Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные представления о патогенезе полиомиелита . 11
Глава II. Основные закономерности развития противовирусного иммунного ответа и роль реакций клеточного иммунитета в патогенезе экспериментальных вирусных инфекций. Собственные исследования . 38
Глава III. Материалы и методы. 55
Глава IV. Изучение течения экспериментальной полиовирусной инфекции и иммунологического статуса у иммунокомпетентных и обработанных ЦФН мышей . 52
Глава V. Роль специфически сенсибилизированных Т- и В- лимфоцитов, макрофагов и ПВА в обеспечении резистентностимышей к вирусу полиомиелита (типа 2) 73
Глава VI. Повреждающее действие противовирусных антител и предотвращение его развития макрофагами при эксперименталь ной полиовирусной инфекции у мышей . 92
Глава VII. Зависимое от комплемента или макрофагов цитотокси ческое действие специфических ПВА при полиовирусной инфекции in vitro . 105
Глава VIII Обсуждение полученных результатов . 117
Выводы. 135
Список литературы. 137
Благодарности 159
- Основные закономерности развития противовирусного иммунного ответа и роль реакций клеточного иммунитета в патогенезе экспериментальных вирусных инфекций. Собственные исследования
- Изучение течения экспериментальной полиовирусной инфекции и иммунологического статуса у иммунокомпетентных и обработанных ЦФН мышей
- Повреждающее действие противовирусных антител и предотвращение его развития макрофагами при эксперименталь ной полиовирусной инфекции у мышей
- Обсуждение полученных результатов
Введение к работе
Полиомиелит — острое инфекционное заболевание, проявляющееся в разнообразных клинических формах, начиная от абортивных до паралитических, с фекально-оральным механизмом передачи. Многолетние исследования полио-вирусной инфекции в эксперименте и клинических условиях, создание эффективных противополиомиелитных вакцин, позволили в 1988 г. Всемирной Организации Здравоохранения принять Программу глобальной ликвидации полиомиелита. За время прошедшее с момента принятия этой инициативы, достигнут существенный прогресс, позволивший рассматривать решение проблемы полиомиелита, как один из примеров успешной вакцинопрофилактики вирусной инфекции. С 1988 по 2000 г. число эндемичных по полиомиелиту стран сократилось со 125 до 20, число регистрируемых случаев острого полиомиелита с 350000 до 2000. Циркуляция дикого полиовируса в настоящее время ограничена несколькими очагами, оставшимися в Южной Азии и Африке (ВОЗ, 2004).
Однако, проблема полиомиелита продолжает быть актуальной в связи с сохраняющейся циркуляцией дикого полиовируса в экономически неблагополучных регионах и в так называемых горячих точках планеты в связи с нарушением программ вакцинации. В различных регионах регистрируются вакци-но-ассоциированные случаи полиомиелита. Наблюдается циркуляция полиови-русных штаммов, имеющих вакцинное происхождение и дериватов, выделяемых из организма привитых против полиомиелита с различными нарушениями иммунного ответа (Cherkasova Е.А., Korotkova Е.А. et al. 2002; Georgopoulou A. Markoulatos P. 2001; Caceres V.H., Sutter R.W. 2001). В последнее время значительно увеличилась частота выявления такой нозологической формы заболевания человека, как постполиомиелитный синдром (ППС) (Rasch G., Schreier Е, 2001).
Согласно сложившимся представлениям, патогенез вирусных инфекций рассматривается как процесс, в котором иммунные реакции играют зачастую ведущую роль. Причем при различных вирусных заболеваниях роль от дельных компонентов иммунного ответа может быть весьма неоднозначной. Как показано на примере ряда инфекций (ЛХМ, клещевой энцефалит, грипп), различные субпопуляции иммунокомпетентных клеток и противовирусные антитела, в результате различных кооперативных взаимодействий, могут оказывать не только защитный эффект, но и вызывать отягощение течения инфекции и приводить к гибели организма. Реализация защитного или повреждающего действия иммунного ответа, определяющая исход инфекции, зависит от многих факторов, среди которых одно из ведущих мест занимает характер взаимодействия макро и микро организма (Хозинский В.В. 1986; Rott R., Herzoog S., Richt J 1988; Turner S.J, Cross R., Xie W., Doherty P.C. 2001; Belz G.T., Doherty P.C, 2001). Полиомиелит, впрочем как и другие энтеровирусы, с этой точки зрения остается малоизученным.
