Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Анализ литературных данных по декстранам и полиальдегиддекстранам 8
1.1 Актуальность использования полиальдегиддекстранов для получения фармацевтических препаратов 8
1.2 Декстраныи способы их получения 9
1.3 Производственная линия получения клинического декстрана 17
1.4 Методы получения полиальдегиддекстранов окислением декстранов 20
1.4.1 Окисление декстранов йодной кислотой и периодатами щелочных металлов 20
1.4.2 Окисление декстранов у-излучением 23
1.4.3 Окисление декстранов перманганатом калия
1.5 Молекулярная структура и механизм реакции получения ПАД 27
1.6 Аналитические методы определения количества карбонильных групп 33
в полиальдегиддекстранах 33
ГЛАВА 2 Расчет кинетических и термодинамических параметров процесса окисления декстрана перманганатом калия 36
2.1 Определение термодинамических параметров модели окисления декстрана перманганатом калия 36
2.2 Определение кинетических параметров модели окисления декстрана перманганатом калия 40
2.3 Влияние высокой молекулярной массы декстрана на параметры модели окисления декстрана перманганатом калия 42
ГЛАВА 3 Экспериментальные исследования процесса окисления декстрана в лабораторных условиях 47
3.1 Объекты и методы исследования процесса окисления декстрана
3.2 Определение влияющих параметров в контрольных технологических точках процесса получения ПАД 49
3.3 Приготовление клинических декстранов, ПАД и конъюгатов ПАД с 2,4-динитрофенилгидразином и флуоресцеином 50
3.4 Определение содержания альдегидных групп в ПАД 53
3.5 Определение времени полуреакции процесса окисления декстрана 58
3.6 Определение количества окислителя (КМп04) в реакции 62
получения ПАД 62
3.8 Определение режима кислотности реакции окисления декстранов перманганатом калия 71
3.9 Физико-химический анализ структуры и состава декстранов, полиальдегиддекстранов и их конъюгатов (ИК-спектроскопия, УФ-спектроскопия, ПМР, ЯМР 13С, ВЭЖХ) 76
3.10 Очистка продуктов реакции ПАД с флуоресцеином 86
ГЛАВА 4 Исследование процесса окисления декстрана в условиях опытно-промышленного производства 90
4.1 Определение оптимальных параметров процесса окисления декстрана в промышленном реакторе 91
4.2 Определение зависимостей окисления декстрана перманганатом калия в условиях промышленного реактора 96
4.3 Очистка ПАД от диоксида марганца фильтрованием 99
4.4 Рекомендации по выбору аппаратурно-технического исполнения производственной линии получения ПАД 106
Основные результаты работы по список сокращений 111
Список литературы 112
- Методы получения полиальдегиддекстранов окислением декстранов
- Определение кинетических параметров модели окисления декстрана перманганатом калия
- Приготовление клинических декстранов, ПАД и конъюгатов ПАД с 2,4-динитрофенилгидразином и флуоресцеином
- Определение зависимостей окисления декстрана перманганатом калия в условиях промышленного реактора
Введение к работе
Актуальность темы. В современной медицине широкое применение нашли препараты на основе декстранов - природных полисахаридов биологического происхождения. К ним относят сульфат декстрана, диэтиламиноэтилдекстран, комплекс железо-декстран, гидрогели на основе декстрана. В качестве плазмозамещающих препаратов в клинической практике используют водные растворы декстранов: реополиглюкин, полиглюкин и др. В настоящее время одним из перспективных веществ на основе декстрана для создания новых фармацевтических препаратов являются окисленные декстраны, а именно полиальдегиддекстран (ПАД).
Разработка технологии получения ПАД способствует решению задач создания высокотехнологичного отечественного промышленного фармацевтического комплекса и повышения лекарственной независимости страны, определенной федеральной целевой программой «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».
Наибольшее применение в практике получения
полиальдегиддекстранов получили два метода: химический - с использованием периодатов щелочных металлов, и физический - с применением жесткого гамма-излучения. Основными недостатками существующих процессов окисления являются: необходимость применять трудозатратные процессы очистки конечного продукта от неорганических йодпроизводных, наличие которых ограничивает применение ПАД в медицине, нестабильность структуры получаемых физическим методом полисахаридов.
