Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Действие препаратов группы 5-фторурацила 12
1.2. Состояние лимфоидных органов после воздействия ионизирующей радиации 21
1.3. Реакция лимфатических узлов на развитие рака
в регионе лимфосбора 30
Глава 2. Материал иметоды исследования 38
2.1. Общая характеристика клинического материала 38
2.2. Методы иммунологических исследований 43
2.3. Морфологические методы исследования и морфометрия 44
2.4. Статистическая обработка полученных данных 46
Глава 3. Структурная организация параректальных лимфатических узлов пациентов при раке прямой кишки после неоадъювантной химиотерапии, лучевой терапии и их сочетания 47
3.1. Структурная организация параректальных лимфатических узлов пациентов при раке прямой кишки в зависимости от способа проведения неоадъювантной терапии 47
3.2. Цитоархитектоника коркового плато параректальных лимфатических узлов больных при раке прямой кишки после различных методов неоадъювантного лечения 61
3.3. Клеточный состав паршсортикальной зоны параректальных лимфатических узлов пациентов при раке прямойкишки после различных способов проведения неоадъювантной терапии 64
3.4. Цитоархитектоника лимфоидных фолликулов без герминативных центров параректальных лимфатических узлов больных при раке прямой кишки после различных методов неоадъювантного лечения..67
3.5. Клеточный состав мантийной зоны лимфоидных фолликулов с центрами размножения параректальных лимфатических узлов пациентов при раке прямой кишки после различных способов неоадъювантной терапии 71
3.6. Цитоархитектоника центров размножения лимфоидных фолликулов с герминативными центрами параректальных лимфатических узлов больных при раке прямой кишки после различных методов неоадъювантного лечения 74
3.7. Клеточный состав мякотных тяжей параректальных лимфатических узлов пациентов при раке прямой кишки после различных методов неоадъювантной терапии 77
3.8. Клетки в просвете мозговых синусов параректальных лимфатических узлов больных при раке прямой кишки после различных способов проведения неоадъювантного лечения 19
Глава 4. Клинико-лабораторные данные обследования больных при раке прямой кишки после неоадъювантной химиотерапии, лучевой терапии и их сочетания 121
4.1. Клиническая характеристика пациентов при раке прямой кишки в зависимости от способа проведения неоадъювантной терапии 121
4.2. Общий анализ крови пациентов при раке прямой кишки в зависимости от способа проведения неоадъювантной терапии 122
4.3. Иммунограмма периферической крови пациентов при раке прямой кишки в зависимости от способа проведения неоадъювантной терапии 127
Заключение 141
Выводы 147
Практические рекомендации 149
Список литературы
- Состояние лимфоидных органов после воздействия ионизирующей радиации
- Морфологические методы исследования и морфометрия
- Цитоархитектоника коркового плато параректальных лимфатических узлов больных при раке прямой кишки после различных методов неоадъювантного лечения
- Общий анализ крови пациентов при раке прямой кишки в зависимости от способа проведения неоадъювантной терапии
Введение к работе
Актуальность темы:
Злокачественные новообразования являются ведущей проблемой современной медицины. За каждое десятилетие число вновь выявленных больных со злокачественными опухолями колоректального региона в России увеличивается на 20-25%. Онкологические заболевания вместе с сердечно-сосудистой патологией являются основной причиной смертности в развитых странах.
На сегодняшний день неоадъювантная терапия у больных при раке прямой кишки считается стандартным методом лечения. Очень важно воздействовать на,регионарные лимфатические узлы. Метастатическое поражение лимфатических узлов установлено при I стадии в 6-17% случаев, при II - в 18-34%, а при III стадии метастазы выявляются у 50-58% пациентов. Значительная часть возникновения рецидивов именно в регионарных лимфатических узлах является следствием относительной радио- и химиорезистентности метастатических клеток рака, а также - изменения этих органов при неодъювантном воздействии.
Целесообразность изучения органов лимфатической системы при раке различной локализации, а также после разных методов лечебного воздействия, показана многими исследователями. Малоудовлетворительные результаты стандартных методов лечения зависят не только от адекватности проведенного хирургического или консервативного воздействия или объема первичной опухоли. Большое значение имеет состояние регионарных к злокачественной опухоли органов лимфатической системы - как исходное, так и меняющееся в условиях подавления иммунологических реакций организма - в процессе проведения лучевой или химиотерапии (Сидоренко Ю.С., 1997; Сидоренко Ю.С., 1998; Сидоренко Ю.С., Розенко Л.Я., 2004).
Компонент химиотерапии больных при раке прямой кишки 5-фторурацил имеет 2 основных механизма противоопухолевой активности. Один базируется на ингибиции thymidylate synthetase метаболитами препарата. Второй связан с
встраиванием 5-фторурацила в РНК (Hoshino S. et al., 2005; Garcia V. et al., 2006; Sinicrope F.A. et al., 2006; Uyama R. et al., 2006; Jo W.S., Carethers J.M., 2006). Длительное введение 5-фторурацила приводит к антиметаболическому эффекту в нормальных и опухолевых тканях, о чем свидетельствует снижение активности thymidylate synthetase, причем в опухоли этот эффект более выражен (Tsujinaka Т. et al., 1992; Mitsuishi К. et al., 1997; Pestalozzi B.C. et al., 1997; Suda Y. et al., 1999; Matsusaka S. et al, 2003, 2007; Hoshino S. et al., 2005; Ishi-kawaM. etal., 2008).
