Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные аспекты фото динамической терапии гнойных и хронических ран (обзор литературы) 11 стр.
Глава 2. Общая характеристика экспериментальных и клинических исследований 24 стр.
1.1 Характеристика экспериментальных исследований 24 стр.
1.2 Характеристика клинических наблюдений 29 стр.
1.3 Методы исследования 40 стр.
1.3.1 Клинико-лабораторные методы исследования 40 стр.
1.3.2 Морфологические методы исследования ран 41 стр.
1.3.3 Микробиологические методы исследования ран 42 стр.
1.3.4 Планиметрический метод исследования ран 43 стр.
1.3.5 Статистическая обработка полученных результатов 44 стр.
Глава 3. Результаты исследований комплексного лечения гнойных ран с использованием лазерной фотодинамической терапии 45 стр.
3.1 Результаты экспериментальных исследований 45 стр.
3.2 Результаты клинических исследований 57 стр.
3.3 Результаты морфологических исследований 68 стр.
3.4 Результаты микробиологических исследований 78 стр.
3.5 Результаты планиметрических исследований 81 стр.
Заключение 83 стр.
Выводы 93 стр.
Практические рекомендации 95 стр.
Список литературы 97 стр.
- Характеристика клинических наблюдений
- Микробиологические методы исследования ран
- Результаты клинических исследований
- Результаты планиметрических исследований
Характеристика клинических наблюдений
ФС, локализованный в мембранах и/или цитоплазме клеток, поглощает квант излучения, переходит в возбужденное состояние, вначале в коротко живущее синглетное, затем в триплетное. Именно в трип летном возбужденном состоянии ФС может взаимодействовать с молекулярным кислородом, передавая ему энергию возбуждения и переводя его в возбужденное синглетное С02) состояние. При этом следует учитывать, что время жизни синглетного и других активных форм кислорода в клетке весьма мало ( 1 мкс) и вследствие этого 02 реагирует с окружающими молекулами на расстоянии не более 0,1 мкм от места генерации. [89].
В качестве фотосенсибилизаторов обычно используют фталоцианины, порфирины, или хлорины вследствие их высокой эффективности. Наиболее активными и нетоксичными ФС являются хлорины (например, фотодитазин). Проведенные к настоящему времени исследования показали, что триплетно-возбужденные молекулы ФС, накапливаясь в мембранах органелл клетки, способны инициировать фотохимические реакции двух типов [5, 6, 46, 70, 117,118, 123]. Возможно непосредственное взаимодействие ПФС с биомолекулами (отрыв электрона или непосредственно атомов водорода), что ведет к образованию свободных радикалов, при взаимодействии которых с молекулярным кислородом образуются радикальные формы кислорода. В реакциях второго типа происходит перенос энергии от ФС к молекулам кислорода и генерация синглетного кислорода (02), являющегося активным окислителем [23, 53, 81, 85, 94, 123].
На конечном этапе ФД - воздействия оба типа фотохимических реакций приводят к разрушению мембран клеток, внутриклеточных структур и бактериальных агентов, вызывая, тем самым, гибель клеток [6, 45, 85, 101, 102, 104, 117]. Лечение с помощью ПФС дает положительные результаты, но иногда их применение вызывает и побочные эффекты, например, повышение температуры, мышечную слабость, длительную светочувствительность кожи [74, 83]. Поэтому весьма актуальными становятся исследования путей снижения побочных эффектов ФДТ, прежде всего, уменьшение дозы вводимых фотосенсибилизаторов и сокращения времени освещения.
Основываясь на работах F.HJ.Figge с соавторами, было высказано предположение, что раз ФС накапливается в клетках, обладающих высокой пролиферативной активностью, то, возможно, ФДТ будет высокоэффективной при лечении гнойных ран.
J.Schneider с соавторами провели экспериментальное исследование с метиленовым синим и облучением широкополосным белым светом (400-700 нм) в дозе 10 Дж/см Qb-бактериофага in vitro.[111]. В результате которого, была выявлена инактивация РНК Qb-бактериофага, посредством ее сшивки с плазматическими протеинами.
