Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1. Абдоминальная хирургическая инфекция. Определение и понятия 11
1.2. Микробиологическая структура абдоминальной хирургической инфекции 13
1.3. Принципы определения чувствительности микробов к антибактериальным препаратам 14
1.4. Методы определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам .15
1.5. Неоднозначность современных подходов к назначению противомикробных препаратов .20
1.6. Метод лазерной флюоресцентной диагностики 23
1.7. Естественные флюорофоры – клетки живого организма 28
1.8. Опыт в изучении спектральных характеристик различных микроорганизмов .30
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 33
2.1. Общая характеристика больных 33
2.2. Методы исследования 45
2.2.1.Методы микробиологических исследований 46
2.2.2. Метод флюоресцентного анализа плазмы крови на аппарате «Спектролюкс-МБ» 47
2.3. Методика проводимого исследования 51
2.4. Статистическая обработка клинического материала .59
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований 61
3.1. Анализ клинического течения, микробной контаминации, возможности прогнозирования течения абдоминальной инфекции у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями органов брюшной полости .61
3.2. Сравнительная характеристика особенностей микробной контаминации брюшной полости при микробиологическом методе исследования и лазерной флюоресценции 74
3.3. Антибактериальная терапия по данным лазерной флюоресценции. Антибиотикорезистентность микробной флоры у больных с перитонитом 91
3.4. Выявление туберкулеза у хирургических больных с абдоминальной хирургической инфекцией 95
Обсуждение полученных результатов 105
Выводы .121
Практические рекомендации .122
Список литературы
- Микробиологическая структура абдоминальной хирургической инфекции
- Неоднозначность современных подходов к назначению противомикробных препаратов
- Метод флюоресцентного анализа плазмы крови на аппарате «Спектролюкс-МБ»
- Сравнительная характеристика особенностей микробной контаминации брюшной полости при микробиологическом методе исследования и лазерной флюоресценции
Микробиологическая структура абдоминальной хирургической инфекции
Определение чувствительности возбудителя заболевания к антимикробным препаратам, наряду с тщательной бактериологической диагностикой заболевания с выделением и идентификацией возбудителя, является главным условием для рациональной терапии бактериальной инфекции.
В настоящее время в клинической практике существуют два принципа назначения антибактериальных препаратов: эмпирическое и этиотропное [22]. Эмпирическое назначение антибиотиков подразумевает применение антибактериальной терапии, основанной на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований [47]. Несомненным преимуществом эмпирического назначения антибактериальных препаратов является возможность быстрого начала терапии. При таком подходе необходимо осуществлять постоянный контроль и эпидемиологический надзор за развитием резистентности, а на основании полученных данных лабораторного исследования корректировать продолжительность лечения и режимы дозирования антимикробных препаратов в соответствии со структурой резистентности. Данные литературы указывают на значительные трудности в выборе адекватной антибактериальной терапии при инфекциях, вызванных полирезистентными штаммами грамотрицательных и грамположительныхбактерий бактерий, такими как – Staphilococcus aureus, Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa или Klebsiella pneumoniae и т.д. [22].
Однако, в одном из исследований было показано, что только 30% всей антимикробной терапии применяется целенаправленно на основании данных микробиологического исследования [110]. При неэффективности проводимой антибактериальной терапии нозокомиальных инфекций, когда затруднительно предположить возбудителя и его чувствительность к антибиотикам, необходимо проводить этиотропную терапию. Этиотропное назначение антибиотиков предполагает выделение возбудителя инфекции из клинического материала и определение его чувствительности к антибиотикам. Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов [61, 86, 87, 88, 89, 90, 92, 93].
Кроме противомикробного спектра, эффективность противомикробной терапии зависит от многих факторов, таких как тканевая концентрация антибиотика, проницаемость через гистогематические барьеры, период полувыведения. Однако, если лекарство неактивно против типичных возбудителей болезни, самые высокие концентрации в очаге инфекции, оптимальный режим дозирования и абсолютная безопасность не имеют смысла. Все эти параметры можно сравнивать только для тех препаратов, которые обладают необходимой активностью против микробов.
