Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аллогенные клапаны в сердечно-сосудистой хирургии (обзор литературы) 13
1. Применение аортальных и легочных аллогенных клапанов в сердечнососудистой хирургии 13
1.1. Первые пересадки аллогенных клапанов 13
1.2. Использование аллогенных клапанов, хранившихся в питательной среде 14
1.3. Начало использования аллографтов 18
1.4. Использование митральных аллографтов 20
2. Различные варианты технологической схемы изготовления аллографтов 24
2.1. Критерии отбора доноров 24
2.2. Забор и транспортировка донорского сердца и сосудов 24
2.3. Выделение клапанных и сосудистых аллографтов 25
2.4. Стерилизация аллографтов 27
3. Биологические аспекты криосохранения 29
3.1. Влияние замораживания на жизнеспособность клеток аллографта 29
3.2. Виды криопротекторной смеси 32
4. Биологические аспекты размораживания. Влияние скорости размораживания на жизнеспособность тканей аллографтов 33
5. Гистологическая и биохимическая структура клапанов сердца. Предпосылки развития кальциноза в имплантированном аллографте 34
6. Контроль качества аллографтов 36
7. Правовые, технологические и биологические проблемы при организации производства аллографтов 38
7.1. Организационные вопросы по изготовлению аллографтов 38
7.2. Контроль качества изъятых органов и тканей 40
7.3. Контроль стерильности готовых аллографтов 40
7.4. Биологические проблемы при имплантации аллографтов. Иммунитет 41
7.5. Жизнеспособность клеток аллографта 43
7.6. Кальцификация аллографтов 44
7.7. Проблема механической прочности аллографтов 47
8. Применение аллографтов в клинике приобретенных пороков сердца 48
9. Применение аллографтов в клинике врожденных пороков сердца 51
10. Применение артериальных и венозных аллографтов 53.
Глава 2. Технология изготовления криосохраненных клапанных аллографтов 55
1. Критерии отбора доноров 55
2. Методика забора ткани 56
3. Выделение клапанных аллографтов 58
4. Стерилизация аллографтов 60
5. Криосохранение 62
6. Хранение аллографтов 67
7. Транспортировка и подготовка к имплантации 67
8. Контроль качества аллографтов 69
9. Технология изготовления венозных аллографтов 72
Глава 3. Материал и методы исследования 75
1. Изучение жизнеспособности клеточных элементов клапанов 75
2. Выращивание культуры фибробластов 80
3. Девитализация аллографтов 80
4. Иммунолюминесцентный анализ гладкомышечных клеток 83
5. Определение упруго-прочностных свойств аллографтов 83
6. Оценка влияния криосохранения на гистологическую структуру аллографтов 84
7. Определение эффективности методов антикальциевой защиты аллографтов на модели подкожной имплантации 85
8. Цитотехнологическая модификация аллографтов клетками реципиента 85
9. Материал и методы клинического исследования 86
9.1. Клиническое применение аллографтов у больных с аортальным пороком 86
9.2. Клиническое применение аллографтов у больных с инфекционным эндокардитом трикуспидального клапана 88
9.3. Клиническое применение аллографта у больного с инфекционным эндокардитом митрального клапана 90
9.4. Клиническое применение аллографтов у больных с врожденными пороками сердца 91
10. Статистическая обработка результатов 92
Глава 4. Влияние технологии изготовления аллографтов на параметры жизнеспособности ткани 93
1. Исследование повреждающего действия длительного хранения аллографтов в питательной среде 95
2. Исследование влияния стерилизации на аллографты 99
3. Исследование влияния криосохранения на аллографты 103
4. Обсуждение полученных результатов 107
Глава 5. Влияние замораживания и размораживания на целостность структуры и механические свойства аллографтов 113
1. Влияние режимов криосохранения на гистологическую структуру аллографтов 113
2. Изучение влияния температуры размораживания на целостность криосохраненных аллографтов 119
3. Влияние криосохранения на упруго-прочностные свойства аллографтов 129
Глава 6. Иммунология аллографтов 132
Глава 7. Клиническое применение аллографтов у больных с приобретенными и врожденными пороками сердца 135
1. Операционные находки и техника операции у больных с приобретенными пороками сердца. 135
