таксона. По сути, единственным объединяющим признаком химатисменид является наличие толстого клеточного покрова, который не одевает клетку целиком, а покрывает только ее дорзальную поверхность. При этом разные роды, входящие в состав этого отряда, четко отличаются друг от друга особенностями морфологии и ультраструктуры, и никаких "переходных форм" между ними не известно. Поэтому отряд Himatismenida в настоящее время слабо обоснован и может оказаться полифилетической группой.
Положение химатисменид в системе амебоидных протистов также является предметом дискуссии. До 2002 года отряд Himatismenida входил в состав подкласса Testacealobosia, в рамках традиционного разделения лобозей на "голые" и "раковинные" формы. Однако в современных системах амебоидных организмов такое положение этого отряда сохранялось скорее "по инерции", будучи слабо подкрепленным нашими знаниями о морфологии и биологии этих амеб. В 2002 году Роджерсон и Паттерсон (Rogerson, Patterson, 2002) включили химатисменид в состав голых лобозных амеб в качестве таксона неясного систематического положения, фактически, признав то, что наших знаний об этой группе на сегодняшний день не хватает для серьезного анализа ее филогенетических связей с другими таксонами протистов.
В предлагаемой вниманию читателя работе, написанной по результатам 8 лет изучения этой группы амебоидных организмов, мы попытаемся ликвидировать этот пробел. На основании анализа литературных данных и результатов собственных исследований различных представителей химатисменид мы предложим вариант ревизии систематического состава этой группы. Кроме того, мы попробуем проанализировать филогенетические взаимоотношения в пределах химатисменид и вероятные филогенетические связи представителей этого отряда с другими группами протистов.
Особенности светооптической морфологии клетки представителей рода Cochliopodium
Род Cochliopodium был установлен Гертвигом и Лессером в 1874 году (Hertwig, Lesser, 1874), однако первые его представители были описаны раньше — Cochliopodium actinophorum и С. bilimbosum — Ауэрбахом в 1856 году (Auerbach, 1856, как Amoeba actinophora и A. bilimbosa, соответственно), С. digitatum — Греефом в 1866 году (Greeff, 1866, как Amphizonella digitata), и С. vestitum Арчером в 1871 году (Archer, 1871, как Amphizonella vestita). Впоследствии все эти
виды вошли в состав рода Cochliopodium.
Все перечисленные авторы уже отмечали наличие на поверхности изученных ими амеб светооптически заметного покрова. Ауэрбах (Auerbach, 1856) заметил, что изученные им амебы имеют наружный покров в виде довольно гибкой "бесструктурной" мембраны, в которую они, как он полагал, полностью заключены. При этом на его рисунках амеб вида "Amoeba actinophora" явно изображена структура этой мембраны при наблюдении "сверху" — характерная для тектума регулярная пунктуация гиалиновой каймы адгезировавшейся к субстрату амебы. Представители другого вида — "Amoeba bilimbosa" — изображены с пучком гиалиновых цитоплазматических выростов, не покрытых мембраной. Однако Ауэрбах придавал обнаруженному им покрову лишь значение видового признака и не считал необходимым выделить новый надвидовой таксон.
Грееф (Greeff, 1866) обнаружил похожую на описанную Ауэрбахом оболочку у представителей изученных им видов амеб, которые на основании этого признака были объединены им в род Amphizonella Greeff 1866. Описание и рисунки, выполненные этим автором, согласуются друг с другом и позволяют заключить, что, в отличие от Ауэрбаха, он действительно видел эту оболочку как "бесструктурную" и четко проследил формирование не покрытых оболочкой цитоплазматических выростов на различных участках поверхности клетки. Впоследствии взгляды Греефа были критически проанализированы Пенаром (Penard, 1902). Он показал, что из описанных Греефом трех видов два имеют специализированное отверстие в оболочке для образования псевдоподий, не наблюдавшееся немецким автором, а третий вид — Amphizonella digitata Greeff, 1866 — действительно способен образовывать
,ж отдельные цитоплазматические выросты, не покрытые оболочкой, в любом месте
поверхности клетки или через "единое широкое отверстие с неразличимыми контурами" (Penard, 1902, стр. 192, перевод наш). По совокупности признаков этот вид был включен Пенаром в состав рода Cochliopodium.