Используемые в настоящее время методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам делятся в основном на две группы: методы диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков, пропитанных антибиотиками и методы серийных разведений антибиотиков в жидкой или плотной питательной среде. Методы серийных разведений основаны на непосредственном изучении величины минимальных концентраций антибиотиков в жидкой или плотной питательной среде, задерживающих (подавляющих) рост тестируемых культур. Антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. При этом используют двойные последовательные разведения концентрации антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). Диапазон серии разведений зависит от установленных критериев чувствительности; она может быть начата и закончена на различных этапах. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по McFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После заражения исследуемые образцы инкубируют при 370С в течение 16-20 часов или более в зависимости от появления роста в контроле (контрольная пробирка содержит бульон без антибиотика и культуру для каждого испытуемого штамма) и проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл. Отсутствие роста во всех пробирках, кроме контрольной, свидетельствует о том, что МПК антибиотика в отношении микроба ниже используемой концентрации [58, 81, 82].
В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных микро- и макроразведений (пробирочный), описанные выше. Область применения макрометода из-за низкой производительности ограничивается случаями необходимости оценки чувствительности единичных штаммов. Преимуществами микрометода является высокая производительность и возможность длительного хранения заранее приготовленных планшет. Тестирование проводят при величине контрольного объема 0,2 мл и меньше, что позволяет значительно сократить количество расходных материалов.
Неоднозначность современных подходов к назначению противомикробных препаратов
В настоящее время известно большое число видов биологических веществ, являющихся природными или естественными флюорофорами. Наиболее ярким примером природного флюорофора является пигмент хлорофилл – ароматический порфириновый комплекс, обладающий кроме сильной окраски еще относительно большим квантовым выходом флуоресценции [102].
Содержание флюоресцирующего вещества в зеленой части фотосинтезирующих растений настолько велико, что при соответствующих оптических способах возбуждения флюоресцентное излучение можно наблюдать без специального оборудования. Большинство порфиринов дают флуоресцентный отклик, который можно наблюдать при возбуждении излучением из широкого диапазона длин волн. Все производные порфирина имеют один общий максимум поглощения на длине волны в области 400 нм, который в некоторых комплексах сдвигается до 450 нм. Это так называемая полоса Соре, описанная для гемоглобина. Характерный спектр поглощения, свойственный порфириновой структуре состоит из четырех полос и полосы Соре. Наилучшим образом для идентификации порфиринов подходит полоса поглощения в красной области [66]. Порфирины представляют собой производные тетрапиррола порфина. Они состоят из четырех пирольных колец, соединенные метиновыми группами. Порфирины и их производные входят в разнообразные биологически активные соединения, такие как белковые комплексы различных фотосинтетических аппаратов растений и водорослей, ферментирующие комплексы, осуществляющие различные звенья дыхательного внутриклеточного цикла (цитохромы, пероксидаза, оксидаза, каталаза), в составе различных гемопротеидов (гемоглобин, миоглобин) и др. [68]. Изучение обмена порфиринов в популяции дрожжей Candida guilliermondii открылись некоторые интересные возможности слежения за физиологическими состояниями микроорганизмов. Методом прямой регистрации спектров люминесценции порфиринов в популяции дрожжей Candida guilliermondii, установлено что в процессе основного цикла ферментации, когда в аппарат (ферментер) поступает необходимое количество субстрата (нормальные углеводороды, соли и микроэлементы) в дрожжах накапливаются порфирины с основным максимумом люминесценции около 625 нм [50].
Во второй же стадии процесса ферментации, характеризующейся прекращением поступления субстрата, в дрожжах синтезируются порфирины с основным максимумом люминесценции около 580 нм. Параллельный подсчет мертвых клеток в популяции показал, что количество их пропорционально интенсивности флюоресценции порфиринов в области 580 нм. Авторы пришли к выводу, что в нормально растущих дрожжах накапливаются свободные формы копропорфирина III и протопорфирина IX [50].
При повреждении же дрожжевых клеток в условиях голодания, инактивирующего действия нагревания, блокирования дыхательной цепи и т.д., происходит накопление хелатных комплексов копропорфирина III и протопорфирина IX с цинком, содержащимся в среде культивирования в качестве микроэлемента, что и приводит к наблюдаемому изменению спектра люминесценции клеток. Обнаруженная закономерность послужила основой способа определения жизнеспособности дрожжей – продуцентов в микробиологическом синтезе [50].