1.1. Использование аллографтов у больных с аортальным пороком 135
1.2. Результаты операций у больных с аортальным пороком и их обсуждение 140
2. Применение аллографтов у пациентов с инфекционным эндокардитом трикуспидального клапана. (Хирургическая техника имплантации, данные клинического обследования пациентов и результаты лечения) 148
3. Применение аллографтов при хирургическом лечении врожденных пороков сердца 159
3.1. Операционные находки и техника операций 159
3.2. Результаты и обсуждение 162
4. Клиническая апробация методики аллотрансплантации криосохраненного клапаносодержащего венозного аллографта 167
Глава 8. Результаты девитализации тканей апоптотическими и некротическими веществами 172
1. Изучение гибели клеток при обработке девитализирующими агентами, вызывающими некроз 172
2. Девитализация путем индукции апоптотической гибели клеток 178
Глава 9. Изучение кальцификации девитализированных аортальных клапанов 183
1. Кальцификация стенок и мышечной ткани аортальных клапанов сердца свиньи после обработки агентами, вызывающими некроз и апоптоз 183
1.1. Кальцификация стенок и мышечной ткани аортальных клапанов сердца свиньи после обработки агентами, вызывающими некроз 183
1.2.Изучение кальциноза стенок аорты свиньи, обработанных различными апоптотическими агентами 187
2. Изучение механизма снижения кальциноза стенок аорты после обработки ЭДТА 189
2.1. Снижение кальциноза мышечной ткани путем инкубации с ЭДТА или с дигитонином. 191
3. Обсуждение 192
Глава 10. Результаты заселения девитализированных аллографтов клетками реципиента 194
1. Получение культуры гладкомышечных клеток из аорты крысы линии Wistar 194
2. Адгезия гладкомышечных клеток к базальной мембране аорты и миграция в медию аорты 196
3. Адгезия и миграция клеток в створки и стенки девитализированных аллографтов клапанов сердца 196
4. Получение культуры миофибробластов из варикозных вен человека 200
5. Получение культуры эмбриональных фибробластов человека 201
6. Разработка роллерной установки для равномерного посева клеток на ткань аллографтов 202
7. Адгезия миофибробластов и эмбриональных фибробластов к стенкам сосудов и к створкам аллографтов в стационарных условиях 203
8. Адгезия миофибробластов и эмбриональных фибробластов к стенкам сосудов и к створкам аллографтов в условиях вращения кондуита в роллере 205
9. Изучение способности модифицированных и немодифицированных тканей клапанов сердца к кальцификации на модели подкожной имплантации крысам. Морфологические особенности тканей после 2 месяцев подкожной имплантации 206
Заключение 209
Выводы 213
Практические рекомендации 214
Список литературы 215
- Использование митральных аллографтов
- Исследование влияния стерилизации на аллографты
- Результаты операций у больных с аортальным пороком и их обсуждение
- Адгезия и миграция клеток в створки и стенки девитализированных аллографтов клапанов сердца
Введение к работе
Актуальность проблемы
Аллогенные протезы клапанов сердца прочно вошли в арсенал кардиохирургических центров, благодаря работам D.N. Ross, B.G. Barrat-Boyes, W.W. Angell,- M.F. O'Brien, В.И. Бураковского, Г.И. Цукермана, В.П. Подзолкова и других.
На сегодняшний день в ведущих кардиохирургических центрах накоплен обширный успешный опыт клинического применения аллогенных протезов.
Эти данные позволяют утверждать, что аллографты являются клапанами выбора у многих групп пациентов.
Параллельно клиническому использованию был выполнен обширный спектр исследований, описывающих физиологические, биохимические, биофизические, биомеханические, гистологические и ультраструктурные характеристики аллогенных биопротезов клапанов сердца на основных этапах их забора, изготовления, хранения, подготовки к имплантации и дальнейшего функционирования после имплантации.
Сейчас основные усилия исследователей сосредоточены на изучении судьбы имплантированных аллографтов у различных категорий пациентов, а также на улучшении качества аллогенных клапанов. В этом направлении заметны две отчетливые тенденции.
