Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
Экспериментальная модель
Исследуемый препарат
Глава 2. Материалы и методы 32
Подготовка экспериментальных животных и контроль физиологических функций
Окклюзия средней мозговой артерии
Экспериментальные группы и протокол эксперимента
Неврологическое обследование
Гистологическое исследование
Статистическая обработка
Глава 3. Результаты 46
Физиологические показатели
Неврологическое обследование
Гистологический анализ площади и объема инфаркта
Глава 4. Обсуждение результатов 65
5. Заключение 80
6. Выводы 86
7. Практические рекомендации 87
8. Список литературы 88
9. Приложение 1. 105
10. Приложение 2. 112
- Исследуемый препарат
- Окклюзия средней мозговой артерии
- Гистологическое исследование
- Гистологический анализ площади и объема инфаркта
Исследуемый препарат
На сегодняшний день уже существует достаточное количество доказательств того, что процесс образования свободных радикалов кислорода является важным патогенетическим фактором при ишемическом повреждении различных органов и тканей (111), включая не только головной мозг (69, 132, 134), но и сердце (103), печень (131), кишечник (130) и почки (117). Оксидативный стресс также рассматривается в рамках патогенеза некоторых неиродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (96, 123, 45). Тем не менее, терапевтическая активность препаратов, механизм действия которых связан с прерыванием процесса образования свободных радикалов, до настоящего момента окончательно не установлена (151, 119,147).
Основной механизм образования свободных радикалов заключается в восстановлении молекулярного кислорода в молекулу воды. Восстановление молекулы кислорода приводит к образованию супероксид аниона (02") и молекулы перекиси водорода (Н202). В присутствии переходных металлов, таких как железо (Fe2+), Н202 путем реакции Фентона образует гидроксильный радикал, наиболее активный из всех и ответственный за основной объем оксидативного повреждения тканей (121, 133). Защитные системы от свободных радикалов в организме представленными различными антиоксидантными ферментами, такими как глутатион пероксидаза, каталаза, супероксид дисмутаза (73, 111, 121). Супероксид дисмутаза превращает 02 в Н202, тогда как глутатион пероксидаза и каталаза разлагают молекулу Н202 до молекулы воды. Эти антиоксидантные системы в паре с такими антиоксидантами, как аскорбиновая кислота и а-токоферол работают для снижения уровня свободных радикалов кислорода. Когда увеличивается образование свободных радикалов или снижается активность антиоксидантных систем, возникает оксидативный стресс, приводящий к повреждению липидов, белков, и ДНК, что в свою очередь, приводит к смерти клетки посредством некроза либо апоптоза (111, 123,133).
Существует несколько систем образования свободных радикалов в ткани мозга. Основные из них это система ксантиноксидазы, образование свободных радикалов в митохондриях, система циклоксигеназы-2, продукция активных форм кислорода полиморфоядерными лейкоцитами и система NO-синтетазы (111, 133).
Головной мозг особенно чувствителен к оксидативному стрессу вследствие высокого уровня образования свободных радикалов из-за высокого содержания липидов, повышенному потреблению кислорода мозговой тканью (20% кислорода потребляется головным мозгом при его относительной массе 2% от массы тела человека), а также из-за наличия химических реакций, включающих окисление допамина и глутамата (73, 133). Кроме того, было показано, что в нейронах содержится очень малое количество каталазы, и они в основном рассчитывают на глутатион пероксидазу для элиминации Н202 (73, 133). Несмотря на то, что пусковым механизмом смерти нейронов может и не быть оксидативный стресс, образование свободных радикалов кислорода в дальнейшем может приводить к вторичным повреждениям мозговой ткани, гораздо более обширным, чем первичные (111).
В нормальной ткани мозга образование активных форм кислорода, таких как супероксид анион, перекись водорода, гидроксил-радикал, пероксинитрит анион, сбалансировано эндогенными ферментными системами (супероксид дисмутаза, глутатион пероксидаза, и в гораздо меньшей степени каталаза), а также неферментными системами, такими как глутатион, мочевая кислота, витамины С и Е (133). Тем не менее, после наступления ишемии мозговой ткани и особенно после реперфузии, продукция свободных радикалов значительно возрастает и перевешивает эндогенные защитные системы, приводят к нарушению равновесия (111).