О токсическом влиянии ФДТ на вирусы показано в исследовании M.Shikowitz с соавторами [109]. Где ФДТ с дигематопорфиринами применялась для лечения 41 больного с рецидивирующим папилломатозом гортани (с учетом того, что папилломатоз является клиническим проявлением папилломавирусной инфекции). Трехлетнее наблюдение за больными показало хороший клинический эффект по сравнению с контрольной группой и отсутствие папилломавируса в гистологических препаратах.
В настоящее время, фотодинамическая терапия гнойных и длительно незаживающих ран использует опыт, накопленный при ФДТ опухолей [47,110,119].
В 1924 году A. Passow и W. Rimpau исследовали фото динамическое воздействие на грамположительные и грамотрицательные бактерии с различными фотосенсибилизирующими красителями. Эксперименты выявили значительно более низкую инактивацию грамотрицательных бактерий по сравнению с грамположительными. Также исследователями установлено, что грамположительные бактерии весьма чувствительны к фотосенсибилизирующему действию целого ряда фотосенситбилизаторов, абсорбирующих видимый свет [59, 60, 61, 96]. Однако выявленный феномен инактивации бактерий под воздействием ФДТ, в дальнейшем не вызвал заметного интереса в научном мире и результаты исследований в клинической практике не использовались. Причина этому - ограниченные знания о механизмах действия и лимитированные возможности синтеза действенных фотосенсибилизаторов для летальной фотосенсибилизации бактерий и необходимых для этого источников света. В последние годы вновь возрос интерес к изучению проблемы фотодинамического воздействия на патогенную микрофлору, уже на более высоком научном уровне и технической оснащенности научных исследований [102, 114, 122].
В немалой степени возрождению интереса к возможности летальной фотосенсибилизации бактерий, способствовал рост антибиотико-резистентных штаммов патогенных микроорганизмов, возрастающая актуальность проблемы госпитальной инфекции и лечения гнойных ран [43,71,125].
Высокая антибиотикорезистентность, вынуждает лечащего врача назначать высокие дозы противомикробных препаратов, что влечет за собой их системную токсичность на организм, что, в свою очередь, вызывает появление осложнений (нефро-, гепато- и нейротоксичность, дисбактериоз и т.д.). Данная проблема явилась предпосылкой к поиску "идеального противомикробного препарата", не обладающего системной токсичностью.
На заре XXI века Paul Erlikh, была высказана идея о "волшебной пули", гипотетически представляющей антимикробное средство, целевым образом доставляемое в очаг поражения и взаимодействующее только с возбудителем инфекционного заболевания, но не с тканями и клетками организма-хозяина [127].
В работах Z.Malik с соавторами показано, что эффективность фотодинамической терапии не зависит от спектра чувствительности патогенных микроорганизмов, она оказалась губительной даже для антибиотико-резистентных штаммов золотистого стафилококка, кишечной палочки и других микроорганизмов [19, 21, 45, 69, 95, 96, 97].
Микробиологические методы исследования ран
Очевидно, об эффективности влияния полимера на активность порфиринов и степень их агрегации можно судить по молярным соотношениям полимер/порфирин, при которых наблюдается максимальные значения кЭфф. Наибольший эффект «разагрегации» наблюдается при введении в систему ПВП, причем в случае ФД и ТФФП молярное соотношение ПФС-ПВП, при котором величина кэфф максимальна составляет 1:10, а активность ДМГ достигает максимума при соотношении ПФС-полимер, равном 1:50, т.е. при концентрации ПВП в 5 раз большей, чем в случае ФД и ТФФП.
Такая разница в молярных соотношениях полимер - ПФС для ДМГ и ФД, возможно, объясняется различной степенью агрегированное молекул ПФС. Как отмечалось выше, размер агрегатов ДМГ в воде может достигать 80 нм, а размеры агрегатов ФД не превышают 1 нм [82].
При дальнейшем увеличении концентрации полимеров в системе кэфф падает, что связано, очевидно, с уменьшением числа каталитически активных центров.
Подобные, но менее значительные эффекты наблюдаются в присутствии ПЭО, ПВС и плюроника F127. Так, например, максимум фотокаталитической активности ТФФП достигается при более высоких концентрациях полимеров (5 10"5М - 1 10"4М), при этом увеличение кэфф не столь значительно, как при добавлении ПВП.