Во-первых, многие исследователи полагают, что иммунный ответ на пересаженный аллографт играет решающую роль в развитии кальцино-за и дегенерации протеза. Следовательно, подбор аллографта по антигенным свойствам для каждого конкретного пациента позволит решить проблему долговечности. (Moustapha A., Ross D. 1997, Shaddy R. 1997, Zhao X„ O'Brien M. 1994)
Другие авторы вообще не хотят принимать во внимание иммунологический статус пациента, так как они уверены, что межклеточное вещество мало иммуногенно, а клетки — основной иммуногенный материал - они предлагают удалить из ткани клапана, заселив их взамен собственными тканеобразующими клетками реципиента, которые впоследствии и будут обновлять коллагеновый каркас клапана. (Koolbergen D., Hazekamp М. 1995, 1997, O'Brien М. 1999,2000). Эта идея кажется еще более заманчивой, так как уже практически доказано, что донорские клетки после операции постепенно практически полностью элиминируются, замещаясь собственными клетками реципиента (Armiger L. 1997). Если гипотеза о самообновлении подтвердится, то мы получим практически идеальный тип биопротеза, живущий столько, сколько сам реципиент. На сегодняшний день в Центре имплантировано уже около 130 трансплантатов. Ре-
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ( КНМНОТЕКА 1
2Ъ%Ж
зультаты наблюдения за прооперированными больными на имеющихся сроках (до десяти лет) в основном удовлетворительные.
Однако анализ собственных клинических данных и сведений из доступных зарубежных публикаций по применению криосохраненных ал-лографтов ставит и много спорных, неясных вопросов, главными из которых являются:
В чем заключается роль клеток реципиента в ткани донорского клапана?
Степень биосовместимости трансплантата в зависимости от числа живых и погибших донорских клеток.
Факторы реципиента, которые необходимо учитывать при имплантации аллографта, чтобы обеспечить его долговечность.
Причины избирательной кальцификации стенки аорты трансплантата перед створками его же клапана.
Цель исследования:
Создание криосохраненных клапаносодержащих аллогенных трансплантатов для коррекции врожденных и приобретенных пороков сердца и венозных сосудов. Задачи исследования:
Обобщить опыт организации мелкосерийного производства и создания в НЦССХ банка криосохраненных аллографтов.
Обобщить данные экспериментальных исследований по изучению качества аллографтов.
Изучить влияние клеточных элементов донора и реципиента на долговечность аллографтов на основе экспериментальных данных.
Создать на основе проведенных исследований новый тип криосохраненных аллографтов, отвечающих основным требованиям кардиохирургов к этому типу биопротезов.
Анализ опыта применения аллографтов при различных врожденных и приобретенных пороках сердца.
Научная новизна исследования.
Настоящее исследование отражает один из этапов работы, проводимой в НЦССХ им. АН. Бакулева РАМН по разработке и внедрению в клиническую практику новых образцов биологических клапанов для кардиохирургии. В работе обоснована возможность комплексной оценки качества изготавливаемых криосохраненных аллогенных кондуитов с помощью применения методов определения жизнеспособности в сочетании с гистологическими и биомеханическими исследованиями. Выявлены критические параметры технологической схемы, влияющие на качество аллографтов. Получены методы внедрения клеток в матрикс аллографтов, получен новый тип аллографтов на основе методов тканевой инженерии.
Обобщен опыт клинического использования, аллографтов, изготовленных в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева, в сердечно-сосудистой хирургии. Практическая ценность и реализация результатов.
В результате всего комплекса научно-поисковых работ предложены аллогенные клапаносодержащие кондуиты, изготовленные по новой технологической схеме, с высокими.качественными параметрами.. Данные протезы внедрены в клиническую практику в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Дана оценка непосредственных и отдаленных результатов применения аллографтов, выявлены их недостатки и уточнены показания к применению. Положения, выносимые на защиту.
1. Криосохраненные клапаносодержащие аллографты аорты и ле
гочной артерии являются биологическими протезами, способными адек
ватно корригировать врожденные и приобретенные пороки сердца, веноз
ные аллографты также являются протезами выбора при лечении хрониче
ской венозной недостаточности нижних конечностей..
Предложенная технология изготовления криосохраненных трансплантатов позволяет без значительных повреждений сохранить клеточные элементы и матрикс аллографтов.
Цитотехнологическая модификация аллографтов позволяет улучшить их биосовместимость, в частности, снизить склонность к каль-цификации.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, из них 13 - в центральной печати. Их список прилагается. Апробация работы.
Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены:.
на 9 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 18-21 ноября 2003); на научно-практической конференции «Актуальные вопросы сердечно-сосудистой хирургии» (Н. Новгород, 2003 г.) на объединенной научной конференции отделений детей старшего возраста с ВПС, неотложной и реконструктивной хирургии ППС, отдела медицинской биотехнологии НЦ ССХ (15 января 2004 г.) Объем и структура исследования..
Диссертация состоит из введения, десяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, охватывающего 17 отечественных и 476 иностранных источников. Работа изложена на 250 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 70 рисунков.