В настоящее время исследованы и продолжают исследоваться свойства различных антиоксидантов природного и синтетического происхождения. Естественные антиоксиданты, такие как Витамин Е и Витамин С были первыми, которые исследователи взяли на вооружение. Витамин С не показал эффективности в уменьшении размера инфаркта в экспериментальных моделях, так как он не проникает через гематоэнцефалический барьер. Напротив, Витамин Е, жирорастворимый витамин и наиболее мощный природный антиоксидант, действующий путем прерывания цепной реакции перекисного окисления липидов, оказался эффективным в моделях глобальной и фокальной церебральной ишемии (63).
Синтетические антиоксиданты более разнообразны с точки зрения механизмов действия и уровня активности.
Из синтетических антиоксидантов первый препарат, исследованный в клинических испытаниях, был тирилазад — 21 аминостерил, действующий как «ловушка» для свободных радикалов и ингибитор перекисного окисления липидов. Несмотря на доказанную эффективность препарата в экспериментальных моделях глобальной и фокальной церебральной ишемии (91), препарат не оправдал возложенные на него надежды. В настоящий момент закончены 6 клинических испытаний препарата, объединяющие 1757 больных, которые показали, что у больных не отмечается улучшения течения и исхода ишемического инсульта по сравнению с группой контроля. Более того, показано, что препарат увеличивает смертность и нетрудоспособность на 20% (91, 147).
Многообещающим является селеноорганическое соединение эбселен, действующее через глутатион и обладающее пероксидазоподобным эффектом. Эбселен ингибирует перекисное окисление липидов и тормозит фермент липоксигеназу в каскаде арахидоновой кислоты, блокирует iNO-синтетазу и защищает от действия пероксинитрита (119). В экспериментах доказана эффективность эбселена в моделях как глобальной, так и фокальной церебральной ишемии (91). Исследования эбселена, проведенные в Японии, показали клиническую эффективность препарата во второй фазе клинических испытаний при приеме в течение 24 часов от момента ишемического инсульта через месяц, но не через три от момента инсульта. Третья фаза клинических испытаний препарата начата в 2001 г. и исследования препарата в настоящий момент продолжаются (119). Кроме того в Японии принят к клиническому использованию при инсульте другой антиоксидант — эдаравон, показавший свою клиническую эффективность во второй фазе клинических испытаний, завершившейся в 1996 г (91).
В России существуют два антиоксиданта отечественного производства. Это эмоксипин и мексидол (соль эмоксипина и янтарной кислоты). Мексидол тормозит перекисное окисление липидов и процесс образования свободных радикалов, увеличивает концентрацию восстановленной формы глутатиона, активирует эндогенную антиоксидантную систему супероксиддисмутазы и церуллоплазмин, предупреждает снижение активности глутатион-зависимых ферментов (10). Выявлено также позитивное влияние мексидола на состояние мембранных структур клеток. Препарат также стимулирует энергосинтезирующие функции митохондрий и улучшает энергетический метаболизм, повышая таким образом устойчивость ткани мозга к гипоксии и ишемии. Доклинические испытания показали безопасность препарата при различных вариантах церебральной гипоксии (10, 11).
Пилотные клинические испытания, проведенные в клинике неврологии РГМУ им. Н.И. Пирогова, подтвердили хорошую эффективность препарата, отсутствие значимых побочных эффектов, установили положительное влияние препарата на течение острого периода ишемического инсульта. В настоящее время проводится рандомизированное двойное слепое плацебо - контролируемое исследование мексидола для оценки его эффективности в первые часы и дни после развития каротидного ишемического инсульта (10).
В последние годы появился ряд препаратов из группы нитронов, которые обладают способностями препятствовать развитию процесса образования свободных радикалов (85). ч Нитроны проявляют антиоксидантные свойства путем прерывания цепи реакций перекисного окисления липидов и образования стабильных продуктов реакции — нитроксидов. Нитроновые «спиновые ловушки» свободных радикалов, такие как а-фенил-нитроны - а-фенил-ІУ-те/ -бутил нитрон (PBN) (118) и его 2,4-динатрия сульфонат, известный как NXY-059 (102), широко исследуются в качестве антиоксидантных терапевтических агентов для предотвращения повреждения тканей по механизму перекисного окисления липидов.