В отличие от ТФФП, ДМГ и ФД активность ТСФП падает в 2 раза при добавлении всех полимеров, что связано, вероятно, с образованием агрегатов молекул ТСФП, имеющих в качестве периферийных заместителей 4 сульфокислотные группировки в мезо-положениях порфиринового цикла. Очевидно, добавление полимеров вызывает уменьшение растворимости анионного ТСФП, т.е. образование агрегатов, менее активных, чем не агрегированные молекулы порфирина. Об агрегации ТСФП в присутствии полимеров свидетельствует падение интенсивности флуоресценции порфирина на 5-40% при введении полимеров в систему.
Таким образом, можно полагать, что амфифильные полимеры, в том числе, ПВП, ПЭО, ПВС и плюроник F127, которые не обладают собственной фотохимической активностью, способны увеличивать фотокаталитическую активность водорастворимых порфириновых фотосенсиблизаторов, вследствие диссоциации агрегатов молекул порфиринов. Наблюдаемое in vitro повышение фотокаталитической активности ПФС в присутствии амфифильных полимеров в процессе генерации синглетного кислорода (определяемое в реакции фотоокисления триптофана), может являться одной из составляющих обнаруженного ранее in vivo эффекта повышения активности комплексов АП-ПФС в процессах фотодинамической терапии опухолей, лечении гнойных и огнестрельных ран.
Результаты воздействия комплексов фотодитазина и димегина (динатриевая соль протопорфирина), иммобилизованных на карбоксиметилцеллюлозе на культуры опухолевых клеток В ходе первых же опытов на культурах опухолевых клеток с образцами комплекса ФЗ-КМЦ, стало ясно, что происходит резкий сдвиг цитотоксичности в сторону ее увеличения. В частности, 50%-ая гибель клеток наблюдалась при концентрациях ФЗ 10" -4 10" моль/л (для сравнения, в случае неиммобилизованного ФЗ эта величина составляла -10" моль/л). При этом в части экспериментов 20-40%-ое ингибирование клеточной о пролиферации начиналось уже с доз 5 10" моль/л (рис. 4).
Проведенные эксперименты показали, что иммобилизованный на КМЦ ФЗ обладает в 15-20 раз более высокой фотоцитостатической активностью по сравнению с неиммобилизованным ФЗ. Были проведены две серии экспериментов по изучению влияния иммобилизации на активность фотодитазина. Из рис.4-5 видно, что 1С5о для HBL-100 и Skov-З в случае исходного ФЗ составляет 10"5-1,5 10"5 моль/л, (рис.4, кривая 1; рис.5, кривые 1, 2). В случае полимерных комплексов ФЗ с КМЦ 1С5о уменьшается до (10" n 2,5 10") моль/л (рис.4, кривые 5, 6, рис.5, кривые 3, 4). Приведенные результаты были получены в разных сериях испытаний. Таким образом, средние концентрации ФЗ в образцах с КМЦ при достижении 1С5о для двух клеточных линий в разных сериях экспериментов практически совпали и составили —1,510" моль/л (по сравнению с дозой 10"5 для исходного ФЗ).
Результаты клинических исследований
Клинические исследования показали, что динамика течения раневого процесса у пациентов опытной и контрольной групп была различной в зависимости от проводимого лечения.
Показаниями к проведению ФДТ являлось наличие гнойной раны, с участками некрозов, фибринозно-гнойными наложениями и налетом фибрина в дне раны, а также выраженное перифокальное воспаление.
Противопоказаниями к выполнению ФДТ считали декомпенсированные сопутствующие заболевания (дыхательная, сердечная недостаточность), перенесенные инфаркт миокарда и инсульт менее одного года назад, вторую стадию раневого процесса (фаза дегидратации, эпителизации).
Так при традиционном лечении субфебрильная температура тела сохранялась в течение 3-5 дней. Местные проявления гнойного заболевания, такие как гиперемия вокруг раны, сохранялась от 3-5 дней, уменьшение отека вокруг раны отмечено на 4-5 сутки, а инфильтрация окружающей рану ткани уменьшалась на 8-9 сутки.
При традиционном методе лечения сроки очищения ран от гнойно-некротических масс и появление грануляционной ткани составили 7,2±0,6 суток и 7,4±0,5 суток, соответственно. Появление краевой эпителизации выявлено на 8,1±0,5 сутки после первичной хирургической обработки раны.