Использование митральных аллографтов
До сих пор пересадка митральных аллографтов считается сложной процедурой, требующей не только виртуозной хирургической техники, но н тщательного подбора клапана по анатомическим критериям пациента История этих операций начинается одновременно с развитием применения аортальных н легочных аллографтов, но насчитывает гораздо меньшее число наблюдений.
Тем не менее можно проследить весь этот сложный путь, начиная от первых имплантаций до настоящего времени.
Разработка пересадки митрального клапана человека в митральную позицию началась в 60-х годах. В этот период развития вопроса призволилась пересадка свежих митральных клапанов, сохранявшихся в растворе антибиотиков. Были выполнены первые операции в эксперименте (Rastelli GC, 1962, Hubka М, 1965, 1966) и описаны теоретические вопросы имплантации ( Cachera et al., 1964, Van Viet PD, 1965). Впервые в клинической практике митральный аллографт в митральную позицию был имплантирован Senning А в 1967 г., однако результаты не оказались успешными. Ограниченный успех объяснялся сложностью забора, несовершенством методик сохранения и стерилизации клапанов, трудностями в методике подбора имплантанта и технике имплантации.
Повторно интерес к пересадке митрального аллографта возник в 80-х годах в связи с развитием метода крносохранения аллогенных клапанов. Первые результаты имплантации криосохраненных митральных аллографтов в митральную позицию, проведенные в начале 80-х годов, не были однозначными (Sievers НН, 1985, Bodnar Е, 1994). Наиболее раннее сообщение о серии из 3 имплантаций принадлежит Yancah Ch. 1984 год. Операции были выполнены по поводу ревматического порока митрального клапана. Непосредственный результат операции был отличным, ранний послеоперационный период протекал без осложнений, тромбоэмболии не было. Цветным допплером была выявлена минимальная регургитация, которая не прогрессировала. Объем регургитации не превышал 10% сердечного выброса Две ранние несостоятельности аллографтов (2 и 9 месяцев после имплантации аллографтов) были связаны с разрывом хорд, вызванным технической погрешностью и эндокардитом. Несостоятельность в отдаленном периоде (44 месяца) была вызвана разрывом надорванной сосочковой мышцы.
Позднейший, более пристальный интерес к методике и рост числа проведенных операций был связан с описанием теории функциональной целостности аппарата митрального клапана, успехами реконструктивной хирургии митрального клапана (Carpentier А, 1983), совершенствованием хирургической техники и рядом экспериментальных исследований.
Авторами этих исследований был сделан вывод о необходимости поддержать неизменной сосочково-хордально-створочную геометрию при имплантации митральнго аллографта.
В другом экспериментальном исследовании в пульсдупликаторе было рассмотрена гидродинамическая функция митрального аллографта при естественном расположении всех его элементов (Vetter НО., 1996). В течение стендовых испытаний не произошло нн одного разрыва ткани и недостаточности клапана Результаты измерения трансклапанных градиентов и эффективного отверстия оказались лучше, чем у стандартных свиных биопротезов диаметром в 25 мм.
В 1990-х годах была описана анатомия сосочковых мышц митрального клапана (Carpentier А, 1996, Victor S., 1995), целостность и механизм работы аппарата атриовентрнкулярных клапанов (Асаг С, 1996, Reardon M.J., 1999). Была описана и стандартизирована методика изготовления, хранения н техника имплантации митрального аллографта в митральную позицию (Carpentier А, 1995, Dory D.B., 1998, Conklin LD.,1999).
После описанных фундаментальных исследований значительно возрос интрес хирургов к этой операции. Появились сообщения о сериях успешных имплантаций. Так Carpentier А. (1996) описал серию из 43 имплантаций со средним отдалённым периодом в 14 месяцев и одной реоперацией, Gulbins Н. (2000) - серию из 10 операций со средним отдалённым периодом в 16 месяцев, Radu Deac (Targu-Mures, Romania) с 1989 года провёл 19 имплантаций со средним отдалённым периодом 72 месяца и двумя реоперациями.
