Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1 Хронический гепатит С: патогенез, клиническая эволюция и исходы 9
1.2 Механизмы прогрессирования фиброза при хроническом гепатите С, формирования цирроза и синдрома портальной гипертензии 13
1.3 Генетические факторы и фиброгенез при хроническом гепатите С 26
1.4 Роль ренин-ангиотензиновой системы при хроническом гепатите С 30
1.5 Роль оксидативного стресса при хроническом гепатите С 37
1.6 Роль эндотелиальной дисфункции при хроническом гепатите С 42
ГЛАВА 2. Объект, материалы и методы исследования 52
2.1 Контингент 52
2.2 Методы обследования больных 52
2.3 Оценка клинико-лабораторных проявлений тяжести заболевания 53
2.4 Оценка скорости прогрессирования фиброза печени 56
2.5 Определение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы, оксидативного стресса и эндотелиальной дисфункции 59
2.6 Статистическая обработка результатов 65
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 67
3.1 Анализ распределения полиморфных маркеров исследованных генов у больных HCV-инфекцией и в группе сравнения 67
3.2 Анализ распределения полиморфных маркеров исследованных генов у больных хроническим гепатитом С и циррозом печени в его исходе 69
3.3 Анализ распределения полиморфных маркеров исследованных генов у больных ХГС на разных стадиях фиброза печени 75
3.4 Анализ влияния полиморфизма исследованных генов на скорость развития фиброза печени у больных ХГС 77
3.5 Анализ влияния полиморфизма исследованных генов на формирование портальной гипертензии у больных с хронической HCV-инфекцией 84
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 95
4.1 Однофакторный анализ 95
4.2 Многофакторный анализ и построение прогностических шкал 103
Заключение106
Список сокращений 107
Список литературы 111
- Механизмы прогрессирования фиброза при хроническом гепатите С, формирования цирроза и синдрома портальной гипертензии
- Оценка клинико-лабораторных проявлений тяжести заболевания
- Анализ распределения полиморфных маркеров исследованных генов у больных хроническим гепатитом С и циррозом печени в его исходе
- Многофакторный анализ и построение прогностических шкал
Введение к работе
Актуальность темы
Естественное течение хронического гепатита С (ХГС) — особенности клинической картины заболевания, темпы прогрессирования фиброза печени и формирование цирроза печени (ЦП), а также развитие таких осложнений, как гепатоцеллюлярная карцинома и аутоиммунные синдромы — индивидуально и варьирует в широких пределах. Лечение больных ХГС представляет собой до конца нерешенную проблему. Современные трехкомпонентные схемы противовирусной терапии (ПВТ) улучшают результаты традиционной — двухкомпонентнои — схемы только в 1,5 раза, но при этом число нежелательных эффектов возрастает, что в совокупности с высокой стоимостью лечения требует более четкого отбора больных с высоким риском быстрого прогрессирования заболевания для проведения ПВТ (Абдурахманов Д.Т., 2013, Моисеев СВ., 2010). В связи с этим продолжается поиск предикторов неблагоприятных исходов ХГС.
Известно, что употребление алкоголя, мужской пол, раса (не европейская), возраст старше 40 лет к моменту инфицирования, нарушение обмена железа, ожирение и инсулинорезистентность, иммуносупрессивная терапия, а также коинфекция вируса иммунодефицита человека или гепатита В ускоряют фиброгенез при ХГС и трансформацию его в ЦП (Рекомендации по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом С, 2013, Ивашкин В.Т. и Павлов Ч.С., 2011, Asselah Т. et al., 2007, Poynard Т. et al., 1997). Формирование ЦП определяется прогрессирующим фиброзом ткани печени, а также ремоделированием её сосудов, приводящим к повышению печёночного внутрисосудистого сопротивления и развитию портальной гипертензии (ПГ). Воспалительные реакции в ответ на повреждение вирусом играют главную роль в инициации процессов фиброзирования печени. Однако важную роль играют и медиаторы, активирующие локальные и системные механизмы фиброгенеза, такие как оксидативный стресс (ОС), активация ренин-ангиотензиновой системы (РАС), ангиогенез и нарушение функционального состояния эндотелия (эндотелиальная дисфункция — ЭД).
Наблюдающаяся при повреждении печени гиперпродукция реактивных форм кислорода ассоциируется со снижением образования и биодоступности NO в паренхиме печени — синусоидальной ЭД. Эта связь реализована через фермент
NADPH-оксидазу, состоящий из нескольких субъединиц. Субъединица p22-phox, кодируемая геном CYBA, необходима для ферментативной активности NADPH-оксидазы. При индуцированном фиброзе печени отмечено и снижение активности eNOS по сравнению с контрольной группой (Diesen D.L. and Kuo Р.С., 2011). Носительство аллели 894Т гена NOS3, кодирующего эндотелиальную NO-синтазу (eNOS), ассоциировано с нарушением работы фермента и, как следствие, со снижением концентрации NO в плазме. Полиморфизм С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) — одного из ключевых ферментов метаболизма гомоцистеина, избыток которого вызывает оксидативное повреждение эндотелия и способствует развитию ЭД, — опосредует образование менее активного варианта фермента и недостаточную элиминацию гомоцистеина из кровотока. В развитии фиброза и ЦП большое значение имеют процессы активации локальной тканевой РАС, все ключевые компоненты которой при ХГС экспрессируются в повреждённой печени. Повышение концентрации ангиотензина II в печёночной ткани приводит к фиброгенезу (Bataller R. et. al., 2005). Генетическое же или фармакологическое блокирование РАС замедляет фиброгенез в печени.