Окклюзия средней мозговой артерии
Обратимая проксимальная окклюзия средней мозговой артерии (оСМА) достигалась путем введения внутрипросветной нитки (ВН) для прекращения кровотока через СМА на 2 часа. В соответствии с модификацией Belayev с соавт. метода Longa (1989), использовалась 3-0 монофиламентная нейлоновая нить (Harvard Apparatus, Inc., South Natic, MA, USA) длиной 4 см, конец которой был закруглен при помощи теплового воздействия. Закругленный конец нити «20 мм покрывался раствором Поли-Л-Лизина (0,1% [wt/vol] раствор в деионизированной воде; Sigma, St. Louis, МО), и высушивалась при 60С в течение 1 часа непосредственно перед использованием. Данная модификация позволяет добиваться более стабильных повторяемых результатов, чем стандартный метод оСМА, предположительно путем увеличения адгезивных свойств между ВН и эндотелием сосуда. Как и при возникновении инсульта при окклюзии проксимальной СМА у человека, эта модель приводит к образованию большого очага коркового и подкоркового инфаркта мозга, повторяемого у экспериментальных животных. Поскольку неврологические и гистологические результаты, получаемые при использовании данной модели, воспроизводимы, данная модель является статистически пригодной для оценки нейропротективной эффективности различных терапевтических агентов, как было показано в работах Belyaev с соавт. и Huh с соавт.
Окклюзия СМА проводилась по методу, описанному Zea Longa с соавт. (1989). Операционный доступ осуществлялся через срединный шейный кожный разрез (3 см). Претрахеальные мышцы, грудино-сосцевидная и двубрюшная мьппцы справа были взяты на лигатуры и разведены, обнажая сосудисто-нервный пучок, содержащий правую общую сонную артерию (ОСА) в области ее бифуркации и правый блуждающий нерв. Под операционным микроскопом ОСА была тщательно отпрепарирована от окружающих фасций и нервного сплетения от уровня собственной бифуркации на 5 мм ниже и взята на свободную лигатуру. Отходящая от бифуркации ОСА наружная сонная артерия (НСА) также была отпрепарирована на длину 5 мм обнажая ее мелкие ветви, пересеченные микроэлектрокоагулятором и затылочную артерию, которая была лигирована двумя лигатурами и коагулирована между ними. Дистальный конец НСА был лигирован. Внутренняя сонная артерия (ВСА) была тщательно отпрепарирована от прилежащего блуждающего нерва и окружающих тканей от уровня бифуркации ОСА до основания черепа, обнажая крылонебную артерию, которая была лигирована у места ее отхождения от ВСА. На ВСА дистальнее места отхождения крылонебной артерии был наложен клип для предотвращения ретроградного кровотока, лигатура на ОСА была натянута. На НСА была наложена лигатура. Микрохирургическими ножницами в НСА было сделано артериотомическое отверстие, через которое вводилась ВН закругленным концом в просвет НСА и далее ОСА. После введения ВН лигатура на НСА затягивалась, фиксируя ВН. НСА пересекалась ножницами дистальнее места введения нити. Удерживая микрохирургическим пинцетом свободный конец НСА, ВН аккуратно вытягивалась из ОСА так, чтобы закругленный конец ВН оказался в области бифуркации, после чего НСА с ВН разворачивались на 180 и ВН вводилась в ВСА. ВН продвигалась так, чтобы ее конец оказался у наложенного на ВСА клипа, после чего последний удалялся. ВН продвигалась далее интракраниально на расстояние 20-23 мм от места бифуркации ОСА в соответствии с весом животного до ощущения сопротивления продвижению нити. Таким образом, осуществлялась эффективная оСМА, так как закругленный конец нити оказывался в месте бифуркации ВСА на СМА и переднюю мозговую артерию эффективно окклюзируя устье СМА. После достижения окклюзии свободный конец ВН погружался в рану, катетеры, находящиеся в бедренных артерии и вене временно закрывались и погружались в рану. Кожный разрез в области шеи и в области доступа к правым бедренным артерии и вене ушивался простым узловым хирургическим швом шелковой нитью 3-0, анестезиологическое пособие прекращалось и животное возвращалось в клетку для восстановления после оперативного вмешательства и последующего неврологического обследования.
Через 1 ч 50 мин после момента окклюзии СМА животное повторно вводилось в наркоз по методике, описанной выше, снимались швы с кожных разрезов, катетер, находящийся в просвете бедренной артерии, подключался к системе контроля АД. Претрахеальные мьшщы и правая грудино-сосцевидная мышца разводились на лигатурах, обнажая область бифуркации правой ОСА. На ОСА накладывалась провизорная лигатура для предотвращения кровотечения в момент удаления ВН. Ровно через 2 часа с момента окклюзии СМА, удерживая свободный конец НСА, ВН медленно удалялась из ВСА и НСА. Лигатура на НСА затягивалась, визуально определялась пульсация на ВСА, что являлось критерием эффективной реперфузии. Катетеры в бедренной артерии и вене наглухо закрывались полиэтиленовыми заглушками и погружались в рану. Кожный разрез в области шеи и в области доступа к правым бедренным артерии и вене ушивался, анестезиологическое пособие прекращалось, и животное возвращалось в клетку.
