Введение к работе
SOSt-
Актуальность проблемы. Вирусные гепатиты - одна из актуальных проблем современной медицины. Это определяется не только их повсеместным распространением, но и высоким уровнем заболеваемости, инвалидизэции и смертности [Жданов К.В. и соавт. 2003; Онищенко Г.Г., 2004; Minola Е. et al., 2002; Guido М. et al., 2003; El-Raziky M.S. et al., 2004].
В последние годы в Российской Федерации отмечается стабильно высокий уровень заболеваемости парентеральными гепатитами в основном за счёт инфицирования вирусами В и С [Ивашкин ВТ. и соавт., 2003; Жданов К.В. и соавт., 2004; Онищенко Г.Г., 2004].
Хотя в настоящее время изменилась структура вирусных гепатитов вследствие уменьшения количества острых и увеличения'числа хронических форм, уровень персистенции HBV и HCV-инфекции среди детского населения страны остается достаточно высоким [Анохин В.А., Гумерова А.А., 2002; Московская И.А. и соавт., 2003; Чередниченко Г.В., Московская И.А., 2003; Баранова И.П. и соавт., 2003; Учайкин В.Ф. и соавт., 2003].
Общеизвестно, что лечебная тактика и прогноз при хронических вирусных гепатитах (ХВГ) основывается на морфологической оценке активности и стадии структурных нарушений. Для этого используют пункционные биопсии печени.
Цель исследования: Определить дополнительные морфологические и морфометрические критерии диагностики ХГ В и С у детей на основе современных полуколичествеиных и количественных методов ранговой оценки активности и хронизации процесса для обоснования рациональной терапии и контроля за эффективностью лечения.
Задачи исследования:
-
Изучить биоптаты печени, взятые под контролем лапароскопии у детей с хроническими гепатитами В и С, с балльной оценкой показателей рутинных гистологических, а также - с помощью морфометрических, гистохимических и электронно-микроскопических методов в динамике заболевания.
-
Сопоставить результаты морфологических исследований биоптатов печени с клинико-лабораторными данными и показателями инструментальных методов исследования. ______^
иос. национальная!
БИБЛИОТЕКА ]
3 С. Петербург d)Qа I
3. На основании полученных результатов выделить наиболее
информативные морфологические критерии диагностики,
дифференциальной диагностики, степени активности и стадии хронизации вирусных гепатитов у детей.
Научная новизна:
Впервые проведено клиническое и морфологическое изучение особенностей ХВГ у детей, естественно протекающих без отягощающих факторов (алкоголь, наркотики, гепатотоксичные вещества и лекарственные препараты).
Впервые проведено сравнительное морфологическое исследование биоптатов из разных долей печени, взятых под контролем видеолапароскопии. Впервые проведено молекулярно-биологическое исследование материала парных биопсий. Дана сравнительная морфометрическая характеристика биоптатов при ХВГ разной степени активности. Выявлены корреляционные связи между клинико-инструментальными и морфологическими параметрами состояния печени у детей с ХВГ.
Дана морфометрическая характеристика биоптатов печени, отражающая особенности изменений паренхиматозных и стромальных компонентов органа на разных стадиях ХВГ у детей.
Установлена высокая информативность изучения биоптатов печени, полученных из двух её долей. Показано, что разные доли печени у детей на ранних стадиях заболевания ХГ поражаются в различной степени.
Практическая значимость: Предложенные дополнительные лапароскопические и морфометрические критерии активности и хронизации патологического процесса при вирусных гепатитах расширяют информативность морфологического исследования, позволяют оценить степень поражения в разных долях печени при ХГВ и ХГС и могут быть предложены для обоснованной противовирусной терапии.
Положения, выносимые на защиту диссертации: 1. Клиническое течение ХВГ у детей без отягощающих факторов
(алкоголь, наркотики, гепатотоксичные вещества и лекарственные
препараты) характеризуется преобладанием минимальных и
слабовыраженных форм.
-
Парные биоптаты печени, взятые из правой и левой доли под контролем видеолапароскопии, ьозволяют более достоверно верифицировать степень активности и стадию хронизации при ХВГ, особенно в случаях малоактивных форм.
-
При слабовыражеиных ХВГ имеются ультраструктурные нарушения, которые без полноценной терапии могут усугубляться.
-
Морфометрические показатели при ХГС характеризуются более выраженным хрониогенным потенциалом, чем при ХГВ.
-
Между клинико-лабораторными, серо-вирусологическими, инструментальными (УЗИ, лапароскопия) и морфологическими (ранговыми) показателями патологического процесса в печени у детей с ХВГ имеются достоверные корреляции, позволяющие говорить о возможности неинвазивного мониторинга заболевания.