Взаимосвязь полиморфизма генов-кандидатов РАС, ОС и ЭД с прогрессированием фиброза, развитием ПГ и ответом на ПВТ изучена мало. Представляется актуальным определение влияния точечных мутаций в генах, кодирующих механизмы фиброза, на течение ХГС (Asselah Т. et al., 2007, Lee U.E. and Friedman S.L., 2011).
Цель исследования. Оценить клиническую и прогностическую значимость носительства аллельных вариантов генов, кодирующих компоненты РАС, а также белки, участвующие в регуляции функции эндотелия и развитии ОС, у больных ХГС.
Задачи исследования 1. У больных с хронической HCV-инфекцией и в группе сравнения изучить и сопоставить характер распределения генотипов и аллелей полиморфных локусов генов, вовлеченных в регуляцию функции эндотелия: G894T гена NOS3 и С677Т гена MTHFR, развитие ОС: С242Т гена CYBA, а также генов, кодирующих компоненты РАС: М235Т и G(-6)A гена AGT, Al 166С гена ATR1.
-
Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов отобранных генов и их комбинаций у больных ХГС и ЦП и выявить клинические и генетические факторы, наиболее значимые для трансформации ХГС в ЦП.
-
Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов отобранных генов у больных с различной скоростью фибротических изменений в печени и оценить вклад генетических и клинико-демографических параметров в прогрессиро-вание фиброза.
-
Выявить генотипы и аллельные варианты генов NOS3, CYBA, MTHFR, ATR1, AGT, а также их комбинации, обладающие наибольшей прогностической ценностью в отношении развития синдрома ПГ у больных с хронической HCV-инфекцией.
Научная новизна
Впервые проведён комплексный анализ распределения вариантных генотипов и аллелей шести полиморфных локусов генов РАС, ОС и ЭД у пациентов с хронической HCV-инфекцией (162 человека) российской популяции.
Впервые выявлены генотипы исследованных полиморфных генов, ассоциированные с быстрым темпом прогрессирования фиброза печени, развитием и тяжестью синдрома ПГ и трансформацией ХГС в ЦП и установлена прогностическая значимость проведения генотипирования у больных ХГС по указанным полиморфным локусам.
Практическая значимость
Разработана прогностическая модель оценки вероятности быстрого прогрессирования фиброза у больных ХГС на основании комбинации генетических и клинико-демографических параметров.
Выявлены генетические и клинико-демографические факторы
предрасположенности к развитию синдрома ПГ у больных ХГС и их относительная значимость.
Основные положения, выносимые на зашиту
1. ТТ-генотип полиморфизма С242Т гена CYBA и АА-генотип полиморфизма
G-6A гена AGT более распространены у больных с ЦП в исходе ХГС, чем у
больных ХГС без цирротической трансформации. При оценке комбинированного
воздействия наследственных и клинико-демографических факторов
формирование ЦП в исходе ХГС в наибольшей степени ассоциируется с возрастом больных и наследованием 242ТТ-генотипа гена CYBA.
-
У больных с хронической HCV-инфекцией и быстрым темпом прогрессирования фиброза печени чаще, чем у лиц с медленным темпом нарастания фиброза, встречаются 242ТТ генотип гена CYBA, (-б)А аллель и (-б)АА генотип гена AGT, а также 235Т аллель и 235МТ генотип гена AGT, что указывает на их «профиброгенный» эффект.
-
Наиболее прогностически ценными независимыми предикторами быстрого развития фиброза у больных ХГС при отсутствии сопутствующих факторов поражения печени служат: возраст на момент инфицирования, (-б)АА генотип гена AGT, мужской пол, 242ТТ генотип гена CYBA и 235МТ генотип гена AGT.
-
Развитие синдрома ПГ ассоциируется с носительством (-б)АА генотипа гена AGT и 242ТТ генотипа гена CYBA и с отсутствием 235ТТ генотипа гена AGT.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику гепатологического отделения Университетской клинической больницы №3 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова и в практику преподавания курса внутренних болезней сотрудниками кафедры внутренних болезней ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на совместном заседании сотрудников кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова (21 апреля 2014 г.).
Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени — поиск инноваций» (Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе, 2 статьи в журналах, включённых в перечень ВАК РФ, 1 монография в соавторстве и 1 глава в монографии.
Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в обследовании больных, проведении молекулярно-генетнческого анализа, составлении базы данных и их статистической обработке, написании научных публикаций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на русском языке на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав — «Обзор литературы», «Объект, материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований» и «Обсуждение результатов», выводов и практических рекомендаций, иллюстрирована 23 таблицами и 29 рисунками. Список литературы содержит 267 источников, из них 66 работ отечественных авторов.
Базы проведения работы. Клиническое исследование проводилось на базе кафедры внутренних болезней ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева Университетской клинической больницы №3 Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (заведующий кафедрой и директор клиники — академик РАН, д.м.н., профессор Н.А.Мухин). Молекулярно-генетический анализ проводился в научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова (заведующий лабораторией — академик РАН, д.б.н., профессор В.А. Ткачук).
Механизмы прогрессирования фиброза при хроническом гепатите С, формирования цирроза и синдрома портальной гипертензии
Хотя фиброз печени – необходимый элемент её цирротической трансформации, per se он не оказывает существенных функциональных (и клинически значимых) эффектов. При циррозе печени, помимо диффузного фиброза, появляются васкуляризованные порто-центральные септы, формируются внутрипечёночные сосудистые шунты между афферентными (воротная вена и печёночные артерии) и эфферентными (печёночные вены) сосудами печени, происходит капилляризация синусоидов и формируются узлы-регенераты ткани печени, приводящие к нарушению дольковой структуры органа [45, 46, 214]. Цирроз характеризуется также перисинусоидальным фиброзом, сосудистым тромбозом, облитерацией портальных трактов и печёночных вен, недостатком перфузии паренхимы долек и последующей тканевой гипоксией. Было показано, что фиброз и ангиогенез в печени развиваются синергично [160] и однозначно сопутствуют её хроническим заболеваниям, независимо от этиологии [117]. Фиброзная ткань повышает сосудистое сопротивление и нарушает доставку кислорода, сохраняя гипоксию. Гипоксия же индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток в печени и ремоделирование сосудов, что в присутствии стойкого повреждения паренхимы ведет к дальнейшему прогрессированию фиброза печени – замыкается порочный круг. Неоваскуляризация изменяет архитектонику печени, сосудистое сопротивление повышается, а перфузия паренхимы – снижается, возникает портальная гипертензия [45, 209, 214]. Все формы цирроза характеризуется дефенестрацией синусоидального эндотелия и наличием субэндотелиальной базальной мембраны (капилляризацией синусоидов). Исчезновение нормального фильтрационного барьера приводит к нарушению двунаправленного обмена между кровью в синусоидах и паренхиматозными клетками [95], что приводит к печёночной недостаточности [126].
Повышенное печёночное внутрисосудистое сопротивление (пусковой механизм формирования портальной гипертензии) – следствие изменений архитектоники печени (фиброза тканей, тромбоза, коллагенизации пространства Диссе и формирования узлов регенерации), шунтирования крови между афферентными и эфферентными сосудами печени [214], а также эндотелиальной дисфункции, ведущей к внутрипечёночной вазоконстрикции [135]. Вторично увеличивается спланхнический кровоток, который поддерживает и усугубляет повышенное давление в воротной вене, приводит к развитию синдрома гипердинамического кровообращения: увеличению частоты сердечных сокращений, сердечного выброса, объёма циркулирующей плазмы и снижению общесосудистого сопротивления [92]. Если фиброз, по крайней мере, частично обратим, нарушение архитектоники и тем более сосудистые шунты в фиброзных полях при циррозе подвергаются обратному развитию настолько медленно, что их можно считать необратимыми с учётом ожидаемой продолжительности жизни больного [45, 113, 186, 214]. Клетками, ответственными за формирование фиброза печени, являются миофибробласты, основным источником которых считаются звёздчатые клетки печени (ЗКП, клетки Ито) [68, 96, 125], а также активированные портальные фибробласты [85] и циркулирующие фиброциты костномозгового происхождения [96]. В нормальной печени клетки Ито находятся в перисинусоидальном пространстве (пространстве Диссе) и выполняют множество функций: служат основным резервуаром витамина А, принимают участие в органогенезе и регенерации печени, перестройке ВКМ, выполняют иммуномодулирующую функцию, секретируют липопротеиды, цитокины и факторы роста, а также регулируют просвет синусоидов путём продукции вазоактивных веществ [125].
В условиях же персистирующего повреждения печени в ответ на воспалительные и профиброгенные стимулы от всех соседних типов клеток (повреждённых гепатоцитов, эндотелия синусоидов, резидентных макрофагов печени – Купферовских клеток, тромбоцитов и лимфоцитов) [125, 214] «спящие» ЗКП подвергаются фенотипической активации в миофибробласты: начинают экспрессировать -гладкомышечный актин, теряют ретиноиды, активно пролиферируют, мигрируют в очаг повреждения, приобретают фиброгенные и контрактильные свойства (рис. 3).