Учитывая недостатки существующих методов синтеза ПАД, разработка нового метода получения ПАД и создание технологии окисления декстранов для получения конкурентоспособных фармацевтических препаратов являются актуальным.
Исследования по разработке технологии получения полиальдегиддекстранов проводились в рамках реализации Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» по государственному контракту № 16.522.12.2001 «Разработка технологии и создание опытного производства окисленных декстранов».
Цель исследования - разработка технологического процесса окисления декстранов при применении перманганата калия в качестве окислителя.
Задачи исследований:
1. Исследовать закономерности процесса окисления декстранов перманганатом калия.
2. Разработать методику оценки качества получаемого окисленного
декстрана.
3. Изучить влияние технологических параметров процесса
окисления декстранов (количество окислителя, температура, рН) на
свойства получаемых ПАД.
4. Определить технологические режимы процесса получения
окисленных декстранов в условиях опытно-промышленного
производства и разработать практические рекомендации по применению
результатов работы в производстве ПАД.
Объект, предмет и методы исследования. Объектом исследования
является процесс получения ПАД с использованием перманганата калия.
Предметом исследования являются параметры, влияющие на
эффективность окисления (температура, рН, количество окислителя).
В процессе выполнения работы были использованы
экспериментальные и расчетно-аналитические методы, методы
теоретического и компьютерного моделирования.
Научная новизна работы:
1. Выполнено научное обоснование технологии получения ПАД с
использованием в качестве окислителя перманганата калия,
обеспечивающей выпуск продукта высокого качества.
2. Установлены зависимости выхода ПАД и количества окисленных
групп в ПАД от технологических параметров процесса окисления,
позволяющие оценить степень их влияния на свойства целевого
продукта.
3. Разработана теоретическая модель процесса окисления ПАД,
учитывающая различие в энергиях окисления глюкозных колец,
позволяющая определять степень их окисляемости и поведение при
окислении.
Теоретическая и практическая значимость:
-
Разработана методика определения содержания альдегидных групп для оценки качества получаемых ПАД.
-
Разработан способ окисления декстрана, который позволил обеспечить требуемое качество продукта с заданной производительностью.
-
Разработана технологическая схема производства ПАД.
-
Разработаны и внедрены в опытно-промышленное производство окисленных декстранов ОАО «ФНПЦ «Алтай» практические рекомендации по получению ПАД.
5. Результаты работы положены в основу при создании
противотуберкулезного лекарственного препарата в рамках реализации
федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и
медицинской промышленности Российской Федерации на период до
2020 года и дальнейшую перспективу» по государственному контракту
14.N08.12.0007 «Доклинические исследования противотуберкулезной
фармацевтической композиции на основе коньюгата гидразида изоникотиновой кислоты и декстрана».
Положения, выносимые на защиту:
-
Зависимости производительности процесса окисления и качества ПАД от технологических параметров.
-
Способ окисления декстрана перманганатом калия для получения ПАД.
3. Теоретическая модель процесса окисления декстрана,
учитывающая различие в энергиях окисления глюкозных колец
декстрана и высокую молекулярную массу объекта.
4. Методика определения содержания альдегидных групп для
оценки качества получаемых ПАД.
Личный вклад автора. Разработка плана исследований,
проведение экспериментальных исследований и теоретического моделирования процесса окисления декстранов, обработка полученных данных, обсуждение результатов, формулировка выводов, подготовка публикаций по теме диссертационной работы.
Апробация работы. Основные положения диссертации
обсуждались на III-ей Всероссийской школе-семинаре для студентов,
аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и
перспективы» (Россия, г. Белгород, 2010 г.), VII-й Всероссийской
научно-практической конференции «Управление качеством
образования, продукции и окружающей среды» (Россия, г. Бийск, 2013 г.), кафедре «ТГВ ПАХТ» БТИ АлтГТУ, НТС ОАО «ФНПЦ «Алтай», общих семинарах ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН.
