Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы, пожалуй, ни один белок не изучался так интенсивно, как опухолевый супрессор р53. За треть века с момента его открытия р53 было посвящено более 50 тысяч научных работ, и их число неуклонно продолжает расти. Повышенное внимание к р53 определяется, прежде всего, тем, что он является ключевым регуляторным белком клетки, транскрипционным фактором, который активируется в ответ на различные клеточные стрессы, включая генотоксический стресс, и играет важную роль в защите от рака. Будучи «стражем целостности генома», р53 определяет дальнейшую судьбу клетки - произойдет ли остановка клеточного цикла для преодоления последствий стрессового воздействия или включится механизм программируемой клеточной смерти.
Объектом наших исследований также является жизненно важный белок позвоночных протимозин альфа (ПроТа). ПроТа - это мультикопийный ядерный белок, относящийся к интереснейшему классу природных неструктурированных белков. Оказалось, что даже такой относительно простой белок является многофункциональным, способным участвовать в самых разнообразных процессах жизни и смерти клеток. Традиционно ПроТа считается онкобелком, он ускоряет клеточную пролиферацию и защищает клетки от апоптоза. Однако, неожиданно было обнаружено, что ПроТа стимулирует транскрипционную активность опухолевого супрессора р53, и таким образом, потенциально способен к проявлению анти-онкогенной активности.
Онкобелки и онкосупрессоры иногда обладают дуалистическими функциями, в разных системах проявляя либо онкогенную, либо анти-онкогенную активность. Настоящая работа посвящена выяснению молекулярного механизма, с помощью которого онкобелок протимозин альфа стимулирует р53-зависимую транскрипцию. Понимание механизмов функционирования таких белков необходимо как для выяснения всех путей регуляции активности опухолевого супрессора р53, так и для создания рациональных способов диагностики онкологических заболеваний и антираковой терапии. Цели исследования:
Целью настоящей работы было изучение механизмов стимуляции активности протимозином альфа опухолевого супрессора р53.
Научная новизна и практическая значимость.
В ходе данной работы обнаружено, что в клетках человека линий HeLa, НЕК293, но не в НСТ116 эктопическая экспрессия ПроТа стимулирует транскрипцию, регулируемую опухолевым супрессором р53. Когда мы получили эти данные, это был
совершенно новый, неописанный в литературе результат. Однако, вскоре была опубликована статья Кобаяши с соавт., в которой представлены аналогичные данные о стимуляции протимозином а активности опухолевого супрессора р53 в ряде клеточных линий, включая Н1299, Saos-2, HepG2, А549, НЕК293 и U20S. При этом стимуляция р53-регулируемой транскрипции отсутствовала в клетках НСТ116, что совпадает с полученными нами результатами. В клетках HeLa исследования в работе Кобаяши с соавт. не проводились; механизм стимуляции активности р53 при повышении уровня ПроТа остался невыявленным. В работе Кобаяши с соавт. было показано, что этот механизм связан с рекрутированием гистоновых ацетилтрансфераз к р53-зависимым промоторам с последующим ацетилированием р53. Однако, ПроТа активирует транскрипцию не на всех, а на избранных промоторах. В частности, ПроТа стимулирует р53-зависимую транскрипцию, но не влияет на E2F- и Мус-зависимую транскрипцию. Механизм избирательного действия ПроТа на транскрипцию с разных промоторов оставался неясным и требовал дальнейшего изучения. Поэтому мы исследовали этот механизм, используя в качестве клеточной модели линию HeLa, в которой эффект ПроТа был наиболее выраженным.
В настоящей работе впервые картирован участок ПроТа, ответственный за усиление р53-зависимой транскрипции. Им оказался центральный «кислый» район ПроТа наряду с NLS, расположенным в С-концевой области.
Центральный район протимозина альфа ответственен за его взаимодействие с гистоном HI. В 2008 году появились интересные данные о том, что гистон HI является специфическим ингибитором р53-зависимой транскрипции за счет прямого взаимодействия с р53 на промоторах его генов-мишеней. На основании этого мы предложили гипотезу, в соответствии с которой ПроТа может стимулировать р53-регулируемую транскрипцию путем вытеснения гистона HI из репрессорного комплекса с р53. В рамках тестирования этой гипотезы в диссертации впервые показано, что: (1) рекомбинантный ПроТа вытесняет р53 из его комплекса с гистоном HI in vitro] (2) эндогенный ПроТа интерферирует с взаимодействием гистона HI с р53 в лизатах клеток HeLa; (3) стимуляция р53-зависимой транскрипции протимозином альфа в клетках HeLa коррелирует со способностью этого белка взаимодействовать с гистоном HI; (4) эктопическая экспрессия гистона HI специфически подавляет стимулирующий эффект ПроТа на р53-зависимую транскрипцию; (5) увеличение уровня ПроТа в клетке приводит к уменьшению количества гистона HI, связанного с р53-зависимым промотором. Перечисленные результаты подтвердили предложенный нами новый механизм
стимуляции транскрипционной активности р53 путем вытеснения протимозином альфа гистона HI из репрессорного комплекса с р53.
В данной работе также впервые показано, что при снижении уровня ПроТа происходит заметное снижение экспрессии тирозиновой протеинкиназы JAK1. Активация JAK1 протимозином альфа представляет большой интерес для выявления механизма иммуностимулирующего действия ПроТа, а также для теоретического обоснования его противоопухолевой активности при использовании в генной терапии.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы работы были представлены на международных конференциях «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), «Геномика и биология клетки» (Москва, Звенигород, 2010).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 57 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 175 цитированных работы.