Первым видом, у которого была четко описана структура оболочки на светооптическом уровне, был Cochliopodium vestitum (Archer, 1871) Archer, 1877, первоначально включенный (Archer, 1871) в состав рода Amphizonella. Оболочка этих амеб описывается Арчером как гибкая, плотно прилегающая к цитоплазме и поперечно исчерченная на "оптическом срезе". Кроме того, на ее поверхности автор наблюдал многочисленные короткие волосовидные структуры и документировал формирование не покрытых оболочкой цитоплазматических выростов. Согласно Арчеру (op. cit.), они могли образовываться "пучком" через единое отверстие в оболочке или по отдельности в любом месте поверхности клетки.
Еще Лейди (Leidy, 1879) показал, что вид Cochliopodium pellucidum, включенный Гертвигом и Лессером (op. cit.) в установленный ими род Cochliopodium, идентичен описанному ранее виду Amoeba bilimbosa sensu Auerbach, 1856. Второй вид, включенный Гертвигом и Лессером в род Cochliopodium — С. pilosum — идентичен Amphizonella vestita sensu Archer, 1871, и немецкие авторы сами же это и признают, указывая, что они просто дали виду новый эпитет, перенося в установленный ими род. Таким образом, ни одно из названий, установленных Гертвигом и Лессером (Hertwig, Lesser, 1874), не является валидным (Archer, 1877;
щ Leidy, 1879). Заслуга Гертвига и Лессера состоит в том, что они удачно объединили
эти виды в отдельный род.
Диагноз рода Cochliopodium эти авторы сформулировали следующим образом (Hertwig, Lesser, 1874, стр. 77-78, перевод наш): "амебы с гибкой раковиной, структура которой напоминает структуру раковины представителей рода Arcella, с постоянным очень эластичным устьем, через которое формируются псевдоподии.
# Цитоплазматическое тело очень сильно варьирует по форме. Ядро просто
организовано, расположено внутри раковины. Вакуоли в значительном количестве. Сократительных вакуолей 2 или больше, они располагаются непосредственно под раковиной. Псевдоподии гиалиновые, конические, образуются через устье раковины в виде пучка".
Этот диагноз как бы "суммировал" уже имевшиеся на тот момент данные о строении покрова клетки представителей рода Cochliopodium. Согласно приведенному выше диагнозу, основным признаком, объединяющим род Cochliopodium, является наличие гибкой раковины, имеющей ячеистую структуру наподобие раковины представителей рода Arcella. Однако уже Арчер (Archer, 1877) отмечает, что, возможно, этот диагноз является неполным, так как в нем ничего не говорится о возможности формирования псевдоподий "сквозь" стенку раковины. Это было четко показано им самим (Archer, 1877) у вида С. vestitum. Кроме того, он считает, что Гертвиг и Лессер, судя по их рисункам, тоже очень редко это наблюдали.
Некоторые авторы (например, Korotneff, 1879) приняли указанный диагноз, однако большинство предпочитало формулировать собственный "диагноз" рода Cochliopodium, изучая различных его представителей. Обычно при этом предлагаемые варианты частично соответствуют более ранним диагнозам и содержат более или менее существенные дополнения.