Предоперационная химиотерапия 5-фторурацилом воздействует на экспрессию протеинов Вак (проапоптозный), Вс1-2 (антиапоптозный) и Ki-67 (маркер пролиферации) и, таким образом, на биологию неопластического процесса (Billgren A.M. et al., 1999; Schneider J. et al., 2000; Koda M. et al., 2007; Cabibi D. et al., 2007). Этот препарат вызывает апоптоз клеток рака почки (Ju S.A. et al., 2008) и предстательной железы (Khatri A. et al., 2006) в эксперименте на мышах, и колоректального рака в клинике (Jo W.S., Carethers J.M., 2006).
Лечение экспериментальной опухоли с применением 5-фторурацила сопровождается уменьшением площади всех структур селезенки. Общая площадь коркового плато и паракортекса лимфатических узлов также снижается, сокращаются и размеры отдельных зон этих органов (Kossoy G. et al, 2003).
Введение 5-фторурацила сопровождается иммуносупрессией, более тяжелыми осложнениями при экспериментальных инфекционных процессах, что обусловлено подавлением клеточного иммунитета, в частности, миграции макрофагов. Кроме того, отмечено снижение показателей иммунитета при использовании введения лимфоцитов из лимфатических узлов животных после инъекций циклофосфамида и 5-фторурацила (Metzger М. et al., 1977; Ohta Y. et a., 1983; Kim J.P. et al., 1992; Nandurkar H.H. et al., 1997; Kuefer M.U. et al., 1997; Goldstein 0., Ishay J.S., 2001; Zhao J. et al., 2001; YamashitaT. et al., 2006).
Было показано, что субпопуляции клеток красного костного мозга после воздействия 5-фторурацилом менее способны к восстановлению гемопоэтиче-ских структур при трансплантации после летального облучения (Pallavicini
M.G.etal.,1997).
В различных органах и тканях, в том числе гемопоэтических и лимфоидных, после облучения формируются участки геморрагии и микронекрозов (Мейсель М.Н., Мантейфель В.М., 1963; Nakamura W. et al., 1971; Watarai J. et al., 1989; Comely J.R. et al, 1992).
В отдаленные сроки после лучевой терапии опухолей шеи шейные лимфатические узлы были менее 1 см, в них был обнаружен стромальный фиброз и сосудистые изменения. Изменения были более выражены в узлах через длительное время после облучения. Большие лимфатические узлы были более чувствительны к облучению и уменьшались более выражено после воздействия (Shvero J. et al., 2001). Гибель В- и Т-клеток в интерфазу вследствие радиационного поражения может быть усилена воздействием митогенами или антигенами (Anderson R.E., Warner NX., 1975).
Хорошо известно, что снижение и нарушение функций иммунной системы после облучения связано с повреждениями лимфоидных тканей (Miller J., 1966; Anderson R.E., Warner N.L., 1976; Bierke P., 1986; Birch M. et al., 1986; Brawner D.L., Mori M., 1992; Trez de C. et al., 2002). Иммуносупрессия гуморального иммунитета больше связана с повреждением лимфатических узлов, чем селезенки (Шарецкий А.Н. и др., 1998). При воздействии радиоактивных изотопов возможна селективная абляция лимфоидных тканей (Winchell H.S. et al, 1966; Fawwaz R.A. et al., 1971).
После воздействия смешанным гамма-нейтронным излучением Н.И.Рябченко и соавт. (2005а, 20056) обнаружили уменьшение числа клеток в тимусе. Нарушение пролиферации стволовых клеток, возрастание деструктивных изменений пропорционально дозе, возрастание числа клеток макрофагаль-ного ряда отмечают M.A.Kornev с соавт. (2005).
Таким образом, можно заключить, что в литературе содержатся результаты изучения влияния ионизирующей радиации на лимфоидные органы, также имеются литературные данные, посвященные антипролиферативному действию препаратов для химиотерапии на структуры различных лимфоидных органов и
клетки опухолей. Однако, полностью отсутствуют результаты сравнительного исследования изменений органов лимфатической системы и клеток лимфоид-ного ряда после применения химиотерапевтических средств и ионизирующей
радиации, тогда как химиотерапия и лучевое воздействие, проводимые до хирургического лечения, по-разному влияют на организм в целом и на органы и структуры лимфатической системы в частности.
Дсль исследования: Провести сравнительный анализ морфологических изменений параректальных лимфатических узлов и соотношения субпопуляций лимфоцитов крови пациентов при раке прямой кишки после различных методов неоадъювантной терапии.
Задачи исследования:
Методами световой микроскопии исследовать структурную организацию параректальных лимфатических узлов пациентов при раке прямой кишки после неоадъювантной химиотерапии, лучевой терапии и сочетания применения химиотерапевтических препаратов с облучением.