Первоначально основным показанием к его иплантации был инфекционный эндокардит (Асаг С, 1995, Amado-Cattaneo R., 1998, Reardon M.J., 1999). Впоследствне, с накоплением опыта показания значительно расширились. Митральный аллографт стали применять при ревматических пороках МК (Асаг С, 1996, Yankah АС, 1995), отрыве хорд МК (Revuelta J.M., 1996), рестенозе МК, (Kumar AS., 1994), митральном волчаночном вальвулите (Chauvaud S.M, 1995). Отдельные хирурги (Plankett MD., 1998) получили отличные результаты имплантации аллографта у детей по поводу АВК, репротезирования механического клапана, ревматической недостаточности МК. Этот результат особенно интересен в связи с тем, что у детей тяжело дозировать непрямые антикоагулянты. Имеются сообщения об успешных уникальных операциях. Так, Асаг С. (1994) описал имплантацию митральных аллографтов одновременно в митральную и трикуспидальную позицию при остром инфекционном эндокардите МК и ТК, Khan J.H. (1999) протезировал аллографтом тяжёлый митральный стеноз.
Об успешной серии из 22 операций сообщил С. Асаг, 1996. Описания подобных операций принадлежат Revuelta J.M (1994) - два случая с хорошим результатом к 4 и 22 месяцам после операции, Dossche К., (1994) - один случай с хорошим результатом.
Таким образом, эта операция является сравнительно молодой. Интерес к ней всё возрастает. На сегодняшний момент описано в литературе 72 имплантацнн митрального аллографта в митральную позицию. Из них полными являются 47 аллографтов, а частичными - 25. Непосредственные результаты во всех случаях были отличными. В среднем отдаленном периоде до 3 лет результаты были хорошими, однако, имелись репротезирования Основной причиной их были технические ошибки при имплантации, инфекционный эндокардит, тканевая дегенерация. Сообщения о результатах в отдаленном периоде пока не приводятся, но достаточная прочность и высокие гемодинамнческие качества протеза позволяют надеяться, что они также будут хорошими.
В последнее десятилетие при невозможности пластики ТК появилась альтернатива механическим и биологическим протезам. Трикуспидальный клапан при приобретенных и врожденных пороках стали широко замещать мнтральны аллографтом, особенно при инфекционном эндокардите (Скопин И.И., 1999, Асаг С, 1994, Katsumata Т., 1997 и др.). Используемый протез имеет следующие преимущества: наиболее точно воспроизводится нормальная анатомия и функция замещаемого участка, обеспечивается естественный, физиологический поток крови, позволяет избежать антикоагулянтной терапии, более устойчив к инфекции благодаря стерилизации в антибиотиках, сохраняет анатомию и функцию трикуспидального клапана.
На данный момент в мировой литературе описано 17 случаев подобных операций. Katsumata Т. (1997) сообщил об успешной имплантации аллографта наркоману, Pomar J.L., Mestres С.А., (1999) описали серию из 5 имплантаций с отдалённым периодом в 5 лет. В двух случаях в отдалённом периоде выявлена выраженная регургитация, однако, все пациенты находятся в I функциональном классе по NYHA и при подобной этиологии авторы считают адекватным подходом имплантацию аллографта Интересное сообщение принадлежит Асаг С, (1994). У молодого пациента была проведена реконструктивная операция митрального и трикуспидального клапанов по поводу инфекционного эндокардита. Год спустя появился возвратный эндокардит, который не возможно было контролировать антибиотиками. Для замены МК и ТК были взяты два митральных гомографта Клинические и эхокардиографические данные к 4-му месяцу были отличными. A Prat (1998) описал случай инфекционного эндокардита трёхстворчатого и аортального клапанов, осложнённого врождённой фистулой между аортой и правым предсердием. Была выполнена операция Росса и протезирование трёхстворчатого клапана аллографтом. О хороших результатах 7 имплантаций митрального аллографта в трехстворчатую позицию сообщил A. Carpentier (1999).
Имеются сообщения об использовании данной процедуры при врождённых пороках сердца Hvass U. (1996) Lupoglasoff J.M. (1996) встретились с фистулой между правой коронарной артерией и правым желудочком, осложнившихся эндокардитом трикуспидального клапана В обоих случаях были ушиты фистулы и имплантирован митральный аллографт с отличным гемодинамическим эффектом к 6 месяцам.
Исследование влияния стерилизации на аллографты
До 2000 г. схема стерилизации аллографтов опиралась на данные Вирджинского тканевого банка и данные Института сердца и легких Великобритании и включала в себя высокие концентрации антибиотиков (в дальнейшем она рассматривается нами как «жесткая» схема).