Так, например, Лейди (Leidy, 1879), говоря о "гибкой раковине", указывает, что она "хитиноидная", с очень широким устьем, плотно прилегает к поверхности
клетки и может иметь ячеистую структуру, подобно раковине представителей рода Arcella. Но кроме этого он впервые отмечает характерную пунктуацию поверхности "раковины" и говорит о том, что она может быть "чешуйчатой". Ничего не говорится о возможности формирования псевдоподий "сквозь" стенку раковины. Несколько иной набор признаков, характеризующих род Cochliopodium, был указан в диагнозе, составленном Пенаром (Penard, 1902). Этот диагноз звучит следующим образом: "Род Cochliopodium близок к роду Corycia, благодаря наличию гибкой мембраны. Но этот покров подвержен гораздо большим деформациям, он окружает тело и повторяет все его изменения, иногда образуя трубки вокруг основания псевдоподий. Он выглядит не как хитиноидная, а как протоплазматическая, в высшей степени пластичная оболочка. Псевдоподии обычно "зубчатые", конические или нитевидные, никогда не приобретающие форму лент, характерную для представителей рода Difflugia. Регулярная пунктуация на оболочке, напоминающая структуру раковины представителей рода Arcella, есть не всегда. Несколько видов полностью лишены пунктуации" (Penard, 1902, стр. 184, перевод наш). Таким образом, начиная с работ Пенара, можно говорить о возникновении новой трактовки клеточного покрова представителей рода Cochliopodium — как производной цитоплазмы, которая может быть лишена светооптически различимых дискретных структур.
Некоторые особенности биологии представителей рода Gocevia
Ширина боковых частей фронтальной зоны гиалоплазмы часто превышает ширину ее передней части. По краю переднего и латеральных участков гиалоплазмы в процессе быстрого, направленного перемещения амебы по субстрату постоянно образуются мелкие гиалиновые цитоплазматические выросты длиной до 10 мкм и шириной 1 мкм в количестве до полутора сотен на клетку (рис. 21). Эти выросты можно называть пальцевидными субпсевдоподиями, поскольку они, подобно субпсевдоподиям голых лобозных амеб, образуются из фронтальной зоны гиалоплазмы и имеют отчетливо закругленные концы. Однако в отличие от типичных субпсевдоподий представителей подкласса Gymnamoebia, они направлены не вперед по направлению движения, а "вниз", к субстрату, и контактируют с ним (рис. 21,2).
В процессе перемещения амебы по субстрату субпсевдоподий, образовавшиеся на переднем крае ее тела, смещаются по вентральной поверхности фронтальной зоны гиалоплазмы в направлении гранулоплазматической массы. При этом они укорачиваются, а на границе гиалоплазмы и гранулоплазмы полностью втягиваются. Гиалоплазма контактирует с субстратом только за счет этих субпсевдоподий (рис. 21, 2). Иногда две субпсевдоподии оказываются сильно сближенными друг с другом. При этом они выглядят как результат продольного расщепления одной субпсевдоподии надвое, хотя процесс расщепления субпсевдоподий не наблюдался никогда. Уроид гладкий, без каких-либо дифференцированных структур (рис. 21,7).
Ненаправленно перемещающаяся амеба обычно округлая. Ее гранулоплазматический купол полусферический, часто гораздо более высокий, чем у локомоторной формы. Гиалоплазма может практически полностью окружать этот купол в виде непрерывной уплощенной периферической каймы. Иногда при ненаправленном перемещении амеба сильно вытягивается и распластывается по субстрату, образуя на противоположных концах тела две уплощенные зоны гиалоплазмы, в течение некоторого времени двигающиеся в противоположных направлениях.
Неперемещающаяся амеба (рис. 22) полусферическая или уплощенная. Она обладает очень узкой непрерывной гиалиновой каймой, лишенной каких-либо выростов.
Флотирующая форма обычно не образуется. При искусственном отделении амебы от субстрата она приобретает сферическую форму. Кутикула при этом покрывает большую часть поверхности клетки, оставляя свободным лишь небольшой ее участок. Иногда на этом участке образуется незначительный широкий цитоплазматический вырост.