Оценка клинико-лабораторных проявлений тяжести заболевания
Гомоцистеин – аминокислота, образующаяся из метионина. Нормальная концентрация в плазме составляет 5-16 ммоль/л. Внутриклеточный метаболизм гомоцистеина включает реметилирование в метионин и транссульфирование в цистеин. В плазме гомоцистеин окисляется в дисульфиды и смешанные дисульфиды и находится как в свободной форме, так и связанным с белком (общий го-моцистеин). Механизм токсического действия гомоцистеина определяется несколькими биохимическими каналами [59]. Во-первых, гипергомоцистеинемия в последние годы признана одним из факторов, способствующим формированию эндотелиальной дисфункции. Метаболиты гомоцистеина: гомоцистин, смесь дисульфидов и тиолактона гомоцистеи-на – вызывают повреждение эндотелиальных клеток, обнажение субэндотелиаль-ного матрикса и гладкомышечных клеток. Повышение уровня гомоцистеина в крови имеет выраженный тромбофилический эффект. Избыток гомоцистеина способствует экспрессии тканевого фактора свёртывания, а также активации V и XII факторов. Высвобождение естественных антиагрегантов и протеина С – ингибитора внешнего пути свёртывания крови – при этом нарушается; снижается глико-заминогликанзависимая активация антитромбина III, подавляется активность тромбомодулина. Наряду с этим, наблюдается повышенная агрегация тромбоцитов вследствие снижения синтеза эндотелием релаксирующего фактора и NO, а также усиленного высвобождения фактора Виллебрандта повреждёнными ЭК. Гомоцистеин инициирует образование продуктов перекисного окисления липи-дов, которые способствуют уменьшению экспрессии NOS3 и снижению синтеза NO эндотелиоцитами. При нормальном уровне гомоцистеина крови эндотелиаль-ная окись азота в присутствии кислорода полностью связывает его с образованием мощного вазодилататора и антиагреганта – S-нитрозогомоцистеина, период полужизни которого оставляет около 15 минут. «Избыток» гомоцистеина при ги-пергомоцистеинемии остаётся неинактивированным, благодаря чему что эндотелий повреждается и развивается эндотелиальная дисфункция [36, 53].
Гипергомоцистеинемия является независимым фактором риска развития артериальных тромбозов, включая тромбозы коронарных и церебральных сосудов, венозных тромбозов (глубоких вен и тромбоэмболии лёгочной артерии) [247]. При деменции, в частности, болезни Альцгеймера, содержания гомоцистеина в крови повышено, и эту ассоциацию объясняют развитием изменений в сосудах мозга. Cуществуют свидетельства того, что гипергомоцистеинемия нарушает внутриклеточный метаболизм липидов, что ведёт к развитию, с одной стороны, атеросклероза [60], а с другой – стеатоза печени [63]. Возникновение гипергомоцистеинемии и связанных с ней патологических состояний может происходить в результате нарушения функции ферментов, участвующих в фолатном обмене. Фолатный цикл представляет собой сложный каскадный процесс, контролируемый ферментами, которые в качестве коферментов имеют производные фолиевой кислоты: метионинсинтаза, кофактором которой является кобаламин; 5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) и бетаин-метионинметилрансфераза. Фермент MTHFR, который состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой около 70 кДа, переводит фолиевую кислоту в её активную форму – 5-метилтетрагидрофолат [60].
Полиморфизм гена Ген MTHFR состоит из 11 экзонов и расположен на коротком плече хромосомы 1 (1р36.3) [60]. Самыми распространёнными аллельными вариантами гена MTHFR считаются замена цитозина на тимин в положении 677 (С677Т) и аланина на цитозин в локусе 1298 (А1298С). Встречаются и другие нуклеотидные замены, вызывающие тяжёлую недостаточность фермента, но они крайне редки [161].
Миссенс-мутация С677Т, вызывает в положении 222 каталитического домена белка-фермента замену аланина на валин (Ala222Val) [128]. Мутантная аллель 677Т распределена в популяциях с высокой гетерогенностью: в Европе от 0,19 (Великобритания) до 0,55 (Испания), в азиатских популяциях – от 0,02 (Индонезия) до 0,38 (Китай); в Африке – от полного отсутствия (у народности денди) до 0,09 (у представителей племени берба), в Западном полушарии частота встречаемости аллели 677Т колеблется от 0,11 (у афроамериканцев Южной Каролины) до 0,45 (у индейцев Бразилии). В России частота встречаемости аллели составляет 0,29 у жителей московского региона и 0,32 у жителей Сибири [60].
Клиническое значение
У гомозигот по полиморфной аллели 677Т in vitro активность MTHFR снижена на 70%, а у гетерозигот – на 35%, что связано с повышением термолабильности фермента [60]. У носителей ТТ-генотипа закономерно уровень гомоцистеина повышен (примерно в 2 раза по сравнению с носителями CC-генотипа) [123, 130, 152]. Аллель Т связана с четырьмя группами многофакторных заболеваний: сердечно-сосудистыми, дефектами развития плода, колоректальной аденомой и раком молочной железы и яичников. Много исследований посвящено оценке риска сердечно-сосудистых заболеваний (церебрального инфаркта, аритмий и ишемических атак) при полиморфизме С667Т гена MTHFR, однако результаты этих работ противоречивы. У носителей ТТ-генотипа полиморфизма С667Т возрастает риск развития венозных и артериальных тромбозов [109, 158].