Таким образом, встречающиеся в живых системах классы флюорофоров меняют люминесцентные свойства в зависимости от различных факторов: стадии биохимической активации, кислотности среды, сопряжения с ферментными центрами. Все эти факторы в совокупности определяют форму спектральных зависимостей флюоресцентного излучения таких систем [11]. Следовательно, изучение люминесцентных свойств таких систем, разработка диагностических методов на основе регистрации эндогенных флуорофоров позволят комплексно оценить их состояние. Полученные знания могут быть использованы в медицинской практике.
Морозовой О. А. изучены спектральные характеристики флюоресценции и составлен атлас 50 видов микроорганизмов, являющихся возбудителями гнойно-30 воспалительных процессов, дисбиоза и другой патологии инфекционной природы [64]. Использованы как референсные штаммы, так и штаммы, выделенные из клинического материала. Среди изученных микроорганизмов были облигатные, факультативные анаэробы и строгие аэробы: представители родов Bacillus, Corynebacterium, Haemophilus и др. встречались представители факультативных анаэробов и аэробов [64]. Было установлено, что все исследуемые микроорганизмы обладают собственной флюоресценцией при возбуждении ее зондирующим излучением He-Ne лазера с длиной волны 633 нм, в том числе и те микроорганизмы, флюоресценции которых (более 40 видов) не была получена другими исследователями. Их флюоресценция в красной и ближней инфракрасной областях спектра (635 - 850 нм) [64]. Наличие собственной флюоресценции у всех микроорганизмов объяснимо с точки зрения принципа «биохимического единства», согласно которому клетки всех живых существ состоят из одних и тех же структурных элементов и используют одни и те же механизмы для получения энергии и роста. Все варианты обмена веществ микроорганизмов можно свести к общей схеме, учитывая, что метаболические пути складывались в ходе эволюции. Выявлено, что интегральная интенсивность флюоресценции облигатных анаэробов и строгих аэробов выше, чем у факультативных анаэробов [64]. В условиях эксперимента in vitro было предположено, что показатель интегральной интенсивности флюоресценции (S2\S1; Кf) практически линейно зависит от концентрации микробов. В условиях проведения эксперимента выявлено, что различные виды микроорганизмов различаются не только по интегральной мощности флюоресценции, но и по интенсивности в максимуме флюоресценции, характеризующегося показателем S2 (F) [64].
При исследовании особенностей спектральных характеристик исследуемых объектов было обнаружено наличие двух характерных пиков: первый пик 665 нм второй пик на 695 нм. Для анализа использовались соотношение интенсивностей флуоресценции на этих двух длинах волн. По мнению исследователей, пик на 700 нм совпадает со вторым пиком флюоресценции протопорфирина IX, подтверждением этому служит полученный спектр H.influenzae, которая относится к группе гемоглобинофильных бактерий и нуждается в ростовых факторах IX (группа тетрапирролов) и V (НАД или НАДФ), а также утилизирует протопорфирин IX. Пик на 665 нм является суперпозицией нескольких пиков флюоресценции: первого пика протопорфирина IX, второго пика копропорфирина IX, цинк-порфирина и спектра поглощения фильтра спектрометра [19, 64].
Таким образом, было показано, что амплитудно-спектральные показатели флюоресценции (мощность, спектральная характеристика) линейно зависят от концентрации микробов. Выявлено, что различные виды микроорганизмов в условиях проведения эксперимента различаются, как по интенсивности и максимуму флюоресценции, так и по интегральной мощности флюоресценции [64]. Высокая эффективность метода ЛФД (лазерной флюоресцентной диагностики) выявлена при индикации аэробной и анаэробной инфекции взрослых и детей [3]. При этом показана объективная возможность применения ЛФД для экспресс оценки состояния больных с гнойно-воспалительными заболеваниями и дисбиозами ЖКТ [4, 5, 6].
Метод ЛФД можно использовать для оценки эффективности лечения, адекватного выбора медикаментозной терапии и экспресс индикации ее эффективности, в том числе в мониторинговом режиме при объективизации процесса реабилитации больных широкого круга заболеваний и процессов микробной природы.
Метод флюоресцентного анализа плазмы крови на аппарате «Спектролюкс-МБ»
В исследование были включены пациенты с различной ургентной патологией, оперированные в экстренном или срочном порядке, у которых в диагностировалась абдоминальная хирургическая инфекция.