Ядро одно. Оно сферическое или яйцевидное, везикулярного типа, с крупным центральным ядрышком и отчетливо заметной оболочкой. В редких случаях ядрышковый материал состоит из 2-3 обособленных телец Иногда на окрашенных препаратах в кариоплазме видны от 1 до 4 телец около 2 мкм в диаметре. Некоторые ядра содержат около шести Фельген - позитивных телец, прилегающих к поверхности ядрышка. Митоз прослежен лишь до начала стадии метафазы и только на светооптическом уровне. В настоящее время можно лишь констатировать, что при митозе в профазе происходит полная дезинтеграция ядрышка. Гранулоплазма содержит, по меньшей мере, 5-6 сократительных вакуолей, сокращающихся независимо друг от друга, в различных участках тела. Кроме того, в гранулоплазме в большом количестве видны пищеварительные вакуоли, содержащие панцири диатомовых водорослей, нитчатые зеленые и сине - зеленые водоросли (представителей родов Anabaena и Ulothrix), и мелких инфузорий (представителей родов Colpoda и Vorticella). Часто в гранулоплазме присутствуют гранулы фотосинтетических пигментов из переваренных клеток водорослей и большое количество оптически прозрачных вакуолей. Никаких структур, напоминающих "центросферу", в гранулоплазме амеб рода Paragocevia не выявлено.
Питание осуществляется за счет фагоцитоза, который происходит только на вентральной, свободной от кутикулы поверхности клетки. При захвате нитчатых водорослей часто происходит характерный для многих протистов, питающихся этими объектами (см., например, Seravin, Goodkov, 1987; Хаусман, 1988), процесс постепенного "скручивания" нити водоросли внутри формирующейся пищеварительной вакуоли. В работе Пэйджа и Виллумсена (Page, Willumsen, 1980) приводится описание очень немногих особенностей ультраструктуры амеб рода Paragocevia. Причиной этого было то, что авторам не удалось зафиксировать амеб с приемлемым качеством до деградации и гибели культуры. В работе приведено лишь описание структуры кутикулы, строения ядра, шероховатого эндоплазматического ретикулума и пищеварительных вакуолей.
Кутикула состоит из двух четко отличающихся друг от друга слоев (рис. 23). Внутренний слой довольно плотный. Он представляет собой сеть тонких фибрилл, в основном, лежащих тангентально. Наружный слой кутикулы гораздо более рыхлый, чем внутренний. Он также имеет фибриллярное строение, но фибриллы, лежат гораздо менее упорядочено. Часто апикальная поверхность наружного слоя кутикулы "рваная". Граница между наружным и внутренним слоями кутикулы имеет вид отчетливо заметной злектронноплотной линии, которая располагается параллельно поверхности клетки, не следуя при этом всем неровностям плазматической мембраны.
Толщина кутикулы на электронограммах — 1,25-3,21 мкм. При этом толщина внутреннего слоя составляет 12-50% общей толщины кутикулы. На электронограммах видно, что кутикула очень плотно прилегает к поверхности плазматической мембраны, так что между ними не видно никаких щелей.
Кутикула состоит из кислых полисахаридов. Это было выявлено цитохимическими методами как на светооптическом уровне (окрашивание альциановым синим), так и с помощью электронной микроскопии (реакция с йодной кислотой, тиосемикарбазидом и протеинатом серебра). Попытки выявить какие -либо другие ее компоненты не предпринимались.
Ядро на электронограммах имеет неправильную форму, в целом оно более или менее овальное. Ядрышко центральное, электронноплотное, в нем часто видны "лакуны". Рядом с ядрышком часто заметны менее электронноплотные тельца диаметром около 2 мкм. Возможно, они соответствуют тельцам диаметром 2 мкм, заметным в кариоплазме на окрашенных светооптических препаратах.
Использование различных признаков для реконструкции филогенетических взаимоотношений отряда Himatismenida
В настоящее время набор формальных признаков, содержащихся в диагнозе отряда Himatismenida, достаточно четко очерчивает эту группу. Однако вопрос о том, является ли выделенный таким образом таксон филогенетически единым или представляет собой сборную группу, в пределах которой общие признаки представляют собой параллелизмы, требует специального обсуждения.
