Введение к работе
Вирусы Калифорнийской серогруппы (КСГ) относятся к роду Orthobunyavirus, семейству Bunyaviridae. К настоящему времени известно не менее 14 вирусов КСГ. Одиннадцать из них широко распространены в Северной и Южной Америке (вирусы Ла-Кросс, зайца-беляка, Калифорнийского энцефалита, Сан-Анжело, Кейстон, Сьерра-до-Навио, Джеймстаун-Каньон, Саус-Ривер, Мелао, Тривиттатус, Гуароа), три в Евразии (вирусы Инко, Тягиня и зайца-беляка) и один в Африке (вирус Лумбо). Передача вирусов восприимчивым позвоночным осуществляется путем биологической трансмиссии кровососущими комарами. Основные переносчики - комары рода Aedes, реже Anopheles, Culiseta, Culex и Mansonia. Резервуаром для вирусов в природных очагах являются мелкие позвоночные: кролики, зайцы-беляки, бурундуки, хомяки, мыши. Восемь представителей КСГ вызывают заболевание у человека, которое может протекать в 3-х основных формах: 1) гриппоподобной; 2) с поражением бронхолегочной системы и 3) нейроинфекционной - с синдромом серозного менингита и менингоэнцефалита.
Свидетельством широкой циркуляции вирусов КСГ в России являются многолетние данные, полученные в процессе эколого-эпидемиологического, вирусологического и серологического мониторинга Центром экологии и индикации инфекционных заболеваний при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. По результатам этих исследований, проведенных с 1982 по 1990 годы на территории нашей страны, был выделен 251 штамм, отнесенный к КСГ. Идентификация выявленных штаммов серологическими методами показала, что на территории России циркулирует, по крайней мере, 3 вируса серокомплекса: Инко, Тягиня и ВЗБ. Причем большая часть этих штаммов была идентифицирована как вирусы зайца-беляка (ВЗБ). Все 3 вируса серокомплекса (Инко, Тягиня и ВЗБ) имеют значение в патологии человека.
Согласно данным мониторинга на территории России штаммы ВЗБ доминируют во всех ландшафтных поясах на территориях к востоку от реки Енисей (Средняя, Северо-Восточная Сибирь, Северо-Притихоокеанская физико-географическая страна). Штаммы вируса Инко преобладают в тундре и лесотундре Западной Сибири, а ВЗБ - в остальных ландшафтах, расположенных южнее. В восточной части Фенноскандии и на севере Русской равнины штаммы ВЗБ и Инко выделяются одинаково часто. Штаммы вируса Тягиня изолированы в южных и центральных областях Европейской части России.
Заболевания, связанные с вирусами КСГ, имеют сезонный характер и чаще всего регистрируются в ландшафтно-географических зонах тайги и смешанных лесов Европейской части России и Западной Сибири. Переносчиками вирусов КСГ служат кровососущие комары преимущественно рода Aedes. Первые случаи заболеваний появляются в мае, основной пик приходится на июль-август, а единичные случаи
регастрируются в сентябре и начале октября. Большинство больных были в возрасте от 15 до 40 лет, причем лица до 30 лет составили 52,5% от всех заболевших. Клинические симптомы инфекций, вызываемых вирусами КСГ, в большинстве случаев похожи. Вирусы Инко и Тягиня вызывают заболевания у людей, протекающие как без поражения ЦНС, так и с синдромом острой нейроинфекции, при которой ведущая роль принадлежит вирусу Инко. ВЗБ вызывает заболевание без симптомов поражения ЦНС.
Интерес к исследованию вирусов КСГ на территории России связан с тем, что эти вирусы обладают возможностью реассортации (то есть обмена сегментами генома между близкородственными вирусами, входящими в одну серогруппу). В результате реассортации могут появляться вирусы с различным генетическим материалом и новыми инфекционными свойствами за короткий промежуток времени. Это, в свою очередь, может способствовать возникновению эпидемических вспышек в очагах и нести потенциальную угрозу для здоровья людей.
На сегодняшний день имеется очень мало работ, посвященных генетическому разнообразию вирусов КСГ, циркулирующих в различных регионах России. Ранее изучение генома вирусов КСГ проводилось зарубежными исследователями на штаммах (изолированных в США и Европе) в основном по последовательностям S и М сегментов. Полные нуклеотидные последовательности по всем трем сегментам генома (S, М и L) у вирусов КСГ известны только у вируса Ла Кросс, циркулирующего на территории США. Частичные последовательности L сегмента данной группы вирусов опубликованы в базе данных GenBank только у вирусов: Тягиня, зайца-беляка, Мелао, Джемстаун-Каньон, Инкоо и Саус-Ривер. У остальных представителей КСГ последовательности L сегмента не определены. Генетическое исследование ВЗБ, как наиболее распространенного вируса КСГ, циркулирующего на территории нашей страны, позволило бы получить достоверную информацию о систематическом положении этого вируса, определить степень гомологии и дивергенции среди других представителей серогруппы, выяснить какова гетерогенность ВЗБ в пределах вида. К тому же, все созданные ОТ-ПЦР системы, позволяющие детектировать вирусы КСГ адаптированы к штаммам, выделенным в США и Европе. Проведение молекулярно-генетического анализа штаммов ВЗБ, изолированных на территории России позволило бы разработать отечественный вариант ОТ-ПЦР системы, который был бы ориентирован на варианты вируса, циркулирующего на территории нашей страны.