В тоже время, использование традиционной терапии в сочетании с лазерной ФДТ с фотодитазином в комплексе с амфифильным полимером, иммобилизованным на наночастицах гидроксиапатита, в виде геля, привело к быстрому уменьшению воспалительных проявлений. Субфебрильная температура тела сохранялась 1 -2 дня. Гиперемия вокруг раны уменьшилась уже на 2-3 сутки, а отек и инфильтрация окружающей рану ткани уменьшились на 2-3 сутки и 5-6 сутки, соответственно.
Использование данного метода позволило сократить сроки очищения ран от некротических масс и привело к скорейшему появлению грануляционной ткани. В среднем, очищение ран от гнойно-некротических масс и фибрина произошло на 3,4±0,8 сутки (р 0,05). Появление грануляционной ткани отмечено на 3,6±0,8 сутки, а краевая эпителизация выявлена на 4,7±0,9 сутки, что достоверно лучше, чем при традиционном методе лечения (р 0,05).
Динамика течения раневого процесса в опытной и контрольной группах, в зависимости от метода лечения, представлена в таблице 5. Таблица 5. Динамика течения раневого процесса в опытной и контрольной группах, в зависимости от метода лечения Группа Количество пациентов Средние сроки (сутки) Очищение ран Появлениегрануляционнойткани Появлениекраевойэпителизации Основная 50 3,4±0,8 3,6±0,8 4,7±0,9 Контрольная 50 7,2±0,6 7,4±0,5 8,1±0,5 При уровне значимости (р 0,05) по сравнению с контрольной группой Таким образом, лечение пациентов с гнойными ранами мягких тканей с применением лазерной фотодинамической терапии с фотодитазином в комплексе с амфифильным полимером, иммобилизованным на наночастицах гидроксиапатита, используемым в виде геля, сокращает сроки очищения ран от гнойно-некротических масс в 2,11 раза по сравнению с традиционной терапией, в 2,05 раза ускоряет появление грануляционной ткани и в 1,72 раза ускоряет появление краевой эпителизации.
У пациентов со сниженными регенеративными способностями (диабет и т.д.) антибиотикотерапию проводили курсом до 7 дней, в сочетании с антимикотическими препаратами. В контрольной группе 42 (84%) пациенты получали антибактериальную терапию препаратами широкого спектра действия (до получения результатов посева). В опытной группе использование лазерной ФДТ с фотодитазином в комплексе с водорастворимым амфифильным полимером, иммобилизованным на наночастицах гидроксиапатита, в виде геля, позволило назначить антибактериальные препараты меньшему количеству пациентов - 18 (36%).
Еще одним критерием эффективности лазерной ФДТ, по отношению к традиционному лечению, является количество повторных оперативных вмешательств (некрэктомий, вскрытие затеков, карманов и т.д.) в результате прогрессирования гнойного процесса.
Следует отметить, что в основной группе пациентов получавших, помимо традиционного лечения, сеансы лазерной ФДТ с фотодитазином в комплексе с амфифильным полимером, иммобилизованным на наночастицах гидроксиапатита, в виде геля, таких случаев не отмечено. Тогда как, в контрольной группе пациентов, повторные вмешательства выполнены у 3(6%) пациентов. Двоим, выполнена некрэктомия, а одному пациенту произведено вскрытие гнойного затека. Следовательно, применение лазерной ФДТ с фотодитазином в комплексе с амфифильным полимером, иммобилизованным на наночастицах гидроксиапатита, в виде геля позволило избежать повторных оперативных вмешательств.
Результаты планиметрических исследований
Димегин обладает значительно более низким квантовым выходом синглетного кислорода по сравнению с фотодитазином и возбуждается более короткой длиной волны лазерного излучения - 628 нм.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об усилении фотосенсибилизирующей активности ФС при иммобилизации его на пленки полимеров, использующихся в качестве носителей карбоксиметилцеллюлозы и поливинилового спирта и, возможно, других полимеров, обладающих сходными физико-химическими свойствами. Причем, иммобилизованный комплекс на пленке является более эффективным, чем аналогичный комплекс в водном растворе полимера.
Использование таких комплексированных систем позволяет на порядок увеличивать эффективность ФДТ и тем самым значительно снизить концентрации используемых ФС, что ведет к снижению терапевтической дозы препарата и побочных токсических осложнений. Но влияния данного комплекса на репаративные процессы в клинической практике не исследовались. В связи с этим, была определена цель исследования -улучшение результатов лечения пациентов с гнойными и длительно не заживающими ранами мягких тканей, при помощи лазерной фотодинамической терапии с фотодитазином в комплексе с водорастворимым амфифильным полимером, иммобилизованным на наночастицах гидроксипапатита, используемым в виде геля.