В настоящее время, в качестве основного механизма элиминации полио-вируса из организма рассматривается взаимодействие возбудителя инфекции с нейтрализующими антителами. Существенным шагом в изучении патогенеза полиовируса в экспериментальных условиях, явились проведенные в последние годы исследования с использованием трансгенных мышей, несущих человеческий PVR ген и описание интимных механизмов взаимодействия полиовируса с клеткой в контексте процессов, связанных с апоптозом (Ida-Hosonuma М., Iwasaki Т. et al. 2002; Iwasaki A., Welker R. et al. 2002; Tolskaya E.A, Romanova L.I, Kolesnikova M.S. et. al., 1995). Однако, остающиеся неизученными иммунологические аспекты патогенеза полиомиелита, диктуют необходимость детального исследования механизмов клеточного иммунитета в целом и определения роли его отдельных компонентов в защите организма против полиовируса или развитии иммунопатологических реакций при этой инфекции.
Актуальность
В результате длительных исследований полиовирусной инфекции достаточно подробно изучена роль и показано большое значение гуморального иммунитета в обеспечении резистентности организма к вирусу полиомиелита.
Однако, многие вопросы связанные с ролью клеточного иммунного ответа в патогенезе этой инфекции остаются малоизученными.
К моменту начала настоящей работы, имелось весьма ограниченное количество работ, где изучалось состояние Т-системы иммунитета при острой и бессимптомной экспериментальной полиовирусной инфекции (Jubelt В., et al., 1984). Описаны различия в динамике нарастания количества Т-лимфоцитов, а также сенсибилизации Т-клеток в зависимости от формы инфекции (Katrak К., Mahon В.Р., et. al., 1992). Показана активация цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) (Kutubuddin М., Simons J., et. al., 1992). Изучение реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при экспериментальной полиовирусной инфекции позволило выявить межтиповые антигены трех типов вируса полиомиелита (Wang К., Sun L., et. al, 1989). Исследовалось иммунодепрессивное действие полиовируса (Васильева И.Г. и др. 1978). Тем не менее, многие основные вопросы состояния клеточного иммунитета в целом и роли отдельных компонентов иммунного ответа в защите организма против вируса полиомиелита остаются неизученными. Более полное исследование патогенетических процессов и роли иммунных реакций, обеспечивающих защиту зараженного организма, необходимо для создания наиболее эффективных путей терапии и профилактики полиовирусной инфекции, а также предотвращения развития поздних осложнений полиомиелита, связываемых с иммунопатологическими процессами в организме людей, перенесших острый полиомиелит.
Исходя из вышеизложенного, сформулированы представленные ниже цель и задачи настоящего исследования.
Цель и задачи исследования
Основной целью исследований было изучение некоторых, неизвестных ранее, механизмов иммунного ответа при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом полиомиелита (типа 2), у мышей, определить наиболее эффективные механизмы, обеспечивающие резистенстность организма к вирусу и развитие иммунопатологических реакций. При этом были поставлены следующие задачи: 1. Разработать экспериментальную модель для изучения защитного и повреждающего действия клеточного и гуморального иммунитета.
2. Определить соотносительную роль отдельных эффекторов иммунного ответа и противовирусных антител в становлении резистентности мышей к по-лиовирусу (типа 2).
3. Экспериментально проверить гипотезу о возможной роли иммунопатологических реакций в патогенезе полиомиелита. Определить конкретные иммунологические механизмы, лежащие в основе развития этих реакций.
4. Определить роль иммунопатологических механизмов в развитии пато-морфологических изменений центральной нервной системы при экспериментальной полиовирусной инфекции.
5. Отработать условия определения зависимого от комплемента и имму-нокомпетентных клеток цитотоксического действия специфических противовирусных антител на зараженную полиовирусом культуру клеток. Изучить некоторые механизмы реализации иммунного цитолиза с участием противовирусных антител, в инфицированных полиовирусом культурах клеток
Научная новизна работы и положения, которые выносятся на защиту
Впервые продемонстрировано, что иммунокомпетентные клетки (ИК) при их совместном введении со специфическими противовирусными антителами на ранних этапах инфекции, вызванной полиовирусом (типа 2) у мышей, значительно усиливают протективный эффект антител. Это явление реализуется за счет взаимодействия противовирусных антител с макрофагами. Специфичность зависимого от антител защитного действия макрофагов (ЗАЗДМ) определяется противовирусными антителами. По сравнению с ЗАЗДМ, противовирусные антитела, специфически сенсибилизированные к вирусу спленоциты или макрофаги были существенно менее эффективны в защите зараженных животных.