Публикации. Всего по теме диссертации опубликовано шесть печатных работ, в том числе один патент РФ, и три статьи в изданиях, входящих в перечень рецензируемых изданий и журналов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах печатного текста и проиллюстрирована 9 таблицами, 54 рисунками. Работа состоит из четырех глав. В списке цитируемой литературы указано 165 источников.
Методы получения полиальдегиддекстранов окислением декстранов
Декстраны - представители гомополимеров целлюлозы с преимущественным содержанием а-(1-6) связей (50-97) % [1]. На рисунке 1.1 показана структура части основной цепи декстрана, содержащей разветвление на 2, 3 и 4 атомах углерода глюкозных циклов с образованием ответвлений а-(1-2), а-(1-3), а-(1-4) боковых цепей соответственно. Степень и характер ветвления цепи полимера в основном зависит от штамма бактерий-продуцентов [2, 3]. Способность синтезировать содержащую декстран слизистую массу из сахарозы была открыта Луи Пастером в 1861 г. у бактерий, позже названных «Leuconostoc mesenteroides». В дальнейшем способность синтезировать декстран была обнаружена у штаммов Streptococcus и некоторых других [4, 5]. Наиболее изучены среди известных образцов декстрана фракции, полученные от штамма бактерий Leuconostroc mesenteroides (в частности Leuconostroc mesenteroides NRRL В-512(F)), что обусловлено коммерческой доступностью препарата и важностью для медицинского применения ввиду высокого содержания а-(1-6) связей [6]. Современный процесс получения коммерческих декстранов заключается в кислотном гидролизе неорганическими кислотами нативных декстранов, полученных из продуктов жизнедеятельности бактерий, и дальнейшем фракционировании водорастворимых фаз в целях получения чистых продуктов с заданной средней молекулярной массой (Mw) [7]. В таблице 1 приведены примеры составов цепей нескольких фракций декстрана, произведенных различными штаммами бактерий [8, 9].
S mutants 6715 + 64 36 S mutants GS5 + 70 30 S downei + 90 10 Предварительные данные о структуре декстранов можно получить методами оптического вращения, инфракрасной спектроскопии и в реакциях окисления периодатами щелочных металлов по методу Смитта [10], а более детальные структурные данные применением реакции метилирования [11]. Процесс заключается в метилировании гидроксильных групп декстранов в присутствии йодистого метила с предварительной их активацией метилсульфонилметилом натрия (рисунок 1.2).
Метилированные декстраны полностью гидролизуются неорганическими кислотами в соответствующие различные моносахариды, которые далее восстанавливаются боргидридом натрия и переацетилируются ангидридом уксусной кислоты. Полученные ацилпроизводные моносахаридов разделяются методом газовой хроматографии и идентифицируются по времени удержания. В частности, комбинированная капиллярная газожидкостная хромато-масс спектрометрия (ГЖХ-МС) является эффективным методом для определения структуры декстрана [12, 13]. Помимо выше перечисленных методов, данные о структуре могут быть получены с использованием деградирующих ферментов, тонкослойной хроматографии, ВЭЖХ и ЯМР-спектроскопии 13С [14, 15]. Однако при использовании таких методов необходимо проводить трудоёмкую химическую модификацию декстранов и расщепление на составляющие компоненты, подразумевающие необратимое разрушение исследуемого образца.