Гипергомоцистеинемия нарушает внутриклеточный метаболизм липидов и способствует развитию стеатоза печени, а стеатоз печени ухудшает течение ХГС. В связи с этим полиморфизм гена MTHFR некоторыми авторами рассматривался как возможный предиктор неблагоприятного течения заболевания и/или отсутствия ответа на ПВТ [63, 91, 122, 242, 261].
Скорость развития фиброза печени, трансформация в цирроз, развитие осложнений и системных проявлений у больных хроническим вирусным гепатитом С определяется множеством факторов и потому варьирует в широких пределах. Для конкретного больного ни один известный клинический или демографический признак, как и их сочетание, не обладают высокой прогностической ценностью [223]. Развитие новых технологий в медицине, в первую очередь генетических исследований, позволило приблизиться к решению этой проблемы [72]. В настоящее время в мире уже проведены и ещё продолжаются многочисленные исследования, изучающие взаимосвязь между точечными мутациями различных генов-кандидатов и темпами прогрессирования фиброза, развитием портальной гипертензии и ответом на противовирусную терапию у пациентов с ХГС. Так, анализ полиморфизма генов интерлейкина 28В и белка IP10 помогает выявить среди больных ХГС с 1-м генотипом HCV РНК группу с потенциально высокой эффективностью стандартной терапии, а мутация гена, кодирующего инозинтрифосфатазу, прямо коррелирует с развитием рибавирин-индуцированной анемии [35, 56, 101, 107, 121, 201]. H. Huang et al. [144] на основе точечных нуклеотидных замен в 7 генах разработали шкалу риска развития цирроза (Cirrhosis Risk Score, CRS), которая может прогнозировать прогрессирование фиброза лучше, чем клинические параметры. Эта шкала была получена методом полногеномного скрининга аллельных ассоциаций, и роль в фиброгенезе 5 из 7 выявленных генов до сих пор неизвестна [144]. Другим подходом является поиск генов-кандидатов из числа тех, что кодируют медиаторы, вовлеченные в процессы апоптоза гепатоцитов, воспаления, ангиогенеза, в регуляцию оксидативного стресса и функционального состояния эндотелия. Однако результаты их неоднозначны и зачастую противоречивы. В России и на российской популяции больных подобные работы малочисленны.
Хронический гепатит С – многофакторное заболевание, в его развитии участвует множество генов и факторов среды и прогностическая ценность выявления одного полиморфного локуса относительно невелика. Информативность такого типа исследований выше при проведении в многочисленных группах с изучением нескольких генов, ответственных за какой-либо один важный патогенетический механизм. На базе нашего факультета уже был проведён анализ влияния на скорость развития фиброза и особенности клинического течения ХГС полиморфизма генов, связанных с развитием воспаления и инициацией активации ЗКП: ключевого медиатора фиброгенеза – TGF-1, провоспалительных (IL-1, IL-6, TNF-) и противовоспалительного (IL-10) цитокинов и гена врождённого гемохроматоза [1, 2, 24, 51]. Данная работа посвящена дальнейшему поиску ассоциаций полиморфизма генов, кодирующих другую группу тесно связанных между собой медиаторов с течением ХГС, формированием цирроза печени и портальной гипертензии. При объединении результатов ряда подобных исследований мы рассчитываем разработать шкалу оценки риска агрессивного течения хронического гепатита С у конкретного пациента по совокупности полиморфных генетических маркеров – «генетической подписи», – которая позволит персонализировать ведение таких больных.
Анализ распределения полиморфных маркеров исследованных генов у больных хроническим гепатитом С и циррозом печени в его исходе
При сравнении распределения аллелей и генотипов гена AGT (локусы G-6A и M235T), а также полиморфизма A1166C гена ATR1 в группах больных с хронической HCV-инфекцией и наличием и отсутствием признаков портальной гипертензии статистически значимых отличий выявлено не было (табл. 22).
При этом в группе больных с признаками ПГ распределение вариантных маркеров гена AGT по локусам G-6A и M235T и гена ATR1 по локусу A1166C не имело значимых отличий от такового в группе сравнения (табл. 22). В группе же больных с отсутствием признаков ПГ относительно группы сравнения достоверно реже встречались минорная аллель (-6)A (37,5% против 22,7%; р=0,0016) и «мутантный» генотип (-6)AA гена AGT (15,6% и 27,1%; соответственно; р=0,0227), и чаще – аллель (-6)G (60,9% против 47,8%; р=0,0016) и генотип GG (37,5% и 22,7%, соответственно; р=0,0043). Распределение частот всех трех генотипов полиморфизма G-6A гена AGT в группе с отсутствием ПГ и в группе сравнения имело уровень значимости различий р=0,0064. Значимых различий частот вариантных маркеров гена AGT по локусу M235T и гена ATR1 в группе с отсутствием ПГ и в группе сравнения выявлено не было (табл. 22).