Установить общие и частные закономерности реакции параректальных лимфатических узлов больных при раке прямой кишки после полихимиотерапии, лучевой терапии и их совместного воздействия.
Определить динамику изменений соотношения субпопуляций лимфоцитов крови после различных методов неоадъювантного лечения пациентов со злокачественной опухолью прямой кишки.
Научная новизна:
Впервые проведено сравнительное изучение морфологических изменений параректальных лимфатических узлов пациентов при раке прямой кишки после неоадъювантной химиотерапии, лучевой терапии и их сочетания.
Впервые показано, что и при неоадъювантной химиотерапии, и при лучевой терапии и при совместном применении химиотерапевтических средств с
облучением у больных при раке прямой кишки происходит возрастание объема соединительнотканных компонентов в параректальных лимфатических узлах.
Впервые найдено, что полихимиотерапия, лучевая терапия и их сочетание для лечения пациентов при раке прямой кишки сопровождаются значительным уменьшением объемной плотности лимфоидных фолликулов без герминативных центров в параректальных лимфатических узлах, что обусловлено супрессией пролиферации и дифференцировки клеток данных структур. У части пациентов такие фолликулы полностью отсутствуют в указанных органах. В группе после химиотерапии такие узелки были обнаружены только у 25% пациентов, после лучевой терапии - у 15,6% больных, после сочетания химиотерапии с облучением - в 6,5% случаев.
Впервые продемонстрировано, что после химиотерапии и сочетания ее с лучевой терапией опухолей прямой кишки в результате подавления' метаболизма тканей и лимфообразования на срезе параректальных лимфатических узлов уменьшается площадь мозговых синусов. После лучевого воздействия объем синусной системы остается на исходном уровне и достоверно больше, чем при других сравниваемых методах неоадъювантного воздействия.
Впервые получены данные, что в цитоархитектонике различных зон параректальных лимфатических узлов больных при раке прямой кишки после химиотерапии, облучения и сочетанного лечения химиотерапевтическими препаратами и ионизирующей радиацией, относительно лимфатических узлов пациентов без неоадъювантной терапии, зпвеличивается численность ретикулярных клеток и макрофагов при одновременном уменьшении количества митозов, им-муно- и плазмобластов.
Впервые обнаружено, что в результате неоадъювантного лечения в параректальных лимфатических узлах максимально выраженные изменения цито-граммы клеточных элементов произошли в лимфоидных фолликулах без центров размножения и с герминативными центрами параректальных лимфатических узлов, где высока пролиферативная активность и происходит быстрая дифференцировка клеток. Самые слабые изменения были отмечены в структу-
pax мозгового вещества, так как там основное место в клеточном составе занимают высокодифференцированные клетки с низким митотическим потенциалом.
Впервые показано, что изменения структуры и клеточного состава различных зон параректальных лимфатических узлов более выражены после сочетания неоадъювантнои химиотерапии с облучением, минимальная выраженность была обнаружена после введения комплекса препаратов для полихимиотерапии. Содержание делящихся клеток, иммуно- и плазмобластов в различных отделах параректальных лимфатических узлов более значительно меняется после лучевой терапии, количество моноцитов и нейтрофилов - после применения цитостатиков.
Впервые найдено, что после химиолучевой терапии в периферической крови уменьшается общее число Т-клеток за счет хелперных лимфоцитов и возрастает количество В-клеток.
Теоретическое и практическое значение работы:
Обнаруженные изменения параректальных лимфатических узлов после неоадъювантнои терапии позволяют предполагать нарушение их иммунных фушсций (отсутствие фолликулов, где происходит пролиферация и дифферен-цировка В-клеток, непосредственное подавление их деления и созревания). Изменения более выражены после лучевой терапии, но при химиотерапии имеются свидетельства депрессии миелоцитарного и моноцитарного ростков красного костного мозга. Необходим поиск методов сохранения и быстрого восстановления нарушенных функций лимфатических узлов без снижения противоопухолевого действия неоадъювантнои терапии. При отсутствии множественных отдаленных метастазов предпочтение должно быть отдано лучевому воздействию на опухоль и регионарные лимфатические узлы. Вследствие того, что после неоадъювантнои терапии имеются выраженные нарушения клеточного и гуморального иммунитета, необходимо проведение мероприятий, направленных на профилактику воспалительных осложнений.
Внедрение результатов исследования в практику:
Результаты исследования внедрены в практику преподавательской и научно-исследовательской работы на кафедрах патологической анатомии, топографической анатомии и оперативной хирургии Новосибирского государственного медицинского университета Росздрава, практической работы Новосибирских городского и областного онкологических диспансеров.
На защиту выносятся следующие основные положения:
І.Неоадьювантная химиотерапия, лучевая терапия и совместное применение химиотерапевтических средств с облучением у больных при раке прямой кишки приводят к возрастанию объема соединительнотканных компонентов и значительному уменьшению объемной плотности лимфоидных фолликулов без герминативных центров в параректальных лимфатических узлах.
Изменения параректальных лимфатических узлов более выражены после сочетания неоадъювантной химиотерапии с облучением, минимальная- выраженность была обнаружена после введения комплекса препаратов для полихимиотерапии. Содержание делящихся клеток, иммуно- и плазмобластов в различных отделах параректальных лимфатических узлов более значительно меняется после лучевой терапии, количество моноцитов и нейтрофилов — после применения цитостатиков.