На этапе стерилизации аллографтов в растворе антибиотиков можно было ожидать повреждения клеток вследствие известных циттоксических свойств применяемых препаратов. Поэтому нами была предложена так называемая «мягкая» схема стерилизации, включающая в себя ряд новых антибиотиков и низкие концентрации ранее используемых препаратов. В предварительных опытах наряду со стандартным раствором были изучены растворы со сниженным содержанием антибиотиков. Путем подбора были определены минимальные концентрации препаратов, при которых обеспечивалась микробиологическая стерильность обрабатываемого материала Введение в схему стерилизации ципрофлоксацииа диктовалось необходимостью элиминации возможных внутриклеточных микроорганизмов, а противогрибковый антибиотик позволял надежно исключить обсеменение грибковой флорой. Целесообразность этих включений обсуждалась нами в главе 2.
Содержание антибиотиков в стандартном ("жесткая" схема) и модифицированном ("мягкая" схема) стерилизующем растворе приведены в табл. 3.
Скорости дыхания для свиных клапанов, доставленных через б часов после забоя животного, имеют более высокие показатели, чем у клапанов человека, забранных спустя 24 часа после смерти доноров. Это объясняется повреждающим действием тепловой ишемии, более продолжительной в случае забора человеческого материала
При изучении клеточного дыхания фибробластов после стерилизации по стандартной схеме ("жесткая" схема), включающей высокие концентрации антибиотиков, мы пришли к выводу о том, что применяемые концентрации антибиотиков оказывают выраженное повреждающее действие на фибробласты аллографта
После обработки клапанов модифицированным стерилизующим раствором, содержащим сниженные концентрации антибиотиков ("мягкая" схема), повреждающее действие было явно слабее по сравнению с "жесткой" схемой.
Исследованию пролиферативной активности подвергались б свиных клапанов, хранившихся до начала исследования в питательной среде при 4С в течение 12 часов.
Рост культуры ткани показал, что чем выше была дыхательная активность, тем больше доля жизнеспособных клеток в ткани, тем раньше появлялись зоны распластанных клеток вблизи эксплантатов и вырастал плотный монослой. После стерилизации в среде с низким содержанием антибиотиков при эндогенном дыхании 10-30 мМ02/мг мин появление распластанных клеток наблюдалось через 3 дня, происходило активное деление клеток и через 5 - 7 дней вырастал плотный монослой. Начало активного роста сопровождалось закислением среды в культуре в течение 1-2 суток от 7,4 до 6,8 - б . При более низком дыхании появление распластанных клеток начиналось через 5-7 дней и образование монослоя клеток происходило через 10-15 дней.
После "жесткой" стерилизации в среде с большим содержанием антибиотиков эндогенное дыхание было подавлено я слабо стимулировалось сукцннатом (см. данные определения поглощения 02 выше). Отдельные распластанные клетки появлялись только через 2-3 недели, однако нх рост был подавлен, монослой не образовывался, н через месяц наблюдалась деградация клеток.
Результаты операций у больных с аортальным пороком и их обсуждение
Госпитальная летальность составила 6% (4 больных). Одна больная 11 лет после ранее выполненной баллонной вальвулопластики была оперирована по неотложным показаниям в связи с прогрессирующей сердечной недостаточностью на фоне септического синдрома В гемокультуре получен Staureus. Больной было выполнено протезирование восходящего отдела аорты с расширением фиброзного кольца Больная погибла на операционном столе от острой сердечной недостаточности. На аутопсии были обнаружены множественные абсцессы миокарда желудочков. Второй больной 37 лет с протезным эндокардитом, перенесший ранее репротезнрование по поводу эндокардита погаб на операционном столе также после протезирования восходящей аорты. Причиной смерти явился острый инфаркт миокарда вследствие перикоронарной гематомы правой коронарной артерии. Третья больная погибла от острой сердечной недостаточности на фоне тяжелой ИБС, четвертая больная погибла от разрыва аневризмы головного мозга. Остальные 56 больных после классической субкоронарной, "цилиндрической н свободной имплантации аллографта были выписаны в удовлетворительном состоянии. Средний срок стационарного лечения в послеоперационном периоде составил 18,9 дня (10 - 28 дней). Одному больному в госпитальном периоде в связи с полной атриовеитрикулярной блокадой имплантирован электрокардиостимулятор. Данные по непосредственным результатам операций представлены в таблице.