В подгруппе больных с декомпенсированной ПГ по сравнению с подгруппой компенсированной ПГ наблюдалась тенденция к более частому выявлению минорной аллели (-6)A (50,0% и 33,3%, соответственно, р=0,0604) и меньшей распространённости генотипа (-6)GG (28,9% и 50,0%, соответственно, р=0,0823) гена AGT (табл. 23). Различия в распределении полиморфных маркеров гена AGT по локусу M235T гена AGT и гена ATR1 по локусу A1166C в группах с компенсированной и декомпенсированной ПГ не были статистически значимы (табл. 23). Не выявлено статистически достоверных различий в распределении частот вариантных аллелей и генотипов генов РАС в группе с декомпенсированной ПГ относительно группы сравнения (табл. 23).
В то же время, в группе с компенсированной портальной гипертензией относительно группы сравнения достоверно чаще выявлялось носительство GG-генотипа гена AGT по локусу G-6A (42,9% против 22,7%; р=0,0371) и реже – носительство двух других генотипов (табл. 23). Недостоверными были и различия в распределении аллелей и генотипов генов РАС при попарном сравнении групп как с компенсированной, так и с декомпенсированной ПГ с группой больных с хронической HCV-инфекцией без признаков ПГ (табл. 24). Таблица 24 – Распределение аллелей и генотипов генов РАС у больных с хронической
При многофакторном анализе совместного влияния генетических и клинико-демографических факторов на формирование ПГ статистически достоверным было только негативное влияние показателей возраста больных на момент последнего обследования и их индекса массы тела (табл. 27). Эффект обоих клинических факторов на формирование предрасположенности к развитию ПГ превышал влияние полиморфизма исследованных генов, делая его статистически незначимым (табл. 27, 28). Таблица 25 – Многофакторный анализ вклада клинических и отобранных генетических факторов в развитие синдрома портальной гипертензии у больных ХГС
Уровень значимости =r UUI При исключении из модели логистической регрессии общепопуляционных факторов риска развития ПГ (возраста и идекса массы тела) проявился эффект полиморфизма исследованных генов. Наибольшее весомым генетическим маркером формирования ПГ служил (-6)AA генотип гена AGT (статистика Вальда 6,07). Однонаправленный с ним, но менее выраженный эффект оказывало носительство мутантного 242ТТ-генотипа гена CYBA (статистика Вальда 4,73). Наследование ТТ-генотипа полиморфизма M235T гена AGT снижало вероятность формирования синдрома ПГ. Статистическая значимость полученной модели логистической регрессии р=0,03589 (табл. 27). Аналогичное сочетанное влияние комбинация исследованных генов оказывала на декомпенсацию портальной гипертензии у больных с хронической HCV-инфекцией (табл. 28). Таблица 27 - Многофакторный анализ влияния полиморфизма исследованных генов на
формирование синдрома портальной гипертензии у больных ХГС N=162 Model: Logistic regression (logit) N of 0 s: 98 1 s: 64 (Итоговая база ХГС) Dep. var: ПГТ Да/Нет Loss: Max likelihood (MS-err. scaled to 1) Final loss: 101,94958927 Chi?( 6)=13,491 p=,03589
При ранжировании эффекта наследования изученных генотипов на формирование синдрома ПГ наиболее значимым был вклад полиморфизма G-6A гена AGT, далее следовали полиморфизм M235T гена AGT и C242T гена CYBA. ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В данной работе проводился поиск ассоциаций носительства вариантных маркеров генов регуляции функции эндотелия, оксидативного стресса и РАС и их комбинаций с клиническими особенностями течения хронического гепатита С. Прежде всего, оценивалась связь наследования определенных аллелей и генотипов с предрасположенностью к трансформации в цирроз печени. Формирование цирроза определяется прогрессирующим фиброзом ткани печени, а также ремо-делированием её сосудов, приводящим к повышению печёночного внутрисосуди-стого сопротивления и развитию портальной гипертензии, и эти процессы идут параллельно, взаимно усугубляя друг друга. Поэтому следующим этапом исследования был анализ взаимосвязи наличия полиморфных генетических маркеров у больных с ХГС и циррозом печени в его исходе со скоростью фибротических изменений в печени, с одной стороны, и с развитием синдрома портальной гипер-тензии – с другой. Чтобы установить клиническое значение найденных корреляций, на каждом этапе работы проводился многофакторный анализ с включением отобранных генетических и известных клинико-демографических факторов.
Всего было обследовано 162 больных, в возрасте от 18 лет до 81 года, из них 48 мужчин и 114 женщин. Высокая доля пациентов с F3 — F4 стадиями фиброза, а также отсутствие больных со стадией фиброза F0 объясняются особенностями рассматриваемой выборки — пациенты с манифестным течением заболевания, нуждавшиеся в стационарном лечении в гепатологическом отделении, — а также целенаправленным отбором больных с циррозом для получения сопоставимых по численности и представительных для генетических исследований групп. Преобладание женщин в основной группе обусловлено жёсткими критериями исключения (мужчины чаще не включались в исследование из-за злоупотребления алкоголем или наличия коинфекции ВИЧ или вирусов гепатита В и дельта).