Гистологическое исследование
Через 30 дней после проведения оСМА, животные вводились в глубокий наркоз смесью 4% галотана, 70% закиси азота и 30% кислорода в закрытой банке, после чего проводилась транскардиальная перфузия головного мозга животного. После срединного кожного разреза проводилась стернотомия для осуществления доступа в грудную полость. Сердце тщательно отпрепаровывалось от органов средостения и перикарда тупым способом ватными тампонами, обнажая корень и восходящую часть аорты и легочный ствол. На восходящую часть аорты накладывалась лигатура, после чего ножницами вскрывался левый желудочек в области верхушки сердца, в просвет которого вводился полиэтиленовый катетер, продвигаемый в восходящую часть аорты под визуальным контролем и фиксируемый лигатурой в просвете аорты. После этого ножницами вскрывалась полость правого предсердия. Введенный катетер был подключен к системе, через которую подавался физиологический раствор хлорида натрия в течение 3-5 мин, а затем раствор FAM (40% раствор формальдегида, глициловая уксусная кислота и чистый метанол, 1:1:8 по объему) в течение 20 мин под давлением 100 - 120 мм. рт. ст. После окончания перфузии животным проводилась декапитация и головы помещались в раствор FAM при температуре 4С на 24 часа. После этого головной мозг извлекался и помещался в FAM при температуре 4С еще на 24 часа, а затем переносился в 70% раствор метанола. Затем мозг погружался в параффин для получения коронарных срезов толщиной 10 цм с дальнейшей окраской их гематоксилином и эозином. Из полученных окрашенных срезов для дальнейшей обработки отбиралось 9 стандартных срезов в соответствии со стереотаксическим атласом мозга крысы со следующими координатами от брегмы, мм (0 мм, точка пересечения срединного шва и лобно-теменного шва) (Таблица 5.):
Полученные 9 стандартных срезов сканировались цифровой CCD -камерой высокого разрешения, подсоединенной к системе обработки цифровых изображений МСЮ Image Analysis System (Imaging Research, St. Catherines, Canada). Полученное изображение сохранялось в цифровом виде для дальнейшего анализа. Анализ проводился после предварительной калибровки системы в соответствии с параметрами фокусного расстояния цифровой камеры для возможности измерения площади полученного изображения в мм2. Путем полуавтоматической и ручной обрисовки интересующих областей на каждом цифровом изображении под непосредственным гистологическим контролем препарата, с которого было получено изображение, были получены следующие данные для каждого стандартного среза:
Общая площадь левой (интактной) гемисферы, мм2 Общая площадь правой (пораженной) гемисферы, мм Площадь желудочковой системы для каждой гемисферы, мм2 Площадь зоны инфаркта мозга, мм2
Учитывая 30-дневный срок выживания животных после оСМА, получить достоверные данные для площади и объема зоны инфаркта мозга не представлялось возможным в силу нарушения структуры, формы и объема пораженной гемисферы, выраженного кистообразования в зоне инфаркта мозга, а также компенсаторной гидроцефалии. Поэтому из полученных первичных данных вычислялась площадь «нормальной» ткани для пораженного полушария (с гистологически верифицированными сохранными нейронами и неизмененной структурой мозговой ткани при сравнении с интактным контралатеральным полушарием) головного мозга по следующей формуле.
Полученные величины SN для каждого полушария на каждом стандартном уровне заносились в электронную таблицу, после чего производился рассчет средней суммарной площади и среднего объема «нормальной» ткани для каждого животного по специальной программе (Cerebral Vascular Disease Research Center, UM, Miami, Fl, USA) с учетом межуровневого расстояния в соответствии со стереотаксическим атласом мозга крысы. По данным площади и объема «нормальной» мозговой ткани вычислялся процент сохранения мозговой ткани пораженного полушария по следующим формулам.
Как ранее было указано, прямая оценка площади и объема очага инфаркта мозга на основании гистологического анализа невозможна. Возможно только вычислить расчетную величину суммарной площади и объема «потери нормальной ткани» с целью дальнейшего сравнения двух групп экспериментальных животных, если принять, что размером этой величины будет являться разница между величиной нормальной ткани интактного полушария (по суммарной площади или объему) и величиной нормальной ткани пораженного полушария.