В таблице 1 суммированы основные морфологические признаки родов химатисменид, согласно современным представлениям об их организации.
Из приведенной таблицы следует, что, опять же, единственным объединяющим признаком химатисменид является наличие гибкого клеточного покрова, не одевающего клетку полностью, а накрывающего ее только с дорзальной стороны. По всем остальным признакам, включая строение этого клеточного покрова, роды химатисменид четко отличаются друг от друга, и никаких вариантов строения, которые можно было бы трактовать как "переходные" формы между родами, в пределах этой группы не встречается.
По морфологическим особенностям наиболее нетипичным среди химатисменид является род Gocevia. Кроме строения кутикулы, он отличается от других родов наличием цитоплазматического ЦОМТа и строением крист митохондрий.
Приобретение "химатисменидного" клеточного покрова, сходного с тектумом или кутикулой, могло происходить в процессе эволюции несколько раз независимо. Поэтому выделение отряда Himatismenida в качестве единой группы на данный момент можно считать удобным вариантом классификации, но остается открытым вопрос о том, насколько обоснованным, с точки зрения филогении, является отряд Himatismenida.
Из всей совокупности признаков, которые можно использовать для анализа филогенетических взаимоотношений в пределах таксона и различных групп, составляющих таксон, с другими протистами, базовыми должны бьпъ особенности морфологии и ультраструктуры клетки. В первую очередь следует охарактеризовать возможные состояния морфологических и ультраструктурных признаков в пределах отряда и сходных групп протистов, при этом для каждого таксона необходимо выявить и проанализировать наиболее полный набор признаков. Однако недостаточность только морфологических данных для реконструкции филогении амебоидных протистов неоднократно обосновывалась различными авторами (см., например, Amaral Zettler et al., 2000; Bolivar et al., 2001). Основной причиной недостаточности этих данных является принципиальная невозможность "вычленить" отдельные признаки, пригодные для эволюционных построений, из комплексов морфологических признаков, и адекватно эти признаки "взвесить".
В связи с этим особую ценность при реконструкции филогении представляют молекулярно - биологические характеристики, в частности, нуклеотидные последовательности различных генов. Секвенирование и анализ последовательностей генов уже давно стало одним из стандартных инструментов систематиков (Hillis et al., 1996). Однако в отношении химатисменид подобного рода исследования не проводились никогда, что является существенным пробелом в знаниях об этой группе. Получение таких данных дало бы дополнительные аргументы той или иной гипотезе филогении химатисменид. Начинать такую работу следует с секвенирования и анализа последовательностей гена 18S рибосомальной РНК. Для филогенетического анализа этот ген обладает рядом преимуществ, которые приведены ниже. В пределах этого гена есть как высоко консервативные, медленно
эволюционирующие, так и высоко вариабельные, быстро эволюционирующие участки. Это позволяет эффективно использовать последовательность одного и того же гена для реконструкции филогенетических взаимоотношений на самых разных таксономических уровнях — от внутривидового (Smirnov et al., 2002; Sims et al., 2002) до уровня типов и царств (Schlegel, 1991; Hillis et al., 1996). Сравнительной простотой получения данных, поскольку у большинства эукариот ген 18S рРНК, как и другие рибосомальные гены, содержится в геноме в виде большого количества копий (Palumbi, 1996) и обладает высоко консервативными концевыми участками. Поэтому, как правило, амплифицировать с помощью ПЦР и секвенировать этот ген у нового организма сравнительно легко. . Количеством видов, у которых ген 18S рРНК уже секвенирован и проанализирован. На сегодняшний день расшифрована последовательность 18S РНК представителей практически всех крупных филогенетических ветвей эукариотного дерева, поэтому получаемые новые последовательности могут быть сравнены с достаточно широкой выборкой гомологичных последовательностей.