Неоадъювантная химиолучевая терапия при раке прямой кишки сопровождается уменьшением общего числа Т-клеток за счет хелперных лимфоцитов и возрастанием процента В-клеток в периферической крови.
Апробация материалов диссертации:
Основные положения диссертации доложены на ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2008» (Новосибирск, 2008), научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета Новосибирского Государственного Медицинского Университета «Актуальные проблемы перинатологии,
акушерства и гинекологии» (Новосибирск, 2008), Международной гистологической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ профессора П.В.Дунаева «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» (Тюмень, 2008), международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2008), Российской научно-практической конференции «Совершенствование онкологической помощи в современных условиях» (Барнаул, 2008) и объединенном заседании сотрудников кафедр ГОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета Росздрава, практических врачей и научного персонала лабораторий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, 2008).
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, 4 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав собственных результатов с их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 208 страницах компьютерного текста, содержит 14 таблиц, иллюстрирована 34 многокомпонентными комбинированными рисунками. Список литературы включает 490 источников (99 отечественных и 391 иностранный).
Автор искренне благодарен научным руководителям д.м.н., профессору С.В.Сидорову и д.м.н. С.Э.Красильникову за научно-методическую помощь, ценные замечания и консультации в ходе выполнения работы.
Состояние лимфоидных органов после воздействия ионизирующей радиации
С 50-х годов в литературе имеется множество сообщений о реакции лимфоидных органов людей и экспериментальных животных на воздействие ионизирующей радиации (Hahn P.F., Carothers E.L., 1953; Klug Н., 1963; Ford С.Е., Micklem H.S., 1963; Campi L., Sinisterero G., 1963; Engeset A., 1963; Hall J.G., Morris В., 1964; Sherman J.О., O Brien P.H., 1967).
В настоящее время лучевая терапия широко применяется не только для терапии злокачественных опухолей, но и для профилактики и лечения развития метастазов в лимфатических узлах. Радиотерапия лучше воздействует на опухоль, тогда как химиотерапия более выражено уменьшает число метастазов. Вторичная аменорея или тяжелые нарушения менструального цикла являются хорошими прогностическими признаками эффективности проводимого лечения (Grohn P. et al., 1984). Следует отметить, что облученные опухолевые клетки могут приобретать или усиливать свою антигенность к иммунной системе организма (Liu-К. et al., 2005). Нет корреляции между состоянием р53 и рецидивами рака после радиационной терапии. Этот протеин не играет такого важного прогностического значения, как состояние лимфатических узлов (Saunders М.Е. etal., 1999).
Хорошо известно развитие анемии после облучения (Grigiene R. et al., 2005), повреждения слизистых оболочек (Demirer S. et al, 2006), язвы прямой кишки (Nakabayashi М. et al., 2006). Индуцированные радиацией аберрации хроматина в клетках красного костного мозга, лимфатических узлов и циркулирующих лимфоцитов происходят уже в первые 24 часа после облучения (Sempinska Е., 1973; Gumpel J.M., Stevenson А.С., 1975). H.Jung и соавт. (2001) сообщают о поражение эпителия внутренних органов, лимфатических сосудов и мягких тканей после облучения по поводу рака различной локализации.
Воздействие ионизирующей радиации вызывает различные внешние и внутренние повреждения, включая радиодерматиты. Это осложнение является одним из ограничивающих факторов при проведении лучевой терапии. У мышей HR-1 после рентгеновского воздействия на-область спины в дозе 10 Gy в день в течение 4 последовательных суток в коже были найдены аккумуляция коллагена, гиперемия, эритема и сухая десквамация. Инфильтрация CDllb+ моноцитами/макрофагами облученной кожи также была обусловлена радиодерматитом (Maeng H.G. et al., 2006; Kim J.S. et al., 2006).
В различных органах и тканях, в том числе гемопоэтических и лимфоид-ных, после облучения формируются участки геморрагии и микронекрозов (Мейсель М.Н., Мантейфель В.М., 1963; Nakamura W. et al., 1971; Watarai J. et al., 1989; Comely J.R. et al., 1992).
Часто радиационные поражения приводят к ишемическим некрозам и завершаются фиброзом органов и тканей (Castrup W. et al., 1976; Henderson R.H. et al., 1984; Miyaguchi M. et al., 1997; Park K.J. et al., 2000; Huang E.Y. et al., 2000; Hirota S. et al., 2002; Gothard L. et al, 2004; Neuhof D., Debus J., 2006). Описаны отеки, целлюлиты и некрозы подкожно-жировой клетчатки, нейропа-тии, поражения плечевого сплетения, параличи верхней конечности после радиационной терапии рака молочной железы (Wazer D.E. et al., 2001; Johansson S. et al., 2002; Hanna Y.M. et al., 2002; Meric F. et al., 2002; Bajrovic A. et al., 2004).