Полученные данные принимались к дальнейшей статистической обработке.
Гистологический анализ площади и объема инфаркта
Средний объем нормальной ткани левого, интактного полушария у двух экспериментальных групп статистически не отличался (р 0,5) и составил 459,4 ± 6,6 мм3 в группе №1 (лечение, STAZN) и 456,2 ± 3,2 мм в группе №2 (контроль, DMSO), также как и средняя суммарная площадь нормальной ткани левого полушария в обеих группах (группа №1 - 340,0 ± 5,0 мм и группа №2 -337,4 ± 2,3 мм2, р 0,5). Поэтому эти данные были объединены в одну группу для дальнейшей статистической обработки и графического представления.
Было показано, что средняя площадь нормальной ткани правого полушария в группе лечения была достоверно выше средней площади нормальной ткани в контрольной группе в 6 из 9 стандартных уровней, что можно видеть на Графике 2.
Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка - статистически достоверная разница по сравнению с контрольной группой (р 0,05 Student test)Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка - статистически достоверная разница по сравнению с контрольной группой (р 0,01 Student test)
В Таблице 15 представлены данные суммарной площади сохраненной нормальной ткани в двух группах экспериментальных животных.
Средний объем нормальной ткани в группе №1 (лечение, STAZN) оказался соответственно достоверно вьппе такового в группе №2 (контроль, DMSO) и составил 409,2 ±11,2 мм3 и 351,8 ± 16,9 мм3 соответственно р=0,007 (График 4).
Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка - статистически достоверная разница по сравнению с контрольной группой (р 0,01 Student test)
В Таблице 16 представлены данные объема сохраненной нормальной ткани в двух группах экспериментальных животных.
Данные суммарной площади и объема «нормальной» мозговой ткани вычисленные для каждого экспериментального животного, использовались для расчета процента сохранения мозговой ткани пораженного полушария по площади (Таблица 15.) и объему (Таблица 16.) соответственно. Было показано, что средний процент сохранения мозговой ткани по площади составляет 88,8 ± 2,2 % для группы №1 (лечение, STAZN), что достоверно больше такового для группы №2 (контроль, DMSO) - 76,0 ± 4,0 % (р 0,01 Student test). Средний процент сохранения мозговой ткани по объему составил 89,1 ± 2,2 % для группы №1, что достоверно больше такового для группы №2 - 77,2 ± 3,9 % (р 0,01 Student test). Таким образом, лечение препаратом STAZN привело, в среднем, к достоверному увеличению количества сохраненной мозговой ткани на 17 % по площади и « 15 % по объему, что позволяет говорить о выраженных нейропротективных свойствах исследуемого препарата (График 5).
На Графике 6 представлен расчетный размер потери нормальной ткани в пораженном полушарии по суммарной площади и объему. Таким образом, в процентном соотношении суммарная площадь потери нормальной ткани была на 53% меньше в группе лечения STAZN по сравнению с группой контроля DMSO (38,3 мм и 81,5 мм соответственно, р 0,01 Student test). Объем потери нормальной ткани в группе лечения STAZN по сравнению с группой контроля DMSO также был достоверно меньше на 52% (50,3 мм3 и 104,5 мм3 соответственно, р 0,01 Student test).
По полученным данным были построены частотные карты распространения нормальной ткани для каждой экспериментальной группы на 7 из 9 стандартных уровнях головного мозга (Рисунок 7А и 7Б), а также карта распространения области достоверной нейропротекции (Рисунок 7В).
Рисунки ЗА и ЗБ - частотные карты распространения нормальной ткани для группы контроля и лечения соответственно. Белый цвет соответствует присутствию нормальной ткани у 100% животных в данной области головного мозга на данном стандартном уровне, красный - 95%, черный - 0%.
Рисунок ЗВ - карта распространения области достоверной нейропротекции. Черный цвет - отсутствие достоверной нейропротекции в данной области головного мозга на данном стандартном гистологическом уровне. Графические данные представлены в виде (1.0 - р), то есть любой цвет соответствует р 0,05 (минимальный уровень достоверности), черный цвет означает отсутствие достоверной нейропротекции в данной области стандартного гистологического уровня.
Как видно из Рисунка 3, лечение экспериментальных животных препаратом STAZN приводит к выраженной нейропротекции и защите головного мозга от ишемии, особенно в области коры головного мозга, по сравнению с группой сравнения.