Для апробации диагностической методики ЛФ всем больным при поступлении брался на микробиологическое исследование биологический материал (перитонеальный экссудат, плазма крови). Причем, исходя из поставленных целей и задач, биологический материал исследовался, как при помощи традиционной общепринятой методики, основанной на росте микроорганизмов на питательных средах, так и при помощи методики ЛФ. С целью контроля за полученными данными каждый результат дублировался проведением микробиологического исследования в независимой лаборатории ФБУНМНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора. Выбор независимой микробиологической экспертизы в условиях одного из ведущих в России учреждений в сфере микробиологии был обусловлен необходимостью проверки достоверности полученных данных и сведению к минимуму погрешностей при проводимой работе. Так в ходе проведения исследования была охвачена обширная группа наиболее распространенных заболеваний в экстренной хирургии. Из 123 пациентов у 35 (28,5%) диагностирован – острый аппендицит с местным гнойным перитонитом; у 8 (6,5%) острый деструктивный панкреатит, мелкоочаговый смешанный панкреонекроз с местным серозно-фибринозным перитонитом, оментобурситом; 16 (13%) – язвенная болезнь желудка тяжелого течения, осложненная перфорацией язвы с диффузным серозным перитонитом; 27 (22%) – желчнокаменная болезнь, острый гангренозный калькулёзный холецистит с местным гнойным перитонитом; 6 (4,8%) – сегментарный мезентериальный тромбоз с гангреной участка тонкой кишки, диффузный серозно-фибринозным перитонитом; 15 (12,2%) – странгуляционная тонко-, толстокишечная непроходимость с некрозом участка кишки, местный фибринозный перитонит; 16 (13%) – дивертикулярная болезнь толстой кишки, осложненная перфорацией дивертикула и развитием местного гнойного перитонита.
С целью получения объективных данных в ходе микробиологического исследования, выявления специфических особенностей микробиологического пейзажа, а так же определения чувствительности и специфичности метода ЛФ каждая группа верифицированной хирургической патологии рассматривалась в отдельности.
Так в случаях наличия острого аппендицита с местным гнойным перитонитом составили 35 (28,5%) от общей выборки. Средний возраст пациентов составлял 33,2±8,5 лет. Соотношение между мужчинами и женщинами 1:1,5. Из 35 больных молодого возраста были 28 (80%) пациентов, среднего – 7 (20%) пациентов. Основной сопутствующей патологией являлись заболевания дыхательной (ХОБЛ, бронхиальная астма – 8 (22,8%) пациентов), мочевыделительной систем (Хронический пиелонефрит, цистит, мочекаменная болезнь – 12 (34,2%)). На момент поступления средняя величина АРАСНЕ III равнялась 25±2,4 баллов; SOFA – 2 баллам, МИП 10,5±2,5 баллов. Время от начала проявлений симптомов заболевания до госпитализации в стационар составляло в среднем 1,5-2 сут.
Во время оперативного вмешательства больным одновременно для микробиологического исследования и определения чувствительности к антибиотикам выполнялся троекратный забор перитонеального экссудата, крови.
При традиционном методе микробиологического исследования перитонеального экссудата выявлено, что информативные результаты были только в 19 (54,3%) случаях, в остальных 16 (45,7%) - рост микрофлоры не определен.
Из общего числа положительных ответов на рост штаммов микроорганизмов в 12 (34,3%) случаев отмечалось наличие ассоциации микробных штаммов, где преобладали ассоциации грамотрицательных бактерий с грамположительными кокками в виде Escherichia coli 104-105 и Enterococcus spp. 104-105. В то время как у 7 (20%) преобладали грамотрицательные бактерии в виде Escherichia coli 104-105 (Рис. 27).
Чувствительность к антимикробным препаратам характеризовалась широким выбором лекарственных средств, включающих в себя – полусинтетические пенициллины широкого спектра действия (Ампициллин), аминогликозиды (Гентамицин, Амикацин), фторхинолоны (Ципрофлоксацин), цефлоспорины III поколения (Цефоперазон, Цефтриаксон), цефалоспорины IV поколения (Цефипим), карбапенемы (Меронем), гликопептиды (Ванкомицин).