В частности, для амебоидных протистов в последнее время было построено несколько относительно полных филогенетических деревьев на основании последовательности 18S рРНК. При этом еще в восьмидесятые годы выяснилось, что тип Rhizopoda sensu Page, 1987 не существует как единая эволюционная ветвь — представители класса Heterolobosea Page et Blanton, 1985 оказались в "основании" эукариотного древа как сестринская клада эвгленовым водорослям и кинетопластидам, в то время как лобозные амебы и миксомицеты — среди "кроны" (Clark, Cross, 1988; Baverstock et al., 1989). В дальнейшем было выявлено еще, как минимум, четыре независимых клады ризопод. Из них наиболее сильно дивергировавшей (длинной) ветвью являются Granuloreticulosea (Foraminifera + Athalamida), располагающиеся в основании эукариотного дерева (Pawlovvski et al., 1996, 1999), а по последним данным (Pawlowski et al., 2002), входящие в состав ветви "Cercozoa" — крайне гетерогенной группы протистов, обоснованной как отдельный тип Кавалье - Смитом (Cavalier - Smith, 1998), но, фактически, четко выделяющейся только на основе анализа нуклеотидных последовательностей. Отдельными эволюционными ветвями также являются голые филозные амебы (в частности, семейство Nucleariidae; Amaral Zettler et al., 2001), располагающиеся на дереве внутри ветви Opisthokonta и образующие сестринскую кладу воротничковым жгутиконосцам, раковинные филозные амебы, входящие в состав ветви "Cercozoa" (Bhattacharya et al., 1995; Burki et al., 2002; Wylezich et al., 2002) и "Amoebozoa", включающие в себя голых лобозных амеб, Eumycetozoea (по крайней мере, миксомицетов и диктиостелиевых слизевиков) и кладу "архамеб", объединяющую безмитохондриальных анаэробных амеб и амебофлагеллят (Fahmi etal., 2003). Уже этот неглубокий "срез" имеющихся данных показывает, что при получении последовательности гена 18S рРНК каких-либо химатисменид, материала для сопоставления полученных данных, скорее всего, будет достаточно, во всяком случае, если исходить из идеи о том, что эти протисты являются лобозными амебами.
Поэтому для реконструкции филогении химатисменид данные об их морфологии необходимо дополнить молекулярно - биологическими признаками — в частности, последовательностями 18S рибосомальной РНК различных представителей этой группы.
Реконструкция филогении рода Cochliopodium на основании последовательностей 18SpPHK
Предварительный анализ полученных последовательностей показывает, что в случае построения древа по методу объединения соседей или максимального правдоподобия, на филогенетических деревьях, построенных на основании 70 последовательностей представляющих основные группы амебоидных протестов и других эукариот (650 наиболее консервативных позиций) представители рода Cochliopodivm всегда образуют единую длинную ветвь, располагающуюся в пределах Amoebozoa. Этот результат практически не зависит от алгоритма построения древа и применяемой модели эволюции последовательностей. Поэтому для дальнейшего анализа мы отобрали группу из 39 последовательностей, содержащую, кроме представителей рода Cochliopodivm, последовательности 30 представителей всех основных таксонов Amoebozoa и 6 последовательностей из клады Opisthokonta, использованных в качестве внешней группы. Для филогенетического анализа отобрали 773 позиции, из которых 289 были консервативными, 480 — вариабельными и 360 — информативными с точки зрения парсимонии.
Анализ набора последовательностей с помощью программы Models (Rzhetsky, Nei, 1995 — аналог х2- теста) показывает, что соотношение нуклеотидов в его пределах существенно варьирует у разных видов (1 = 230,7; df = 114). Из имеющихся моделей эволюции последовательностей полученным данным наиболее соответствуют модели Тамуры и Нея (TN93; Tamura, Nei, 1993) и Хасегавы, Кишино и Яно (HKY85; Hasegawa et al., 1985). Эти модели эволюции и были использованы при реконструкции филогенетических деревьев по алгоритму "объединения соседей".