Объем нормальных лимфатических узлов после облучения быстро и значительно уменьшается. Объем узлов с реактивной гиперплазией продемонстрировал меньшую степень уменьшения. При возникновении метастазов и воздействии идентичной дозой радиации, размеры данных органов уменьшаются в максимально выраженной степени. Изменения объема лимфатических узлов после радиационной терапии может служить одним из показателей оценки эффективности данного метода лечения (Hug I. et al., 1975; Schafer СВ. et al., 1996; Liszka G. et al., 1997; Wisner E.R. et al., 2000; Wijesuriya R.E. et al., 2005; Maschuw K. et al., 2006).
Л.Д.Мурзина и соавт. (1988) обнаружили, что" выраженное подавление эритропоэза у крыс после облучения может сопровождаться стабильным возрастанием числа костномозговых лимфоцитов, гиперплазией лимфатических узлов и снижением функциональной активности нейтрофилов и лимфоцитов. Увеличение объема лимфатических узлов после интерстициального облучения при терапии злокачественных опухолей отмечают и другие исследователи, чаще в отдаленные после воздействия сроки - после 9 месяцев. Это создает определенные трудности в дифференциальной диагностике между постоперационной гиперплазией лимфатических узлов и развитием метастазов (Moriguchi S. et al., 1988).
Радиационное воздействие на лимфатические узлы приводит к уменьшению объема лимфоидной ткани и замещению ее фиброзной. Функциональные изменения характеризуются потерей фильтрационной функции и снижением пропускной способности (Herman P.G. et al., 1968; Sinha B.K., Goldenberg G.J., 1970; Peters P.E., 1970; Strauli P., 1970; Burge J.S., 1975; Papilian V.V. et al., 1976, 1979a, 19796; Comely J.R. et al., 1992).
В отдаленные сроки (2 группы обследования, 0,5-1 год и более 6 лет) после лучевой терапии опухолей шеи в шейных лимфатических узлах был обнаружен стромальный фиброз и сосудистые изменения, лимфатические узлы были менее 1 см. Изменения были более выражены в узлах через длительное время после облучения. Большие лимфатические узлы были более чувствительны к облучению и уменьшались более выражено после воздействия (Shvero J. et al., 2001).
После радиационного лечения лимфом в лимфатических узлах были обнаружены фиброз, жировое перерождение, некротизированные ткани и сосудистые аномалии. Увеличение узлов, вызванное неопухолевыми изменениями, может быть похожим на рецидив опухоли (Smith Т., 1986).
После облучения всего тела крыс в костном мозге, крови, лимфатических узлах и других органах снижается количество гранулоцитов (в том числе и плюрипотентных клеток), нарушения их пролиферации и созревания (Cederberg А., 1965; Мурзина Л.Д., Муксинова К.Н., 1985; Bierke Р., 1986), и была обнаружена дегенерация (апоптоз) клеток и структур (Лебкова Н.П., 1966; Congdon С.С., 1966; Квачева Ю.Е., Власов П.А., 1997; Власов П.А., Квачева Ю.Е., 1998). Склероз лимфатических узлов и селезенки после облучения сходен с возрастной инволюцией. Под влиянием ионизирующей радиации нарушаются некоторые функции селезеночных макрофагов (Papilian V.V. et al., 1979а, 19796; DaileyM.O. etal.,1980).
Морфологические методы исследования и морфометрия
Объектом иммунологического исследования служила периферическая ге-паринизированная (25 ЕД/мл) кровь, из которой выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин по А.Воушп (1968) в модификации Т.В.Михеенко (1989):
5,0 мл крови наслаивали на 3,0 мл раствора фиколла-верографина (в=1,08 см) в пробирках и центрифугировали в течение 20 минут при 3000 оборотах в минуту. Мононуклеары собирали на границе интерфаз и дважды отмывали при 4-6С забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) с 0,5% желатина и однократно - средой RPMI-1640 (НПО «Вектор», Новосибирск). Количество выделенных клеток подсчитывали в камере Горяева под световым микроскопом.
Общее количество Т-лимфоцитов (CD3+), хелперных Т-лимфоцитов (CD4+), супрессорных/киллерных Т-лимфоцитов (CD8+), естественных кил-лерных клеток (CD 16+), В-лимфоцитов (CD20+) определяли в лимфоцитоток-сическом тесте с помощью моноклональных антител («Сорбент», Москва) (Петров Р.В. и др., 1992). Тестирование проводили в круглодонном планшете для иммунологических исследований. Выделенные и отмытые мононуклеарные клетки ресуспендировали в среде 199, дополненной 2,0% раствором фетальной сыворотки теленка, в концентрации 2x106 клеток в 1 мл. В лунку вносили по 20,0 мкл суспензии мононуклеаров и добавляли 5,0 мкл раствора моноклональ-ньгх антител (моноклональные антитела к CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+ и СД20+ антигенам) в рабочей концентрации. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 40 минут. После этого планшет центрифугировали в течение 5 минут при 1500 оборотах в минуту, сливали надосадок и ресуспендировали клетки встряхиванием. К осадку добавляли 25,0 мкл свежей сыворотки крови кролика- (источник комплемента) в разведении 1:2, встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 90 минут. Затем в каждую лунку с пробой добавляли 10,0 мкл 2,0% раствора эозина на изотоническомраство-ре NaCl, инкубировали 10 минут при комнатной температуре. По окончании реакции планшет ставили на холод (для- остановки реакции). Подсчет CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+ и CD20+ клеток осуществляли под микроскопом при 10-кратном увеличении. Окрашенные клетки в лунке с определенными монокло-нальными антителами являлись лимфоцитами, экспрессирующими данный маркер. Подсчет проводили на 100 клеток.