Схожие результаты были получены и при контрольном исследовании в лаборатории ФБУНМНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора. Принципиальным различием в высеваемых штаммах микроорганизмов было выявление в 6 (17 %) случаев факультативных анаэробов группы Bacteroides в ассоциациях с грамположительными кокками (Escherichia coli, Enterococcus spp.) и грамотрицательными бактериями (Рис. 28). При этом суммарный результат положительных ответов соответствовал у 24 (68,5%) пациентов.
Сравнительная характеристика особенностей микробной контаминации брюшной полости при микробиологическом методе исследования и лазерной флюоресценции
Для создания раствора с заданной концентрацией необходимо – 20 мл физиологического раствора, 100 мг меронема (сухое вещество); для проведения исследования необходимо использовать 34мкл готового раствора на одну кювету объемом 1,5 мл.
Для расчета растворов других антибактериальных препаратов с заданной концентрацией используются аналогичные пропорции.
После чего проводится исследование и анализ графического изображения. В обязательном порядке проводится суточный мониторинг – измерение показателей флюоресценции в течение суток через каждый час, после чего делается окончательное заключение по эффективности антибактериального препарата для конкретного больного. Выбор антибиотика методом флюоресцентного анализа основывается на мониторинге изменений флюоресценции плазмы крови под действием антибактериального препарата в сравнении с контролем (плазма без добавления антибиотика).
При ургентной хирургической патологии, (учитывая рекомендации применения антибактериальных препаратов) выбор препарата для исследования сделан по одному из следующих групп: бета-лактамы, аминогликозиды, нитроимидазолы, фторхинолоны. Выбор антибиотика для исследования методом флюоресцентного анализа происходит с учетом особенностей фармакокинетики: длительности периода полувыведения (T более 1-го часа), с наименьшим связыванием препарата с белками крови, с максимальным накоплением в плазме крови в течение 2-24 часов, с парентеральным путем введения. Для исключения погрешности отдельно проводится измерение растворов антибиотиков в заданной концентрации (дополнительный контроль) при той же экспозиции. Эффективность выбора определяется следующим образом: по принятой методике производится измерение флюоресценции плазмы крови человека после введения антибактериального препарата через 2, 4, 12 и 24 часа. При необходимости снятие показателей графического изображения можно сделать и чаще. Микрофлора чувствительна к антибактериальному препарату, если под его действием происходит изменение показателей F, Ka;снижение нормированной мощности флюоресценции (Kf) более чем 20%. Проводится лечение выбранным препаратом, терапия не идет в разрез с общепринятыми порядками назначения антибактериальной терапии. На 1, 3 и 5 сутки проводится дополнительный забор крови в объеме 4-5 мл, для оценки эффективности проводимого лечения. При адекватно проведенном лечении показатели флюоресценции плазмы совпадают или близки по значению к показателям донора (здорового человека). Устойчивой к действию антибактериального препарата считается микрофлора, чья флюоресценция плазмы не изменяется или увеличивается относительно контроля. Необходима коррекция концентрации вводимого препарата или замена его на другой. Обязательно учитываются клинические параметры состояния больного (показатели SIRS, результаты микробиологических посевов).
При меньшем изменении флюоресценции результат трактуется как бактериостатический, который соответственно методике пограничных разведений трактуется как умеренный. В данном случае проводится контрольное исследование через сутки.
У всех больных проводится интраоперационный забор перитонеальной жидкости на микробиологический посев для определения этиологического фактора и определения антибиотикограммы по результатам посева, посев крови на высоте лихорадки, при необходимости бронхиальные смывы и микробиологическое исследование мочи с определением антибиотикограммы. Далее идет сравнение результатов, оценка клинической эффективности проводимой терапии. Статистическая обработка клинического материала
Полученные в ходе исследования количественные данные подвергнуты вариационной статистической обработке. Вычислялись средние арифметические величины (М), среднеквадратические (стандартные) отклонения (±) и ошибки (±m), доверительные границы (C) и интервалы (L) средней арифметической, амплитуды вариационных рядов (а). Достоверность различий двух сравниваемых величин определялась по критерию Стьюдента (t), c последующим определением вероятности р. При условии нормального (параметрического) распределения исследуемых признаков различия между группами считались статистически значимыми при p0,05 и высоко значимыми при p0,01 (p-уровень вероятности возможной ошибки: 5% (0,05) и 1% (0,01). Статистический анализ выполнен с помощью компьютерных программ Excel и Statistica 6.0.