Применение физико-химических методов ЯМР- и ИК-спектроскопии позволяет получить необходимые структурные данные без модификации или разрушения образца. Более того, метод ЯМР, по сравнению с прочими методами анализа, дает более подробную информацию о структуре полисахарида [16, 17]. Для ЯМР-спектров, снятых в растворе дейтерированного растворителя ДМСО-D6, химические сдвиги атомов водорода и углерода глюкозного цикла декстрана, имеющего а-(1-6) гликозидную связь, имеют следующие значения: протоны гидроксильных групп, находящиеся у соответствующих атомов углерода 4.10-4.12 м.д. (ОН2), 4.51-4.52 м.д. (ОНЗ) и 4.63-4.64 м.д. (ОН4) [18, 19]. В спектре
ЯМР- С находятся шесть сигналов, соответствующие углеродным атомам глюкозных циклов основной цепи декстрана. Атомам углерода соответствуют следующие значения химических сдвигов: С1 - 98.9, С2 - 72.5, СЗ - 74.1, С4 -71.0, С5 - 71.1, С6 - 67.1 [20]. В дополнение к сигналам основной цепи, при наличии высокого содержания боковых цепей в структуре, могут быть установлены и сигналы разветвлений. На ЯМР-спектре декстрана, полученного от штамма бактерий Lm NRRL B-512F, помимо химического сдвига а-(1-6) атома углерода, есть также два малоинтенсивных сигнала при 84,4 м.д. и 100,5 м.д., принадлежащие атомам углерода СЗ и С1 связи а-(1-3) соответственно. Ранее с использованием метода на основе реакции метилирования в декстране, полученном от штамма бактерий Lm NRRL B-512F, было установлено наличие 5% связей а-(1-3) [21].
Определить среднюю молекулярную массу полимера можно методами ультрацентрифугирования, малоуглового рассеяния нейтронов, рассеяние лазерного излучения, оптического рассеяния и вискозиметрии [22]. Метод концевых групп и осмометрический мембранный метод дают информацию о величине средней молекулярной массы полимера. Нативный декстран, как правило, обладает высокой средней молекулярной массой-порядка (0,5-9)-106 кДа и высокой полидисперсностью [23, 24]. Полидисперсность нативного декстрана, полученного от одного штамма бактерий, возрастает вместе с молекулярной массой, что обусловлено увеличением количества боковых цепей. Наибольший интерес для исследований представляет распределение фракций с различными молекулярными массами, полученными от одного штамма бактерий [25]. Такие данные можно получить с применением гель-проникающей хроматографии (ГПХ, SEC) с детектором молекулярной массы. Время удержания фракции напрямую зависит от молекулярной массы молекул в ней и увеличивается пропорционально. На рисунке 1.3 показана ГПХ хроматограмма частично гидролизованного неорганическими кислотами нативного декстрана, полученного от штамма бактерий Lm NRRL B-512F.
Физико-химические свойства, такие как вязкость или величина оптического вращения, водных растворов декстрана имеют сложный характер и в значительной степени зависят от молекулярной массы растворенного декстрана и концентрации раствора. Молекулы декстрана с молекулярной массой ниже 2000 Да имеют близкое к линейному строение полимерной цепи, вследствие чего для них зависимость вязкости от концентрации раствора линейна [26]. Исследования методом малоуглового рентгеновского излучения растворов декстранов с молекулярной массой более 2000 Да показали, что молекулы в них находятся в виде глобул и не сочетаются между собой механически [27, 28]. При определённых концентрациях разветвлённые молекулы декстрана с молекулярной массой более 20 кДа переплетаются между собой, образуя четвертичные структуры в виде более плотных глобул. Основное следствие из возникновения процесса межмолекулярного механического взаимодействия молекул декстрана друг с другом это появление у растворов с высокой концентрацией свойств неньютоновских жидкостей [29, 30]. Одним из простых методов оценки размеров молекул декстрана в растворе является радиус инерции молекулы. С увеличением молекулярной массы вещества возрастает и радиус инерции, в тоже время повышение концентрации вещества без изменения его молекулярной массы или появление примесей снижают его радиус инерции [31]. Нативные декстраны, ввиду особенностей нерегулярного строения их полимерной цепи, в основном аморфные. Тем не менее удается получить пластинчатые монокристаллы сокристаллизацей из растворов вода/полиэтиленгликоль при Т = 120-200 С [32]. Исследование монокристаллов декстрана комбинированными методами электронной и рентгеновской дифракции показывает, что элементарная ячейка состоит из двух остатков глюкопиранозных колец от двух антипараллельно расположенных полимерных цепей [33].
Определение кинетических параметров модели окисления декстрана перманганатом калия
Полученные данные для констант реакции Кон и К указывают на существование в молекуле декстрана глюкозных колец с различной энергией и склонностью к окислению в зависимости от их местоположения в молекуле. Глюкозные кольца в молекуле декстрана, находящиеся в конце основной цепи или её разветвлений, более склонны к окислению, чем глюкозные кольца в середине молекулы. Таким образом, в молекуле декстрана можно выделить два типа связей при окислении перманганатом калия - легко окисляемые и трудно окисляемые.