В качестве показателя нормы использовали величины, полученные на 12 здоровых донорах в НИИ клинической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск).
Параректальные лимфатические узлы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина не менее 24 часов, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 7-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизон и по Романовскому (Пирс Э., 1964; Елисеев ВТ. и др., 1967; Лилли Р., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996), изучали на световом микроскопе Axio-imager Zl (Zeiss, Германия) при увеличении до 1200 раз.
Морфометрическое исследование структуры различных отделов парарек-тальных лимфатических узлов проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в многочисленных работах, посвященных теоретическому обоснованию и конкретным примерам применения этих методов (Глаголев А.А., 1941; Шахламов В.А., 1967; Катипас Г.С., Полонский Ю.З., 1970; Плохинский Ы.А., 1970; Вейбель Э.Р., 1970; Автандилов Г.Г., 1973, 1980, 1990, 2002; Христо-любова Н.Б., Шилов А.Г, 1974; Weibel E.R., 1979; Автандилов Г.Г. и др., 1981, 1984; Непомнящих Л.М. и др., 1986; Горчаков В.Н., 1997). Обозначение и размерность стереологических параметров, использованных в работе, приведены согласно рекомендациям Международного стереологического общества (Weibel E.R., 1979).
Для исследования структурной организации параректальных лимфатических узлов и цитограммы клеточных элементов в различных структурах данных органов применяли квадратную тестовую систему, совмещаемую на экране компьютера с изображением, полученным при помощи цифровой видеокамеры микроскопа. Для изучения показателей структуры лимфатических узлов (использование объектива с увеличением X 4) конечная площадь тестового квадрата была равна 14400 мкм2 (сторона квадрата 120 мкм), при подсчете цитограм-мы клеток (применение объектива с увеличением X 40) - 144 мкм (сторона квадрата 12 мкм) (Майбородин И.В. и др., 2005). С каждого среза проводили 3-5 измерений, в связи с рекомендациями, что для рандомизированного исследования достаточно 3 срезов (Head J.R., Seeling L.L., 1984).
В процессе морфометрических исследований на срезе лимфатических узлов определяли относительную площадь капсулы, соединительнотканных прослоек в корковом и мозговом веществе, краевого синуса, коркового плато, па-ракортекса, лимфоидных фолликулов без центров и с центрами размножения, мякотных тяжей и мозговых синусов.
Цитоархитектоника коркового плато параректальных лимфатических узлов больных при раке прямой кишки после различных методов неоадъювантного лечения
В клеточном составе коркового плато при различных способах неоадъю-вантной терапии увеличилось относительное содержание ретикулярных клеток. После химиотерапии, облучения и сочетанного лечения химиотерапевтически-ми препаратами и ионизирующей радиацией клеток стромы было больше на 35,8%, 37,6% и 56%, соответственно, чем в корковом плато лимфатических узлов пациентов без неоадъювантного лечения (табл. 5).
Процент моноцитов был меньше, относительно больных без предоперационного лечения, только в группах после химиотерапии и после сочетанного воздействия цитостатиками и облучением: в 2,3 и 2,4 раза, соответственно. Численная плотность моноцитов была ниже в 3 раза, по сравнению с состоянием у пациентов без неоадъювантной терапии, только после совместного применения химиотерапии и ионизирующей радиации (табл. 5).
Относительная плотность макрофагов, наоборот, была больше после использования в качестве неоадъювантного лечения химиотерапии, лучевой терапии и сочетания введения цитостатиков с облучением в 2,2, 2,4 и 2,4, соответственно, чем в группе больных без неоадъювантного лечения (табл. 5).
Видимо, в связи с постепенно развивающейся склеротической трансформацией в различных зонах лимфатических узлов, в их цитограмме увеличивается число ретикулярных клеток.
Неотъемлемой частью соединительной ткани, кроме клеток фибробласт-ного ряда, являются тканевые базофилы и макрофаги, принимающие участие в синтезе и лизисе различных форм коллагена (Roche W.R., 1985; Joseph-Silverstein I, Rifkin D.B., 1987; Michel L. et al., 1992; Ruger B. et al., 1994, 1996; Shuttleworth C.A., 1997; ChyczewskaE. et al., 1995; Hoshi K. et al., 2001).
Подобное увеличение численности клеточных элементов соединительной ткани отмечено в результатах других исследователей (Кравченко СВ., Микуль скаяС.К., 1983;ГонсальвоП., 1989).
В преметастатической фазе П.Гонсальво (1989) обнаружены гиперплазия и инфильтрация ретикуло-эндотелиальными элементами регионарных лимфатических узлов. Лимфо-гистио-тучноклеточная инфильтрация стромы, появляющаяся при предраке, прогрессирует при развитии злокачественной опухоли (Краевский Н.А. и др., 1993).