Для решения поставленной задачи было проведено исследование, основанное на результатах комплексного обследования и лечения 100 пациентов с гнойными ранами мягких тканей. Все пациенты, вне зависимости от распределения их по группам, при поступлении в отделение были обследованы согласно московским городским стандартам стационарной медицинской помощи для взрослого населения от 24.03.1997 г. Пациенты были прооперированы в экстренном порядке. Все оперативные пособия выполняли под общим обезболиванием. После обработки операционного поля стандартным способом, производили рассечение тканей до границы визуально неизмененных участков с широким раскрытием всех затеков и карманов, по возможности, объединяя их в единую полость. Затем брали материал для микробиологического исследования и определения чувствительности к антибиотикам, а также кусочки ткани для морфологического исследования. Следующим этапом производили иссечение всех нежизнеспособных и инфильтрированных гноем тканей. Рану санировали 3% раствором перекиси водорода, выполняли гемостаз. На последнем этапе рану рыхло тампонировали марлевым тампоном, смоченным 1% водным раствором йодопирона. На рану накладывали асептическую повязку.
В зависимости от метода лечения все пациенты были разделены на две группы: основную группу составили 50 пациентов, которым наряду с традиционным лечением проводилась лазерная фотодинамическая терапия с фотодитазином в комплексе с водорастворимым амфифильным полимером, иммобилизованным на наночастицах гидроксипапатита, используемым в виде геля. Контрольную группу составили, также 50 пациентов, получавших традиционную терапию.
В основную и контрольную группы включали пациентов обоих полов, близких возрастных групп, сопоставимых по тяжести, распространенности гнойного процесса, нозологическим формам и локализации, а также сходных по характеру и тяжести сопутствующих заболеваний.
Пациенты обеих групп получали традиционное лечение, которое заключалось в воздействии на все фазы раневого процесса. В фазу гидратации применялись протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, химопсин и др.), а также различные виды химических антисептиков: перекись водорода, борная кислота, препараты йода (йодопирон) и марганцевокислый калий и др. Из физических методов применяли УФО, ультразвук и другие виды физиотерапии. Перевязки, в этот период, проводили ежедневно.
В фазу дегидратации, соответственно, применяли различные мази на жировой основе и эмульсии (диоксидиновая, татрациклиновая, фурацилиновая мази, а также синтомициновая эмульсии и др.), так как основной принцип лечения ран в этой фазе - это максимально защитить грануляции от травматизации, а также способствовать их быстрому росту. В связи с чем, перевязки пациентам обеих групп выполняли 1 раз в 2-3 дня, с максимальной осторожностью, чтобы не повредить грануляционную ткань.
Пациентам опытной группы, помимо традиционной терапии проводили сеансы лазерной ФДТ. На раневую поверхность наносили фотодитазин в комплексе с водорастворимым амфифильным полимером, иммобилизованным на наночастицах гидроксипапатита, используемым в виде геля. Рану укрывали стерильной полиэтиленовой повязкой на 40- минут, после чего раневую поверхность облучали низкоинтенсивным лазерным излучением "Аткус-2" с длиной волны 661 ±0,03 нм, плотностью мощности 1,0 Вт/см , плотностью энергии 25-30 Дж/см . Время сеанса зависело от площади раневой поверхности. Процедуру заканчивали наложением повязки с 1% водным раствором йодопирона. Общее количество сеансов ФДТ зависело от площади раневой поверхности и течения репаративного процесса.
![Применение региональной гидропрессивно-сорбционной терапии в комплексе лечения больных с гнойными ранами [Электронный ресурс]](/i/i/4490/206405.png "Применение региональной гидропрессивно-сорбционной терапии в комплексе лечения больных с гнойными ранами [Электронный ресурс] Абакумов Валерий Иванович")
![Вакуум-терапия в комплексном лечении хронических ран [Электронный ресурс]](/i/i/4334/205578.png "Вакуум-терапия в комплексном лечении хронических ран [Электронный ресурс] Антонюк Андрей Васильевич")