Апробация работы.
Основные положения работы были представлены и доложены на краевой научно-практической конференции "Актуальные вопросы экстренной детской хирургии. Перспективы развития" (Хабаровск, 21-22 декабря 2001 года), на Международном конгрессе "Доказательная медицина - основа современного здравоохранения" (Хабаровск, 12-15 октября 2004 года).
Структура и объём диссертации: Диссертация изложена на 189 страницах машинописного текста (собственно текста 109), включает 34 таблицы и 39 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, раздела "Внедрение в практику", указателя литературы и приложения. Указатель литературы содержит 214 источников, в том числе 130 отечественных и 84 зарубежных. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под нашим наблюдением находились 120 больных (83 мальчика и 37 девочек) в возрасте от 1 года до 15 лет с хроническим вирусным гепатитом. Из них у 78 человек была диагностирована HBV, у 35 - HCV, у 6 человек -HBV+HCV, а у одного - HBV+HDV этиология хронического гепатита. Все больные состояли на учёте с 1994 по 2004 г.г. в диспансерном кабинете гепатитного отделения Детской инфекционной больницы г. Хабаровска (ДИБ). Более 3 лет наблюдались 84 ребёнка, из них 57 - больше 6 лет, а 20 -
более 10 лет. В исследование не включались случаи ХВГ с отягощающими факторами (наркомания, токсикомания, алкоголизм, тяжёлая химиотерапия). Продолжительность заболевания высчитана от начала потенциального риска заражения.
Клинические лабораторные и биохимические исследования
Клинико-лабораторное и биохимическое обследование детей проводилось общепринятыми методиками с интервалом 3-6 месяцев в периоде ремиссии и 7-15 дней при биохимическом или клиническом обострении. В комплекс обследования включалось определение уровня билирубина, ферментов, отражающих уровень цитолиза (АЛТ, ACT), белковые показатели крови (общий белок, концентрация альбуминов, фракции глобулинов, тимоловая проба, протромбиновый индекс), тесты холестаза (щелочная фосфатаза, холестерин, |3-липопротеиды), а также периодический контроль белой и красной крови. При первичном обследовании больных проводилось скрининговое обследование для исключения дисметаболических нарушений, вызывающих повреждение печени (содержание железа, меди). При направлении на биопсию осуществлялся контроль гемостаза. Ни один из пациентов к моменту первичной биопсии печени не получал противовирусной терапии.
Определение маркёров вирусных гепатитов
Все больные регулярно обследовались серологически для определения маркёров ВГВ (HBsAg, anti-HBs, anti-HBcor IgM, anti-HBcor sum, HBeAg, anti-HBe), ВГС (anti-HCV IgM, anti-HCV sum), ВГД (anti-HDV IgM, anti-HDV sum), ВГА (anti-HAV IgM), а также определения антител класса М к вирусам простого герпеса и цитомегалии. Исследование образцов крови проводилось в клинико-диагностической лаборатории (КДЛ) ДИБ с использованием иммуноферментного анализа.
Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Определение генетических маркёров вирусов гепатитов В и С проводилось в ДНК - лаборатории Хабаровского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ и КДЛ поликлиники УФСБ по Хабаровскому краю (г. Хабаровск). Плазму крови обследуемых пациентов брали в день операции, замораживали и хранили до исследования в низкотемпературном морозильнике при минус 20 С, так же хранили взятые во время пункционной биопсии кусочки ткани печени.
Выделение РНК из плазмы крови и гомогената биоптатов осуществлялось с применением комплекта реагентов "Проба ТХ" производства "ДНК-технолог ия", г. Москва.
Пункционная биопсия печени
Пункционная биопсия печени проводилась пациентам под общим наркозом, с применением видеолапароскопического оборудования фирмы "Storz" (Германия), соблюдением всех правил асептики и антисептики в ДХО ДККБ г. Хабаровска.
Во время лапароскопии выполнялась прицельная биопсия из наиболее изменённых участков правой и левой долей печени, позволяющая получать достаточное количество материала для исследования и избегать таких осложнений как послеоперационное кровотечение.