Ключевую роль в развитии синусоидальной эндотелиальной дисфункции отводят внутрипечёночному оксидативному стрессу, при котором гиперпродукция РФК ассоциируется со снижением образования и биодоступности NO [143]. Эта связь реализована через фермент NADPH-оксидазу, состоящую из нескольких субъединиц. Субъединица p22-phox, кодируемая геном CYBA, необходима для ферментативной активности NADPH-оксидазы, а генетически обусловленное изменение активности или экспрессии этого белка могут влиять на течение многих заболеваний, связанных с оксидативным стрессом. В доступной нам литературе мы не встретили работ, посвящённых роли полиморфизма гена CYBA C242T на течение и прогноз хронических заболеваний печени. Функциональное и клиническое значение полиморфизма C242T гена CYBA при различных заболеваниях противоречиво. В работе T. Guzik et al. [136] было показано снижение базальной и стимулированной активности фермента у больных атеросклерозом с носительством 242T-аллели. С этими данными согласовывались исследования, показавшие протективную роль Т-аллели в отношении развития инфаркта миокарда и кардиоэмболического инсульта (независимо от других факторов риска атеросклероза) [146, 163]. Напротив, в крупном проспективном исследовании LCAS С. Cahilly et al. установили строгую ассоциацию носительства Т-аллели с прогрессированием ИБС и сужением диаметра коронарных артерий [98]. M. Perianayagam et al. обнаружили, что у носителей T-аллели имелась выраженная тенденция к более длительной госпитализации, большей частоте диализа и внутрибольничной смерти по сравнению с носителями CC-генотипа [212]. A. Hodgkinson et al. [140] обнаружили неблагоприятный эффект носительства 242T-аллели на развитие диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом 1 типа, в то же время S. Matsunaga-Irie et al. [184] показали, что у пациентов с диабетом 2 типа носительство 242Т-аллели снижало риск развития диабетической нефропатии. Мета-анализ 6 работ, посвящённых связи этого полиморфизма с развитием ишемических сосудисто–мозговых заболеваний, выявил повышение риска ишемического инсульта в бассейне крупных мозговых артерий у носителей 242TT генотипа [169]. Наконец, в работе M. Moreno et al. [193] у нормотензивных лиц с носительством Т-аллели и с СС-генотипом активность NADPH-оксидазы не различалась.
Многофакторный анализ и построение прогностических шкал
Присутствие 235Т-аллели и 235ТТ генотипа гена AGT, согласно данным литературы, предопределяет склонность к ряду заболеваний, прежде всего, к артериальной гипертензии, а также к инсульту, диабетической нефропатии и инфаркту миокарда [154].
В нашей работе частоты минорной аллели Т по локусу M235T у больных с хронической HCV-инфекцией и в группе сравнения статистически не различались и составили 50,0% и 48,0%, соответственно (p=0,5622), как и распределение частот генотипов (p=0,3931). Носители 235Т-аллели (генотипы МТ и ТТ) достоверно чаще встречались в группе с быстропрогрессирующим фиброзом, носительство же «дикого» гомозиготного генотипа ММ можно считать благоприятным прогностическим фактором и маркером медленного прогрессирования фиброза у больных ХГС (ОШ ММ=0,33). Имеется высокая степень сцепления полиморфных ло-кусов G(-6)A и М235Т гена AGT, наследование минорных аллелей по каждому из локусов коррелирует как с повышением концентрации ангиотензина II в плазме, так и с предрасположенностью к различным заболеваниям, а носительство обоих полиморфных маркеров приводит к синергетическому усилению генетического эффекта [154, 249]. По нашим данным, наследование 235Т-аллели, как и наследование (-6)G-аллели, является неблагоприятным маркером в отношении скорости прогрессирования фиброза при ХГС (ОШ Т=1,76). В доступной нам литературе была обнаружена лишь одна публикация, посвящённая связи полиморфизма М235Т гена AGT с тяжестью поражения печени — работа E.H. Forrest et al. [124], в которой 195 пациентов с ХГС были разделены на 3 группы (0—1 стадия фиброза по Ishak, 2—3 стадии и 4—6 стадии). Распределение в этих группах аллельных вариантов генов AGT (по локусам M235T и G(-6)A), АПФ и ATR1, согласно шотландским авторам [124], не имело достоверных отличий. Необходимо отметить, что в исследовании E.H. Forrest et al. [124] не учитывалась длительность инфекции, а значит, в группу «мягкого» или «промежуточного» фиброза могли попадать и больные с кратким анамнезом заболевания, у которых при дальнейшем наблюдении трансформация в цирроз печени могла произойти менее, чем через 20 лет от момента инфицирования. Это обстоятельство, а также различия исследованных популяций и шкал полуколичественной оценки стадий фиброза могут объяснить расхождение результатов данной работы и данных E.H. Forrest et al. [124]. По нашим данным, наследование мутантной аллели 235Т гена AGT в 1,76 раза повышало риск быстрого прогрессирования фиброза у больных ХГС, при этом у гетерозигот МТ риск высокого темпа нарастания фибротических изменений в печени был выше в 2,26 раз, а наследование «дикого» ММ генотипа оказывало протективный эффект и снижало этот риск в 3 раза.