Впервые показано, что введение специфических противовирусных антител зараженным, на фоне подавленного иммунитета, мышам в конце инкубационного периода заболевания, сопровождается более ранним проявлением у них симптомов заболевания (парезов, параличей) и сокращением средней продолжительности жизни (СПЖ). Введение зараженным реципиентам в аналогичных условиях макрофагов и специфически сенсибилизированных к вирусу Т- и В-лимфоцитов не сопровождалось усилением патологических симптомов.
Впервые установлено, что вызываемое введением противовирусных антител сокращение СПЖ инфицированных реципиентов связано с развитием у них тяжелых патоморфологических изменений в центральной нервной системе (ЦНС). Введение противовирусных антител индуцировало развитие выраженной воспалительной реакции в головном мозге и массированную гибель нейронов во всех исследованных отделах ЦНС (головной и спинной мозг). Введение контрольных сывороток, макрофагов или специфически сенсибилизированных Т- и В-лимфоцитов развитием иммунопатологической реакции не сопровождалось.
Впервые показано, что макрофаги предотвращают развитие иммунопатологической реакции, индуцируемой противовирусными антителами в конце инкубационного периода экспериментальной полиовирусной инфекции у мышей. Совместное введение специфических противовирусных антител и макрофагов зараженным, на фоне подавленного иммунного ответа, реципиентам, не сопровождалось сокращением их СПЖ, а инициировало выраженный защитный эффект. Патоморфологические исследования тканей таких животных показали, что взаимодействие иммунокомпетентных клеток с ПВА предотвращает гибель нейронов во всех отделах ЦНС.
Впервые описаны вирусиндуцированные антигенспецифические Т-супрессоры, угнетающие активность специфических Т-лимфоцитов, опосредующих развитие реакции ГЗТ при экспериментальной полиовирусной инфек ции у мышей. Установлено, что Т-лимфоциты, участвующие в реализации реакции ГЗТ, не играют определяющей роли в обеспечении резистентности организма к полиовирусу и развитии иммунопатологической реакции.
Впервые отработаны условия определения зависимого от комплемента и РІК цитотоксического действия специфических ПВА на зараженную полиови-русом культуру клеток in vitro. Установлено, что основной популяцией ПК, осуществляющей цитолиз инфицированных клеток при взаимодействии с ПВА in vitro, являются макрофаги. По сравнению с комплемент-зависимым цитоток-сическим действием ПВА и стандартным тестом определения вируснейтрали-зующих антител по подавлению цитопатического действия полиовируса в культуре клеток, для реализации иммунного цитолиза инфицированных клеток противовирусными антителами и макрофагами требовалось в 150 и в 8 раз меньшая концентрация ПВА соответственно.
Предложена гипотеза, согласно которой в патогенезе полиомиелита существуют два иммунологических механизма. Один из них - комплемент-зависимое цитотоксическое действие специфических ПВА, определяющий развитие иммунопатологической реакции и гибель организма. Другой, зависимое от антител цитотоксическое действие макрофагов, обеспечивающий выздоровление. Превалирование, по тем или иным причинам, действия одного из этих механизмов является решающим фактором, определяющим исход инфекции.
Теоретическая и практическая значимость работы
Получены новые факты, расшифровывающие неизвестные ранее механизмы защитного и повреждающего действия иммунного ответа при экспериментальном полиомиелите. Показано, что противовирусные антитела при адоптивном переносе зараженным полиовирусом иммуносупрессированным животным в конце инкубационного периода заболевания оказывают повреждающее действие. Разработанная экспериментальная модель может быть использована как при изучении вакциноассоциированных случаев полиомиелита, возникающих
при введении аттенуированных штаммов вируса полиомиелита (типа 2), так и для изучения иммунопатологических реакций в экспериментах с различными представителями рода Enterovirus.
Выявленное защитное действие макрофагов при адоптивном переносе совместно с противовирусными антителами, выражающееся в предотвращении иммунопатологического ПВА на поздних стадиях инфекции, может быть свидетельством взаимодействия двух звеньев иммунной системы - врожденного иммунитета (макрофаги незараженных доноров) и эффекторов приобретенного иммунитета (специфические антитела). Прямых доказательств такого взаимодействия ранее получено не было.