Этапы гистологического исследования биоптатов с последующей оценкой морфопогических изменений в печени
Для биопсий использовали разовые трепанационные иглы типа Галлини, длина столбика ткани при этом составляла 16-20 мм, диаметр - 1,6-1,8 мм. Дія каждой доли использовали отдельные иглы, особенно для определения нуклеиновых кислот вирусов в ткани печени. В последнем случае из внутренней части полученного столбика ткани печени одноразовым бритвенным лезвием отрезали фрагмент длиной 2 мм. Полученный материал гомогенизировали одноразовым скальпелем на разовом предметном стекле и, поместив в пробирку, замораживали. Кроме того, у другой части пациентов из внутренней части столбика брали кусочек диаметром до 2 мм, фиксировали в глютаралъдегиде и заливали в эпон. Проводка материала для электронно-микроскопического исследования производилась в ЦНИЛ ДВГМУ. После стандартной обработки материал резался на ультратоме ЛКБ-3 (Швеция), просматривался в электронном микроскопе JEM 1200 EX II (Япония) в лаборатории гистохимии и электронной микроскопии отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва.
Морфологическое исследование биоптатов печени проведено у 120 детей. В 86 случаях - это парные биопсии из левой и правой доли. Повторная биопсия проведена у 11 детей.
Для гистологического исследования материал фиксировали в 10 % нейтральном растворе формалина (рН=7,4) и заливали в парафин. С каждого
блока делали до 30 - 40 парафиновых срезов толщиной 5-6 мкм, по 6 срезов на стекле, которые окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу Ван-Гизона, хромотропом 2В в модификации Н. 3. Слинченко (1964), орсеином по методу Шиката [Меркулов Г.А., 1969]. Для выявления соединений железа ставили реакцию на берлинскую пазурь [Меркулов Г.А., 1969]. Нейтральные жиры окрашивали Суданом IV, проводили ШИК -реакцию по Мак-Манусу [Меркулов Г.А., 1969]. Адекватным для диагностики считался биоптат при наличии в нём структур 3-4 портальных трактов.
Морфометрическое исследование биоптатов проводили при увеличении в 600 раз с помощью окулярной стереометрической сетки [Автандилов Г.Г., 1972; 1990; 1994]. Определяли объёмную долю гепатоцитов (отдельно из них с явлениями дистрофии, с двумя и более ядрами), портальных трактов, синусоидов, инфильтратов и участков некроза. Также измеряли объёмную долю элементов портальных фактов (дуктулы, сосуды, волокна, фибробласты, лимфоциты) и клеточный состав перипортальных, внутридольковых воспалительных инфильтратов (нейтрофилы, эозинофилы, фибробласты, лимфоциты, плазмоциты, гистиоциты). В каждом случае использовали результаты оценок 10 случайных наложений окулярной сетки, имеющей 25 тест-точек, на гистологический срез биоптата, избегая краевых участков. По числу совпадений тест-точек с изучаемыми параметрами, отнесённых к общему числу точек, соответствующих срезу, получали объёмную долю изучаемых параметров.
Оценка гистологических изменений в печени проводилась с помощью классификации, предложенной В.В. Серовым и Л.О. Севергиной (1996), в которой разработана ранговая система счёта, учитывающая степень активности ХГ - гистологический индекс степени активности (ГИСА), как для моноинфекции (ХГВ или ХГС), так и в случаях коинфекций В и С. В ней даны основные морфологические параметры для полуколичественной системы учёта: некрозы гепатоцитов, дистрофия гепатоцитов, воспалительный инфильтрат, изменения синусоидов и поражение желчных протоков.
В связи с многообразием изменений и выраженностью отдельных показателей разработаны критерии в баллах для разной степени активности
процесса: слабой, умеренной, выраженной при ХГС, ХГВ и их сочетаниях. Слабая степень активности для ХГВ соответствует 1-14 баллам, ХГС - 1-18 баллам, умеренная степень аетивности - соответственно 15 - 27 и 19-40 баллам; выраженная степень активности - соответственно 28 - 42 и 41-66 баллов.
Для учёта выраженности фиброза - гистологического индекса стадии хронизаиии (ГИСХ) выделяют: слабый фиброз (1 стадия хронизации) - 1-4 балла, умеренный фиброз (2 стадия хронизации) -5-8 баллов, тяжелый фиброз (3 стадия хронизации) - 9-12 баллов, цирроз (4 стадия хронизации) -13-16 баллов.
Этот метод позволяет более подробно рассмотреть все морфологические изменения в биоптате и обладает большей гибкостью для интерпретации полученных результатов.
Статистический анализ количественных данных производили на персональном компьютере с использованием пакетов статистических прикладных программ npoi-раммы "Statistica 6.0" с определением достоверности средних величин (путём расчёта критерия Стьюдента t), и использованием методов линейного корреляционного, и кластерного анализов.
![Клинико-эпидемиологическая характеристика сахарного диабета у детей в Калининградской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4375/188177.png "Клинико-эпидемиологическая характеристика сахарного диабета у детей в Калининградской обл. [Электронный ресурс] Науменко Светлана Леонидовна")