По данным чреспищеводной эхокардиографии во время операции регургитация на аллографте отсутствовала у 33 больных н не превышала 1 степени - у 5. Трансторакальное эхо-исследование в послеоперационном периоде выявило возникновение регургитации еще у одного больного. У него через 5 дней после операции была обнаружена несостоятельность проксимальной линии швов в зоне правого коронарного синуса на протяжении 2 см. Отслоение основания аллографта вызвало также нарастание средне-систолического градиента до 22 мм Hg. Однако в связи с отсутствием гемодннамнчески значимых нарушений больной был выписан. При дальнейшем наблюдении больного в течение 2,5 лет основание аллографта стало неподвижным, хотя небольшой диастаз с фиброзным кольцом сохраняется. Створки аллографта тонкие н подвижные. Регургитация на нем не превышает 1 степени, а средне-систолический градиент не превышает 7 мм Hg.
При анализе субкоронарной методики имплантации в раннем послеоперационном периоде выявлены следующие закономерности. (Таблица 13 )
У одной больной, оперированной в стадии активного эндокардита по методике Росса («свободный корень» о узловыми швами), отмечалось сохранение субфебрнльиой температуры тела в течение нескольких недель после операции. В связи с тем, что трансторакальное и чреспшцеводное эхо-исследование не выявило вегетации и утолщений на створках и фиброзном кольце, больная была выписана с условиями постоянной антнбиотикотерапии, подобранной в нашем Центре, под наблюдение кардиолога по месту жительства В течение 7 месяцев у нее отмечалось постепенное ухудшение самочувствия, нарастание лейкоцитоза, однако изменений на клапане не выявлялось. Посевы крови роста микроорганизмов не дали. В связи с ухудшением состояния больной неоднократно проводилось трансторакальная эхокарднография, которая также ие давала ответа на вопрос о причинах повышения температуры. В течение 8 месяца после операции у больной стали резко нарастать одышка, признаки сердечной недостаточности, в связи с чем она была повторно обследована в нашем Центре. Чреспшцеводное эхо-исследование выявило наличие формирующегося абсцесса фиброзного кольца пересаженного аллографта н деструкцию створок, Поставлен диагноз протезного эндокардита, в связн с чем больная была повторно оперирована Аллографт, имплантированный ранее, был иссечен, а вместо него имплантирован другой аортальный, аллографт. Послеоперационное течение гладкое. В удовлетворительном состоянии больная выписана
Средний срок наблюдения после операции составил 23,7 месяца (14-36 мес). Все больные находятся в удовлетворительном состоянии н ведут активный образ жизни, Рецидивов инфекции не отмечено.
По данным ЭхоКГ нн в одном случае не отмечено склерозирования створок аллографта н нарастания регургнтацин или стенознрования. У 10 больных средне-систолический градиент не превышает 7 мм Hg. У одной больной после сопутствующего иссечения подклепанной мембраны он составляет 15,3 мм Hg.
Никто из больных антикоагулянты не получает. При этом эмболических осложнений не отмечено.
Отдаленные результаты применения аллографтов при лечении пороков аортального клапана представлены в таблице.
Что касается результатов после операции Росса, то в этом случае отмечается отсутствие регургвтации на аутографте в аллографте у всех пациентов. Ни у одного из них не выявлено гемодинамнчески значимого изменения градиента систолического давления на аллографте. Средне-отдаленные результаты после операции признаны хорошими.. Срок наблюдения составил от 3 до 32 месяцев (ср. 14 месяцев).
Обсуждение.
Согласно современным представлениям лечение активного инфекционного эндокардита начинается о активной консервативной терапии. При возможности операцию выполняют после купирования инфекции.
В активной стадии процесса поражение аортального клапана часто сочетается с поражением перивальвулярных структур, других клапанов сердца, формированием абсцессов фиброзного кольца Протезирование клапана механическими протезами в этих условиях повышает риск рецидива инфекция, развития парапротезных фистул в необходимости реоперации до 33%. Использование ксенобиопротезов не снижает частоты этих осложнений. Предложены различные варианты операций при обширной деструкции фиброзного кольца аортального клапана, включающие транслокацию протеза, протезирование восходящей аорты, имплантацию бескаркасных аллографтов. Живые криосохраненные клапанные аллографты имеют теоретические и практические преимущества при протезировании аортального клапана в условиях активного эндокардита. Во-первых, отсутствие синтетического материала в инфицированных тканях снижает риск реинфекцнн. Иследовання группы Барратт-Бойза(1989) и других авторов показали, что риск раннего протезного эндокардита после имплантации аллографтов существенно ниже, чем при механических в ксевобиологвческих протезах. Вторым важным, преимуществом бескаркасных аллографтов является их эластичность, что создает возможность заполнения мертвого пространства в зонах деструкции и репарация воспалительного очага. Несомненно, что такие моменты, как ламинарный центральный кровоток в двурядный шов при имплантации также играют роль в профилактике реинфекцнн и последующих осложнений. Примером этому может служить одно из наших наблюдений, когда в зоне проксимальных швов в раннем послеоперационном периоде наступило их прорезывание, однако гемодинамическнх нарушений не произошло, а в последующем наступила нормализация функции клапана, хотя сохраняется небольшое отслоение аллографта. Это наблюдение убедило вас в целесообразности выполнения проксимальной лвнии отдельными П-образнымя швами в случаях вовлечения в процесс фиброзного кольца В нашей практике мы столкнулись с одним случаем протезного эндокардита после операции протезирования «свободным корнем» по методике Росса. По всей видимости, это связано с тем, что было произведено недостаточно полное иссечение пораженных тканей, особенно учитывая то обстоятельство, что больная оперирована в активной фазе эндокардита
Жизнеспособность ткани аллографта играет важную роль в повышении резистентности его к инфекции. Наши исследования (неопубликованные данные) показали, что не только фибробласты створок после процесса криосохранення, но н фибробласты адвентиции аорты сохраняют жизнеспособность н дают рост в клеточной культуре. Это также, вероятно, повышает устойчивость аллографта к инфицированию.