При выраженных изменениях узлов выявлены диффузные гиперпластические процессы ретикулярно-лимфоидного характера. Корковый слой имел истонченный вид, лимфоидные фолликулы были небольших размеров, пара-кортикальный слой почти не определялся. В капсуле и мякотных тяжах развились склеротические процессы, а их клетки подверглись дистрофическим изменениям (Кравченко СВ., Микульская С.К., 1983).
Не исключено, что возрастание численности клеточных элементов стромы у пациентов связано не только со склерозом, а со снижением показателей иммунитета, сопровождающим развитие злокачественной опухоли.
Сокращение относительного и абсолютного числа моноцитов в различных зонах лимфатических узлов после химиотерапии наиболее вероятно связано с угнетением моноцитарного ростка красного костного мозга противоопухолевыми средствами (Metzger М. et al., 1977; Ohta Y. et a., 1983; Kim J.P. et al., 1992; Nandurkar H.H. et al., 1997; Kuefer M.U. et al., 1997; Goldstein O., Ishay J.S., 2001; Zhao J. et al., 2001; Yamashita T. et al, 2006). Естественная убыль этих клеток (гибель или дифференцирование в макрофаги) не компенсируется из-за подавления пролиферации их предшественников.
В связи с уменьшением числа лимфоцитов, иммуно- и плазмобластов (миграция, дифференцировка и другие причины) в различных структурных отделах лимфатических узлов продолжает оставаться все тоже абсолютное число ретикулярных клеток и макрофагов, но процент их в цитограмме, из-за снижения численности других клеток, возрастает. То есть сокращается число В-клеток (В-лимфоцитов, иммуно- и плазмобластов), а остается пустой остов структуры, состоящий из клеточных элементов стромы и макрофагов.
Процент митозов был меньше, относительно больных без предоперационной терапии, во всех группах с неоадъювантным лечением: после химиотерапии, лучевой терапии и сочетанного воздействия цитостатиками и облучением в 3,7, 4,3 и 5,2 раза, соответственно. Численная плотность делящихся клеток, по сравнению с состоянием у пациентов без неоадъювантной терапии, была ниже в 4,6, 5,3 и 6,5 раза, также соответственно, после химиотерапии, лучевой терапии и совместного применения химиотерапии и ионизирующей радиации (табл. 5).
Подавление митотической активности лимфоцитов наиболее вероятно связано с действием комплекса противоопухолевых препаратов (Metzger М. et al., 1977; Ohta Y. et a:, 1983; Kim J.P: et at, 1992; Nandurkar H.H. et al:, 1997; Kuefer.M.U. et al;,-1997; Goldstein 0:, Ishay J.Si, 2001; Zhao J; etal;, 2001; Yama-shita T. et al., 2006) и воздействием- ионизирующей радиации (Хуссар Ю.П., Лущиков Е.П., 1973; Михайлов В:П., ГусихинаБ;И;, 1975;HoshiH. et al., 1984).
Относительное, содержание клеток с признаками деструкции было выше после использования в качестве неоадъювантного лечения химиотерапии лучевой терапии и совместного введения цитостатиков с облучением в 2,3, 2,3 и 2,6 раза, соответственно, чем в группе больных без неоадъювантного лечения (табл. 5).
Возрастание числа нежизнеспособных клеток, по-видимому, также обусловлено снижением митотической активности. Следует отметить, что в качестве клеток с деструктивными изменениями были рассмотрены клетки с необратимыми некробиотическими изменениями ядра или цитоплазмы (кариопик-ноз, кариорексис, кариолизис, выраженная вакуолизация ядра или цитоплазмы). Подобные изменения клетки приобретают при воздействии на них иммуноком-петентных клеток организма (когда данные клетки стали по какой-либо причине антигенными для этого организма: ошибки во время митоза, влияние микроорганизмов, воздействие некоторых физических (ионизирующие излучения)
Общий анализ крови пациентов при раке прямой кишки в зависимости от способа проведения неоадъювантной терапии
Скорость оседания эритроцитов, по сравнению со здоровыми донорами Сибирского региона, была выше во всех обследованных категориях больных при раке прямой кишки. У пациентов без неоадъювантной терапии, после предоперационной химиотерапии, облучения или сочетания применения цитоста-тиков с лучевой терапией величина значения этого показателя была выше в 14,6, 11,9, 15 и 11,8 раза, соответственно (рис. 32) (табл. 12).
Концентрация гемоглобина в крови у больных без неоадъювантной терапии, после химиотерапии, облучения или сочетания применения цитостатиков с лучевой терапией была ниже на 37,7%, в 2,4 раза, на 65,4% и в 2,4 раза, соот 4 ветственно, чем у доноров. При этом после химиотерапии или ее сочетания с облучением гемоглобина в крови было статистически достоверно меньше на 73,1% и 75%, соответственно, относительно пациентов без предоперационного лечения (рис. 32) (табл. 12).
Количество эритроцитов на единицу объема крови было снижено, относительно состояния у доноров, только в группах после неоадъювантной химиотерапии и после ее комбинации с лучевой терапией: на 47,5% и 51,8%, соответственно (рис. 32) (табл. 12).