Среднюю степень окисленности молекул ПАД (Охср) после окончания реакции можно выразить через величины: побщ - общее среднее число глюкозных остатков, в том числе окисленных, в молекуле ПАД; и0х - среднее количество окисленных глюкозных остатков в молекуле ПАД:
Во всех экспериментах по окислению декстрана перманганатом калия используется недостаток окислителя по отношению к количеству окисляемых глюкозных колец. Концентрация кислоты в процессе окисления уменьшается, поэтому для поддержания постоянного значения рН её количество также берут в избытке. Основываясь на используемых допущениях, можно сделать вывод, что процесс окисления проходит как реакция первого порядка по окислителю. И учитывая наличие различающихся по реакционной способности глюкозных колец, степень окисленности можно вычислить через уравнения: Охср = а-п по\ (9) где аир- коэффициенты пропорциональности для легко- и трудноокисляемых глюкозных колец (зависящие от структуры, степени разветвленности декстрана); пох nox количество легко- и трудноокисляемых глюкозных колец соответственно.
В соответствии с предложенной математической моделью и учитывая прямую зависимость расхода окислителя от содержания альдегидных групп в ПАД, при низких концентрациях окислителя зависимость количества окисленных глюкозных колец (п0х) в ПАД от количества используемого окислителя (пКМп0 ) может быть представлена в первом приближении как параметрическое линейное уравнение:
Показатели коэффициентов а и /? зависят от значения соотношения количества используемого окислителя и количества легкоокисляемых глюкозных остатков в составе исследуемого декстрана. Искомые коэффициенты могут быть найдены экспериментальным путем для конкретного типа декстрана.
Коэффициенты аир являются уникальными для каждого из декстранов, полученных от различных штаммов бактерий или с помощью способов гидролиза, проводимых в целях снижения молекулярной массы продукта. Вычисление коэффициентов аир это трудоемкая задача с применением эмпирических данных. Так как мы определили реакцию окисления декстрана перманганатом калия, как реакцию первого порядка, то скорость её прохождения Vv, или скорость образования альдегидных групп можно выразить уравнениями:
Известно, что ввиду своей природы высокомолекулярные соединения в водных растворах не всегда подчиняются законам идеальных молекул. Отклонения, к примеру, в уравнениях Вант-Гоффа для высокомолекулярных соединений могут иметь значительный характер и обусловливать не ньютоновский характер поведения. Для определения характера влияния высокой молекулярной массы на кинетические параметры процесса окисления декстранов был выполнен расчет минимизации потенциальной энергии и определена зависимость последней от конформации молекулы. В расчетах зависимости потенциальной и полной энергий молекулы декстрана от пространственной конфигурации была использована молекула декстрана с молекулярной массой около 4 кДа. Первичную минимизацию энергии молекулы декстрана проводили в математическом базисе ММ2, предназначенном для расчёта s— и р элементов, имеющих гибридные орбитали. Молекулярную динамику рассчитывали в математическом базисе РМЗ, учитывающем влияние окружающей среды (растворителя) и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия внутри объекта. Градиент температуры 0-78 С (конечная точка с температурой 93 С), шаг итерации температуры 0,5 С. Для более точного определения молекулярной динамики брали по пять точек энергии на точку итерации температуры. Процесс изменения конформации молекулы декстрана в порядке увеличения температуры представлен на последовательности рисунков 2.2, 2.3 и 2.4, и соответствует о, температурам 0, 78 и 93 С соответственно.