Анализ "уровня филогенетического сигнала" в использованном наборе последовательностей по алгоритму "картирования правдоподобия" (likelihood mapping), реализованному в программе Treepuzzle 5.0 (Strimmer, von Haeseler, 1997) показывает, что уровень филогенетического сигнала достаточно высок — из всех возможных квартетов последовательностей (82251) только 732 (0,9%) оказались "неразрешенными" (рис. 63, /) при использовании модели TN93 и 665 (0,8%) при использовании модели HKY85 (рис. 63,2). последовательностей, использованном для реконструкции филогенетического древа при помощи программы Treepuzzle 5.0 (Strimmer, von Haeseler, 1997) методом "картирования правдоподобия". /. С использованием модели TN93. 2. С использованием модели HKY85. В углах треугольников — доли "полностью разрешенных" квартетов последовательностей из всех возможных, вдоль сторон — доли "частично разрешенных" квартетов, в центре — доли "неразрешенных" квартетов.
Филогенетические деревья, реконструированные по алгоритму объединения соседей, представлены на рис. 64 и 65. По топологии эти деревья идентичны друг другу, слегка отличаясь лишь значениями бутстрэпа некоторых ветвей.
Состав и взаимное расположение основных ветвей в представленных деревьях в целом соответствуют результатам, полученным ранее различными авторами (Peglar etal.,.2003; Fahrni et al., 2003). Amoebozoa образуют единую кладу, в пределах которой можно выявить самостоятельные ветви "Gymnamoebia sensu strictd", архамеб, а также несколько ветвей "остальных лобозных амеб" и Mycetozoa.
Представители рода Cochliopodium на представленных деревьях надежно (бутстрэп в обоих случаях 99%) образуют единую длинную ветвь (одну из самых длинных на всем дереве), ответвляющуюся глубоко в пределах Amoebozoa. При этом на наших деревьях она оказывается сестринской архамебам, но такое ее положение не подтверждается значением бутстрэпа для этой группировки.
Дерево сходной топологии получается и при использовании алгоритма "максимальной экономии" (рис. 66). На этом дереве мы можем оценить лишь топологию, поскольку методы реконструкции "максимально экономного" филогенетического древа не позволяют оценить длину ветвей. Есть небольшие отличия в составе и значениях бутстрэпа некоторых ветвей, но основные клады Amoebozoa — "Gymnamoebia sensu stricto" и Archamoebae — сохраняются в том же составе, что ив деревьях, реконструированных по алгоритму "объединения соседей", с высокими значениями бутстрэпа.
Представители рода Cochliopodium по - прежнему образуют единую кладу с бутстрэпом 99%, положение которой относительно других ветвей амебоидных организмов, по сравнению с предыдущими деревьями, меняется. В этом случае она входит в состав крупной ветви, объединяющей Mycetozoa, семейство Vannellidae и род Gephyramoeba, оказываясь сестринской слизевикам. При этом вся эта крупная клада оказывается сестринской архамебам. Но, опять же, значение бутстрэпа для такой топологии дерева оказывается крайне низким.
Отличия в топологии приведенных нами деревьев и деревьев, известных из литературы (Peglar et al., 2003; Fahmi et al., 2003), скорее всего, можно объяснить артефактами проведенного нами анализа. Вероятность возникновения таких артефактов достаточно велика, поскольку нам, с неизбежностью, приходилось использовать при реконструкции деревьев лишь частичные последовательности гена, — исключая около 600 нуклеотидов с 5 - конца.
Топология "кохлиоподиумной" ветви филогенетического древа является строго постоянной и не зависит от алгоритма реконструкции древа и применяемых моделей эволюции. В основании ветви всегда располагается С. spiniferum, а С. minus и Cochliopodium sp. 2 всегда группируются вместе и располагаются на вершине ветви. При этом расстояние между этими видами на древе оказывается достаточно велико — длина ветвей, соответствующих отдельным видам рода Cochliopodium, больше, чем, например, длина ветвей, соответствующих отдельным родам семейства Vannellidae или отряда Leptomyxida.