Исследования, в экспериментах in vitro, комплемент зависимого цитотоксического действия ПВА на зараженную полиовирусом культуру клеток и реакции зависимого от антител цитотоксического действия макрофагов (ЗАЦДМ), показавшие существенно более высокую чувствительность реакции ЗАЦДМ, по сравнению с комплемент зависимым цитолизом (в 150 раз), позволяют использовать ЗАЦДМ для серологической диагностики проб крови от здоровых лиц и в случаях острого полиомиелита, а также при изучении поствакцинального иммунитета.
Полученные данные о ведущей роли ПВА и макрофагов в патогенезе полиомиелита, способствуют не только углубленному пониманию течение инфекционного процесса, но и разработке научно-обоснованных методов имму-нокоррекции и терапии этого заболевания.
Основные закономерности развития противовирусного иммунного ответа и роль реакций клеточного иммунитета в патогенезе экспериментальных вирусных инфекций. Собственные исследования
Необходимый для обеспечения выздоровления при вирусных инфекциях процесс элиминации зараженных клеток, обусловленный совокупностью си-нергических и антагонистических взаимодействий клеточного и гуморального ответа во многом зависит от условий воспроизведения инфекции, особенностей данного патогена и макроорганизма-хозяина (Langman R.E., 2000; Janeway С.А, 2001).
Как облигатные внутриклеточные паразиты, вирусы, обладающие тропизмом к различным типам клеток, в том числе и иммунной системы, могут оказывать существенное влияние на функции этих клеток, изменять их антигенный профиль, трансформировать их в клетки мишени для эффекторов специфического противовирусного иммунитета или их продуктов (Beagleyk К., et al., 1989; Beagleyk A., et al., 1992; Bradley L.M., et al, 1991; Swain S.L., et al, 1988; Doherty P.C., 2002; Unanue E.R., 2002).
Согласно двухсигнальной теории иммуногенеза информация между разными взаимодействующими клетками передается двумя сигналами-специфическим и неспецифическим. Специфический сигнал обеспечивается комплексом антиген-рецептор, а неспецифический, необходимый для дифференциации и пролиферации иммунных клеток, оформляется продуктами макрофагов и лимфоцитов цитокинами (ЦТ). ЦТ-низкомолекулярные белковые ре-гуляторные вещества, продуцируемые клетками и способные модулировать их функциональную активность. В ходе иммунной реакции ЦТ регулируют все звенья иммунной системы, сопровождающие иммунный ответ: размножение и дифференцировку предшественников и самих иммунокомпетентных клеток, представление антигена, пролиферацию антигенсенсибилизированных лимфоцитов, дифференцировку В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки, Т-лимфоцитов (Т-ЛФ) в функционально различные Т-ЛФ. ЦТ регулируют функ ции: макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов, тучных клеток и базофилов (Грачева Л.А, 1996). В настоящее время известно около 50 цитокинов. К ЦТ относятся более 15 интерлейкинов (ИЛ), фактор некроза опухолей (ФНО), лейкоз ингибирующий фактор, интерферон (ИФН), гемопоэтические ростовые факторы и ряд других. ЦТ сильно варьируют по своим биохимическим свойствам и функциям, однако имеют ряд общих черт: все они являются гликозилироанны-ми белками, действуют только на клетки, имеющие соответствующие рецепторы, не являются антигенспецифичными (Грачева Л.А., 1996; Носик Н.Н, 2000).
Первым этапом развития специфического иммунного ответа является поглощение макрофагами антигена и предъявление его клеткам помощникам в контексте 1а антигена МНС. Неспецифический сигнал передается ИЛ (Hsia J., et al, 1990; Mosman T.R. and Coffman R.L., 1989; Swain S.L., et al, 1989). Активированные Т-хелперы передают специфическую информацию предшественникам эффекторных клеток и синтезируют ИЛ-2 (второй сигнал), вызывая диффе-ренцировку предшественников в цитотоксические лимфоциты (CD8 Т-клетки) или CD4 Т-клетки воспаления (прежнее название эффекторы гиперчувствительности замедленного типа Трзт)- В случае взаимодействия с В-лимфоцитами, Т-хелперы продуцируют не ИЛ, а фактор созревания и репликации В-клеток (Hudson A.W., Ploegh H.L., 2002; Cohn М., 2002).