Как видно из приведенных на рисунках конформации, молекула декстрана с увеличением температуры стремится изменить свою вторичную структуру от линейной к глобулярной. Изменение пространственной упаковки происходит не линейно и в значительной степени ускоряется с увеличением температуры. В процессе «схлопывания» молекула декстрана проходит конформацию правозакрученной спирали (Т = 351 К), что, по-видимому, объясняется a-D-формой глюкозных колец. Таким образом, с увеличением температуры происходит уменьшение количества легкодоступных для окисления глюкозных колец, приводящее к снижению реакционной способности молекулы декстрана и, как следствие, к отклонению от модели идеальной молекулы в расчетах уравнений. С изменением конформации молекулы декстрана от линейной к глобулярной потенциальная энергия линейно уменьшается, происходит экспоненциальный рост полной энергии молекулы за счет возрастания кинетической энергии в системе (рисунки 2.5 и 2.6).
Приготовление клинических декстранов, ПАД и конъюгатов ПАД с 2,4-динитрофенилгидразином и флуоресцеином
Зависимость времени полуреакции процесса окисления декстранов перманганатом калия от температуры, рассчитывали с учетом равенства начальных концентраций КМГ1О4 для каждого из экспериментов. В качестве начальной точки (tt) было взято значение времени полуреакции и температуры первого эксперимента.
Как видно из данных параметров аппроксимации графиков на рисунке 3.9 отношение времен полуреакций при t = 23-75 С (0-6,5 в координатах ——-) уменьшается примерно в два раза при повышении температуры реакции на 10 С, что приблизительно соответствует эмпирической зависимости для правила Вант-Гоффа. Коэффициент а в уравнении аппроксимации показывает степень точности приближения экспериментальных данных к уравнению реакции первого порядка и стремится к единице. При нагревании реакционной массы свыше 75 С зависимость выходит на плато, что определяется отклонением в поведении молекул декстрана от идеальной молекулы. Отклонение от правила Вант-Гоффа характерно для высокомолекулярных биологических объектов, таких как полисахариды или белки, зачастую обусловлено внутримолекулярным и межмолекулярным взаимодействием макромолекул. Для водорастворимых полисахаридов и декстрана, в частности, характерна агрегация в растворах при высоких температурах. Дальнейший процесс окисления происходит на поверхности микрочастиц, что, в свою очередь, приводит к снижению скорости реакции.
Помимо кинетических характеристик процесса получения ПАД, были найдены термодинамические параметры - выходы продукта реакции. Определяли выход продукта в реакции окисления декстрана для двух степеней окисленности, используя различное количество перманганата калия: средней (1 и 2 % об.) и высокой (4 % об.). Что бы остановить влияние температуры на выход ПАД готовили водные растворы клинических декстранов с содержанием декстрана 10 % масс. К трём аликвотам раствора декстрана по 10 мл прибавляли по 5 мл 33 %-м уксусной кислоты и термостатировали на водяной бане при t = 23, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 92 и 98С. К каждой аликвоте, в зависимости от серии эксперимента, прибавляли 2 %-й водный раствор перманганата калия в количествах: 100, 200 или 400 мкл, выдерживали при заданной температуре до полного обесцвечивания и выпадения коричневого хлопьевидного осадка диоксида марганца. Раствор отфильтровывали через бумажный фильтр Enderol filter № 2, Binzer и охлаждали до 6-8 С. Выделение ПАД проводили осаждением 30 мл, охлажденного до 6-8 С, 95 %-го этилового спирта. Осадок декантировали, дважды промывали в 10 мл 30 %-го водного раствора этилового спирта и сушили при t 50 С и относительной влажности не выше 30 %, взвешивали через 24 ч на аналитических весах OHAUS ЕР 214 С.
Результаты гравиметрического исследования влияния температуры на выход продукта в реакции окисления клинических декстранов представлены на рисунках 3.11 (ПАД со средней молекулярной массой 35 кДа) и 3.12 (ПАД со средней молекулярной массой 60 кДа). Как видно из рисунка 3.11, кривая 1 и 2, соответствующие средней степени окисленности ПАД, проявляют низкую зависимость выхода продукта реакции от температуры. В то же время, при избыточном количестве окислителя (кривая 3) реакция сопровождается деструкцией полимерного остова, что приводит к общему снижению выхода продукта реакции. Помимо этого, для реакции с избыточным количеством окислителя характерно снижение выхода продукта реакции с повышением температуры более 75 С.