Адгезия и миграция клеток в створки и стенки девитализированных аллографтов клапанов сердца
Оценивали, насколько девитализация стенок и створок клапанов различными воздействиями влияет на способность гладкомьппечных клеток из аорты крысы прикрепляться и мигрировать в них. Такая оценка может бьггь предварительным тестом на биосовместимость обработанных аллографтов с клетками хозяина
Кинетику адгезии оценивали количественно по убыли клеток из суспензии над образцами ткани, расположенной на дне лунок культуральных планшетов. На рис. 54 показана кинетика адгезии клеток к поверхности лунок полнстиролового культурального планшета, к стенкам клапанов сердца свиньи, обработанных раствором трипсина и вер-сена, с последующей отмывкой и обработкой нуклеазами (по Teebken et al.), инкубированных с дистиллированной водой с последующей обработкой эндонуклеазами (по O Brien et al.), обработанных трипсином с ЭДГА, с дигитонином н ультразвуком б часов и далее с эндонуклеазами, а также после инкубации с SDS и ультразвуком б часов, последующей отмывки (24 часа) и обработки нуклеазами.
Видно, что во всех вариантах кроме обработки с использованием SDS наблюдается быстрое (не более 20 мин, из которых около 10 мин уходит на седиментацию клеток) прикрепление клеток к обработанным поверхностям. В случае обработки с использованием SDS клетки не прикреплялись и погибали. Если учесть, что ткани отмьтали от SDS длительно (до 24 ч), то это показывает достаточно прочное связывание детергента с матриксом и токсичность такого матрнкса для клеток.
Обработка дигитонином или ЭДТА в отдельности (рис. 55), как и вместе с трипсином, нуклеазами не приводит к токсичности матрнкса Исследование миграции гладкомышечных клеток, полученных из аорты крыс линии Wistar. в стенки и створки клапанов сердца свиньи после различной обработки показало, что в первые сутки клетки находились на поверхности ткани (рис. 56). Через 2 суток после посева наблюдалась миграция клеток в ткань стенок н створок клапанов сердца на глубину 40-60 мкм.
Проникновение клеток в ткань оценивали по расстоянию между клетками на поверхности и в глубине ткани под ними, которое определяли по нониусу микроскопа. При этом наблюдали митозы, что свидетельствует о пролиферации клеток (рис. 57). Это наблюдали при всех обработках, кроме использования SDS. Через 4 суток клетки проникали на большую глубину.
Например, в стенки клапанов, обработанные дигитонином, гладко мышечные клетки мигрировали на 120 мкм, в лепестки на 40 мкм. После апоптотнчсской гибели донорских клеток свиньи, инициированной 2 мМ ЭДТА, гладкомышечные крысиные клетки на 4 сутки после посева мигрировали вглубь стенок клапанов на 120 мкм, вглубь лепестков - на 40 мкм. Гибели гладкомышечных клеток после посева на обработанные ткани не отмечалась. В данной серии опытов мы не добивались многослойного роста клеток в ткани и не использовали для этого перфузионных методов культивирования. Тем не менее при высокой плотность популяции клеток после посева клетки длительное время (не менее 10 суток) сохраняли жизнеспособность, способность к миграции, пролиферации. Это указывает на возможность сохранения посеянных на ткани клеток в ходе операции имплантации тканей.