Содержание тромбоцитов было также меньше, чем у доноров, в группах после неоадъювантной химиотерапии и после ее комбинации с лучевой терапией: на 97% и в 2,1 раза, соответственно. В этих же группах величина значения данного показателя была ниже на 75,2% и 86,4%, по сравнению с состоянием у пациентов при раке прямой кишки без неоадъювантной терапии. На фоне этого после сочетания химио- и лучевой терапии тромбоцитов было меньше на 62,4%, относительно группы после только облучения (рис. 32) (табл. 12).
Число лейкоцитов было снижено в группах после неоадъювантной химиотерапии и после ее комбинации с лучевой терапией на 78% и 99%, чем у здоровых доноров, соответственно. При этом после сочетания химиотерапии и облучения лейкоцитов было меньше в 2,4 раза, относительно группы после только лучевой терапии (рис. 33) (табл. 12).
Таким образом, можно заключить, что у всех пациентов при раке прямой кишки резко повышается скорость оседания эритроцитов и снижается концентрация гемоглобина. Все это, видимо, связано с хронической воспалительной реакцией, сопровождающей развитие рака. Развитие самой опухоли, ее ин-фильтративный рост, приводит к повреждению оіфужающих тканей. Часто из-за недостаточного кровоснабжения и микробной контаминации опухоли (контакт с содержимым прямой кишки) часть ее некротизируется. Хроническая ин токсикапия из места воспалительного процесса приводит к повышению скорости оседания эритроцитов и уменьшению концентрации гемоглобина.
Концентрация гемоглобина, численность эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов более выражено снижается в группах больных после применения цитостатиков и после сочетания химиотерапии с облучением. Скорее всего, это связано с супрессивным влиянием препаратов для химиотерапии на различные ростки красного костного мозга.
Препараты для полихимиотерапии, при введении в организм, в первую очередь оказывают воздействие на активно пролиферирующие и дифференцирующиеся клетки. Причем происходит не только торможение этих процессов, но в таких высокоактивных клетках включаются механизмы индукции апопто-за, приводящие эти клетки к гибели (Ferraro С. et al., 2000; Jo W.S., Carethers J.M., 2006; Ju S.A. et al., 2008; Khatri A. et al., 2006).
Падение числа эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов наиболее вероятно связано с угнетением миелоцитарного и моноцитарного ростков красного костного мозга противоопухолевыми средствами (Metzger М. et al., 1977; Ohta Y. et a., 1983; Kim J.P. et al., 1992; Nandurkar H.H. et al., 1997; Kuefer M.U. et al., 1997; Goldstein 0., Ishay J.S., 2001; Zhao J. et al., 2001; Yamashita T. et al., 2006).
Лучевая терапия злокачественной опухоли более выражено воздействует только в месте воздействия, в данном случае облучению подвергается не весь организм, а только места локализации самой опухоли и ее метастазов, соответственно, более выражено супрессируются клетки, которые делятся, дифференцируются и постоянно фушсционируют в месте облучения. То есть клетки красного костного мозга, тимуса, селезенки и отдаленных лимфатических узлов не так выражено супрессируются при лучевой терапии, как после использования цитостатических препаратов.
При применении цитостатиков их воздействию подвергается весь организм, а в результате лучевой терапии влияние оказывается непосредственно на саму опухоль и ее метастазы, при этом не происходит угнетения миелоцитарного и моноцитарного ростков костного мозга и в меньшей степени должно быть выражено иммуносупрессивное побочное действие неоадъювантного лечения.
Следует обратить внимание еще на один аспект полученных данных. У многих пациентов (12 человек из 44) при раке без предоперационного лечения количество лейкоцитов было больше нормы, причем у двух обследованных этот показатель превышает 15х109/л.
При исследовании лейкоцитарной формулы было отмечено появление в периферической крови некоторых больных при раке прямой кишки без не-оадъювантной терапии незрелых клеток миелоидного ростка - миелоцитов. Кроме этого можно отметить присутствие небольшого числа юных нейтрофи-лов в лейкограмме отдельных доноров и пациентов без предоперационного лечения, такие формы нейтрофилов не были обнаружены в группах обследованных после всех сравниваемых способов неодыовантного лечения (табл. 13).
Процент нейтрофильных лейкоцитов с палочковидным ядром в периферической крови был снижен в группах после неоадъювантной химиотерапии, облучения и их комбинации в 58, 12,2 и 75,6 раза, чем у здоровых доноров, соответственно. В данных группах таких форм нейтрофилов было меньше в 80,7, 16,9 и 105,1 раза, также соответственно, но относительно группы без предоперационного лечения (рис. 33) (табл. 13).
Содержание лимфоцитов было выше, чем у пациентов без неоадъювантной терапии, в группах после неоадъювантной химиотерапии, лучевого воздействия и их комбинации: в 2 раза, на 77,2% и в 2,4 раза, соответственно. Причем, после совместного применения цитостатиков с облучением величина значения этого показателя была больше на 77,6%, по сравнению со здоровыми донорами (рис. 33) (табл. 13).