Реакция окисления декстрана со средней молекулярной массой 60 кДа (рисунок 3.12), так же как и реакция окисления декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа, имеет слабовыраженную зависимость выхода реакции от температуры. Так, для реакций со средним количеством окислителя (кривые 1 и 2), выход реакции слабо изменяется и почти не превышает теоретически рассчитанные значения. В реакции окисления с использованием максимального количества, происходит снижение параметра выхода реакции, но также остающееся в допустимых пределах статистической обработки. 1,1 п
Опираясь на полученные данные, можно сделать вывод, что выход продукта (ЛАД) в реакции окисления клинических декстранов слабо зависит от температуры. Наибольшее отрицательное влияние на выход продукта реакции оказывает высокая температура (80-100 С) при малой молекулярной массе субстрата.
Учитывая слабое влияние температуры на выход продукта в реакции окисления декстранов перманганатом калия, при выборе оптимального режима руководствовались приоритетом кинетических параметров над термодинамическими. Критерием оптимального температурного режима была выбрана наибольшая скорость реакции (наименьшее время полуреакции) при максимальном качестве продукта. Рабочий температурный режим процесса окисления был определен как максимум второй производной функции отношения температур по нормированной разности температур (рисунок 3.10). Оптимальная температура проведения процесса 75-82 С, при ее дальнейшем увеличении снижаются темпы роста скорости реакции и качество продукта вследствие поверхностного окисления макромолекул декстрана.
Определение зависимостей окисления декстрана перманганатом калия в условиях промышленного реактора
Далее определяли оптимальный температурный режим процесса окисления декстрана в промышленном реакторе. Для этого в реактор помещали 50 л 10 %-го водного раствора декстрана и термостатировали при температуре 40, 60 и 75 С. В реакционную массу добавляли 33 %-ю уксусную кислоту из расчета 4 % об. на загрузку. Реакционную массу так же перемешивали с частотой вращения 180 об./мин. В реактор загружали водный 2 %-й раствор перманганата калия из расчета 2 % об. на загрузку. Пробы для анализа отбирали каждые десять минут в течение одного часа. Результаты анализа зависимости содержания альдегидных групп от времени для различных температур приведены на рисунке 4.3.
Анализируя графики зависимости (см. рисунок 4.3) можно сделать вывод, что оптимальной температурой процесса реакции окисления декстрана в промышленном реакторе, из исследуемых, является т =75 С, так как выход соответствующего графика на плато происходит быстрее, чем для графиков зависимостей при 60 и 40 С. Определяя точки перегиба как показатель окончания процесса окисления для соответствующих графиков можно определить время окончания реакции: t75=38,2 мин, t6o=42,4 мин и t4o=57,8 мин (для процессов, проводимых при t = 75, 60 и 40 С соответственно). Значение времени выхода на плато графиков зависимостей для экспериментов, проводимых при 40 и 60 С, больше, чем аналогичный показатель для эксперимента, проводимого при t = 75 С. Такая зависимость времени выхода графиков на плато от температуры реакции свидетельствует о значительном снижении скорости реакции при уменьшении температуры реакционной массы.
Для определения влияния кислотности среды на содержание альдегидных групп в продуктах реакции окисления декстрана от времени в условиях промышленного реактора использовали декстран с молекулярной массой 35 кДа. Водный 10 %-й раствор декстрана в объёме 50 л помещали в реактор, термостатировали при t = 75 С и перемешивали механической мешалкой с частотой вращения 180 об./мин. В реакционную массу приливали 10 %-ю соляную кислоту в объеме, достаточном для создания заданного начального значения кислотности среды: рН = 2, 3, 4 и 5. После тщательного перемешивания в реакционную массу вводили 2 %-й водный раствор перманганата калия из расчёта 2 % об. на загрузку. Отсчёт времени начинали с момента введения окислителя. Пробы для анализа отбирали каждые десять минут в течение одного часа (рисунок 4.4).