Цель и задачи исследования.
,„тя,ЦЄЛЬ^гг70ЯЩЄГСіИССЛЄД0ВаНШІ ЯВИЛась ген«ическая характеристика
штаммов КСГ (идентифицированных серологическими методами как ВЗБЇ
циркулирующих на территории РФ, и определение их сигматического
положения в существующей системе классификации вирусов КСГ Лля
реализации этого были поставлены следующие задачи- '
1 Провести определение первичной структуры полной нуклеотидной последовательности S сегмента, а также участков последовательностей Ми L сегментов (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно) у 15-ти "культураль-ных штаммов, выделенных на территории России и одного штамма изолированного на территории США.
2. Провести филогенетический анализ исследуемых штаммов вируса по полной нуклеотидной последовательности S сегмента и участкам последовательностей М и L сегментов (по 980 и 410 нуклеотидов соответственно) и сравнить их с ранее охарактеризованными штаммами AL1, представленными в базе данных GenBank.
те3' итоСТииСШАПеРВИЧНУГО С1РУКТУРУ ПОЛН0Г0генома ВЗБ' выделенного на
4. Установить первичную структуру полного генома у 1-го штамма вируса -K.U, изолированного на территории России.
5. Разработать на основе анализа нуклеотвдных последовательностей исследуемых штаммов КСГ детекционный вариант ОТ-ПЦР системы.
Научная новизна и практическая значимость.
1. Впервые установлено, на основании филогенетического анализа полной нуклеотидной последовательности S сегмента, а также по последовательностям участков М и L сегментов генома (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно), что все исследуемые российские штаммы (ранее серологически идентифицированные как ВЗБ) являются самостоятельным вирусом КСГ и генетически близки к ВЗБ и вирусу Ла-11552" Н0ВЫЙ №РУС НаЗВаН ХатаНга' по местУ выДеления штамма LEIV-2. Впервые показано, что на территории РФ в Европейской части, а также в Западной, Средней и Северо-Восточной Сибири циркулирует, по меньшей мере, 2 генетические линии вируса Хатанга.
т ЛПІ?ВЬІЄ 0ПРеделена первичная структура генома, российского штамма LblV-17756 вируса Хатанга.
4. Впервые определена первичная структура L сегмента ВЗБ
изолированного в США.
5. Создан вариант ОТ-ПЦР системы, позволяющий детектировать
геномную РНК вирусов ВЗБ и Хатанга.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
На основе сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей S сегмента, а также участков М и L сегментов генома (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно) установлено, что все штаммы, выделенные на территории России к исследуемые в данной работе, представляют собой отдельный, самостоятельный вирус КСГ. Новый вирус КСГ назван Хатанга, по месту выделения одного из штаммов.
-
Результаты филогенетического анализа по полной нуклеотидной последовательности S сегмента, а также участков М и L сегментов генома позволяют утверждать, что вирус Хатанга, изолированный на территории России, относится к субтипу вируса Ла-Кросс, входящего в серотип Калифорнийского энцефалита. В генетическом отношении вирус Хатанга наиболее близок к ВЗБ и вирусу Ла-Кросс.
3. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последователь
ностей всех сегментов генома установлено, что вирус Хатанга, как
генетическая линия гетерогенен и имеет, как минимум, 2 генетические
группы, которые хорошо делятся по территориальному признаку.
4. Впервые определены полные нуклеотидные последовательности
генома российского штамма LEIV-17756 вируса Хатанга, а также полная
нуклеотидная последовательность L сегмента штамма ВЗБ, выделенного на
территории США.
5. Создан вариант ОТ-ПЦР системы, позволяющий детектировать
геномную РНК вирусов ВЗБ и Хатанга.
Публикации и апробация работы.
По материалам диссертации в журналах, рекомендованных ВАК, опубликовано 2 научных статьи. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании совета по предварительной экспертизе диссертационных работ по проблеме «молекулярная биология» ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (16.12.2010).
Объем и структура диссертации.
![Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс]](/i/i/4440/193595.png "Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс] Кондратьева Ярослава Юрьевна")