По данным H. Yoshiji et al. [259], АТ1-Рц играют ключевую роль в развитии фибротических изменений при хронических заболеваниях печени. В экспериментах на мышах с делецией гена ATR1 было показано, что у АТR1-нокаутных мышей по сравнению с животными дикого типа отмечается уменьшение активности воспаления, снижение содержания продуктов перекисного окисления липидов и выраженность фиброза и стеатоза печени [156, 197]. Полиморфизм A1166C гена ATR1 является фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (аллель 1166С ассоциируется с повышением риска ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, гипертонии, диабетической нефропатии, депрессии и легочной гипертензии) и фибротических изменений в различных органах [53]. S. Sookoian et al. [236] обнаружили, что среди больных ЦП вирусной (HCV) и алко 103 гольной этиологии у носителей «дикого» АА генотипа терапевтический эффект на системную гемодинамику 12-недельного введения лозартана в дозе 25 мг/д возникал чаще, чем у носителей АС и СС генотипов. Единственной публикацией, по-свящённой анализу взаимосвязи полиморфизма A1166C гена ATR1 со стадией фиброза печени у больных ХГС, была работа E.H. Forrest et al. [124], в которой подобной корреляции не наблюдалось. По нашим данным, распределение генотипов и аллелей гена ATR1 у пациентов с HCV-инфекцией не отличалось от такового в группе сравнения и находилось в соответствии с распределением Харди– Вайнберга. Значимых корреляций носительства полиморфизма A1166C гена ATR1с тяжестью течения и прогнозом ХГС в нашей работе, как и в статье E.H. Forrest et al. [124], найдено не было.
Многофакторный анализ и построение прогностических шкал Однофакторный анализ выявил связь носительства некоторых вариантных аллелей и генотипов с особенностями течения хронического гепатита С. Можно предположить, что однонаправленное воздействие комбинаций этих аллелей и генотипов друг с другом и с известными клинико-демографическими факторами позволит строже выделить группы больных ХГС с высоким риском неблагоприятных исходов. Многофакторный анализ проводился в два этапа. На первом этапе в модель логистической регрессии включались только генетические комбинации, и по его результатам выявлялись те из них, которые вносят наиболее весомый вклад, на втором этапе в рассматриваемую модель вводились и клинико-демографические факторы, чтобы оценить клиническую и прогностическую значимость выявленных корреляций и попытаться построить прогностическую шкалу оценки риска агрессивного течения заболевания.
Хотя однофакторный анализ выявил ассоциацию формирования цирроза печени у больных с хронической HCV-инфекцией как с полиморфизмом C242Т гена CYBA, так и с полиморфизмом G-6A гена AGT, при многофакторном анализе на фоне эффекта носительства гомозиготного мутантного генотипа 242ТT вклад наследования АА-генотипа гена AGT не был статистически значимым. При включении в логистическую модель клинико-демографических параметров выявилась статистически значимая прямая и сильная корреляция возраста больного с формированием у него ЦП. Другие клинические факторы при комплексной оценке не имели статистически значимых ассоциаций с риском развития цирроза и имели меньшую прогностическую значимость, чем носительство генотипа 242ТT гена CYBA. Эти результаты согласуются с данными H. Huang et al. [144], согласно которым из всех клинических параметров только возраст больных и их пол имели значимую ассоциацию с риском развития цирроза. Согласно T. Poynard et al. [219] фибротические изменения в печени при ХГС нарастают нелинейно, скорость этих изменений тем выше, чем старше пациент на момент инфицирования и чем дольше протекает заболевание. Соответственно, возраст больного на момент исследования может интегрировать оба этих параметра (чем пациент старше, тем, как правило, дольше анамнез заболевания, но и возможно, тем в более позднем возрасте произошло инфицирование), поэтому фактор возраста необходимо учитывать при оценке риска трансформации ХГС в цирроз печени.
Когда в исследованиях влияния полиморфных генетических маркеров на течение ХГС проводится сравнение между собой групп больных с ХГС и ЦПС, либо с «мягкими» и «тяжёлыми» стадиями фиброза, то не учитывается длительность заболевания. И часть обследуемых с F0—F2 стадиями фиброза печени и кратким анамнезом заболевания, у которых впоследствии без лечения ЦП сформируется сравнительно быстро (менее, чем за 20 лет), может быть ошибочно распределена в группу «лёгкого» течения. Косвенно об этом свидетельствуют и наши данные о высокой статистической значимости возраста пациента для оценки риска формирования ЦП. Более строгой представляется оценка влияния наследственных факторов на скорость прогрессирования заболевания. Поэтому мы проанализировали наличие связи полиморфизма исследованных генов с темпом нарастания фибротических изменений в печени.