Исходя из данных, представленных на рисунке 4.4, можно сделать вывод, что кислотность раствора влияет на скорость реакции окисления декстрана. Увеличение концентрации протонов в реакционной массе сопровождается ростом скорости реакции, что обусловлено увеличением константы скорости реакции за счет повышения электродного потенциала реакции восстановления перманганат -иона. Однако процесс увеличения скорости реакции в значительной степени замедляется после рН 4. Такое поведение системы обусловлено каталитическим насыщением системы, которое приводит к фиксации значения скорости реакции при дальнейшем увеличении кислотности среды. Оптимальное значение рН можно принять равным 4,0-4,5. Оптимальное время проведения процесса определяется как точка перегиба на графике для эксперимента со значением рН 4 и составляет 30 мин. Наибольшее различие скоростей реакций для различных значений рН реакционной массы наблюдается в области 30 мин и наиболее выгодно для рН 4,0-4,5.
Лабораторные эксперименты по определению зависимости содержания альдегидных групп от количества используемого окислителя, а также исследования механизма реакции окисления декстрана показали, что локальный избыток окислителя может привести к переокислению продукта реакции с дальнейшим образованием побочных продуктов и уменьшением выхода целевого продукта. Такие результаты исследований вкупе с фактом использования промышленного реактора (объемом 50 л) делают очевидной необходимость изучения влияния интенсивности перемешивания реакционной массы на время реакции.
Для этого исследовали реакцию окисления для декстрана с молекулярной массой 35 кДа. Водный 10 %-й раствор декстрана, объёмом 50 л помещали в реактор, термостатировали при t = 75 С и прибавляли раствор водной 33 %-й уксусной кислоты из расчёта 4 % об. на одну загрузку. Устанавливали один из определяемых скоростных режимов вращения мешалки: 60, 120, 180 или 240 об./мин, затем в реактор прибавляли 2 % об. водного 2 %-го раствора перманганата калия. Началом времени отсчёта считали момент введения окислителя в реакцию. Процесс проводили в течение одного часа, пробы для анализа отбирали через каждые 10 минут (рисунок 4.5).
Для определения зависимостей процесса окисления декстрана проводился полный факторный эксперимент. На основании полученных результатов однофакторных экспериментов, в качестве влияющих параметров полного факторного эксперимента были выбраны: количество используемого окислителя, температура реакционной массы, кислотность среды, частота вращения мешалки и время проведения реакции. В качестве отклика системы было выбрано содержание альдегидных групп в продуктах реакции. Границы значений полного факторного эксперимента были следующие: количество окислителя -оптимальное значение 2 % об., границы 1,5-2,5 % об.; температура реакционной массы - оптимальное значение 75 С, границы 72-85 С; кислотность реакционной массы - оптимальное значение 4, границы 3,0-5,0 единиц рН. Частота вращения мешалки - оптимальное значение 180 об./мин, границы 100-200 об./мин.; границы времени в полном факторном эксперименте определяли как максимальное и минимальное значение оптимального времени в однофакторных экспериментах (±5) мин., т.е. границы 20-40 мин. В соответствии с условиями полного факторного эксперимента для пяти независимых факторов число экспериментальных точек должно быть равно 32. Результаты и параметры матрицы эксперимента представлены в таблице 6.
Данные, полученные при проведении полного факторного эксперимента, обрабатывались при помощи комплекса «Statistica 6.1». Параметры модели полного факторного эксперимента - линейная регрессия с доверительной вероятностью не менее 90 %. В результате было получено эмпирическое уравнение зависимости количества альдегидных групп от технологических параметров процесса: А=0,034 + 0,1С+0,15г+0,0013Сг+ 0,004w 0,004рН + 0,0036/ + 0,0008/Сг, (30) где А - количество альдегидных групп, мкМ/мг; г - время проведения процесса, мин; п - частота вращения мешалки, об./мин; t - температура раствора, С; С - количество окислителя, % о6.;рН - водородный показатель.
Значимость коэффициентов уравнения регрессии соответствует доверительной вероятности 95 %.
На основании результатов полного факторного эксперимента основными критериями для оптимизации режимов процесса окисления декстрана были выбраны минимальное время реакции и максимальное количество альдегидных групп в образующихся НАД. Количество используемых окислителя не вошло в перечень оптимизируемых параметров по причине прямой зависимости количества альдегидных групп в НАД от количества используемого окислителя.