Продукция ИЛ —1 макрофагами стимулируется продуктом Т-клеток индукторов ИЛ-3. Активность Т-хелперов ограничивается клетками супрессора-ми, секретирующих ингибитор ИЛ-2. Действие Т-супрессоров направлено преимущественно на Т-хелперы, но их эффект может реализовываться и на уровне макрофагов, В-лимфоцитов и других популяций Т-клеток, а взаимодействие осуществляется главным образом при помощи ряда атигенспецифических и ан-тигеннеспецифических факторов, подавляющих или усиливающих действие иммунного ответа, продуцируемых этими клетками (Coffman R.L., et al, 1989; Ehlers S., Smith K.A., 1991; K.E. Pollok, E.C. Snow, 1991; Le Gros G., et al, 1990; Mackay C.R., et al, 1990).
Таким образом, интенсивность иммунных реакций регулируется по принципу обратной связи - активность Т-клеток помощников определяет уровень активности Т-супрессоров, а в свою очередь они посредством супрессорного фактора ингибируют как активность Т-хелперов, так и клеток индукторов Т-супрессоров (Кауе J., et al, 1989; Lee W.T., et al, 1990; Swain S.L., et al., 1991; Хаитов P.M., 2002; Ярилин A.A., 1999).
В экспериментах выполненных на модели вируса гриппа и герпеса у мышей in vitro показана роль Т-хэлперов (Тп2) в индукции вирусспецифических цитотоксических лимфоцитов. Нефагоцитирующие, чувствительные к антимо-цитарный сыворотке клетки при добавлении в комплексе инфицированные-отвечающие клетки, усиливали продукцию цитотоксических лимфоцитов (Rouse В.Т., et al, 1981).
Принято считать, что разные инфекционные агенты или антигены при разных условиях индуцируют качественно разные типы иммунного ответа. Например, гельминты вызывают выраженный гуморальный ответ с продуцированием IgE, в то время как внутриклеточные паразиты индуцируют сильную реакцию ГЗТ. Одними из наиболее существенных элементов иммунного ответа на белковые антигены являются Т-клетки с фенотипом CD4+. Цитокины медии-рующие действие CD4+ Т-клеток действуют избирательно на разные клеточные популяции и таким образом определяют эффекторную систему. Например, ИЛ-4 индуцирует включение В-клеток в производство IgE, ИЛ-5 является главнымфактором эозинофильной дифференциации, а интерферон (INF-y) - главным фактором макрофагальной активности.
Профиль цитокинов определяется двумя функциональными типами Т лимфоцитов помощников (Th 1 и Th2). Th-1 клетки производят ИЛ-2, INF-y и фактор некроза опухолей (TNF) усиливающие клеточный иммунитет, при котором клетки с фенотипом CD8+ играют важную роль в борьбе с инфекцией: ингибируют гуморальный иммунитет и обеспечивают защиту от инфекционных агентов, которые эффективно элиминируются благодаря реакциям клеточного иммунитета (Turner S.J. et. al., 2001; Belz G.T., et. al., 2001; Flynn К J., et. al,1998; Christensen J.P., et at., 2000; Marshall D.R. et al., 2001; tevenis6riiRCJ., et al., 1999). В то время как Th-2 клетки секретируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, усиливающие гуморальный иммунитет и ингибирующие клеточные иммунные реакции, в результате чего реализуется защита от патогенов, подавляемых с помощью реакций гуморального иммунитета (Грачева Л.А., 1996; Носик И.Н., 2000; Kopf М., Bachmann M.F., 1999).Th-1 и Th-2 акцептируют ИЛ-2 и ИЛ-4 как аутокринные факторы роста. Установлено, что только Th-І вызывают ГЗТ в следствии адоптивного переноса и последующей антигенной стимуляции (Cher D.J. and Mosmann T.R., 1987).
Антигенпредставляющие клетки (В-лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки) представляют антиген хелперным CD4+ клеткам. В дополнение к презентации антигена, антигенпредставляющие клетки продуцируют ко-стимуляторы, необходимые для осуществления полной сети функциональных и пролиферативных клеточных ответов. В-лимфоциты развиваются из стволовых клеток. Зрелые В-лимфоциты отличаются от пре-В-клеток мембранными рецепторами, при связывании которых с антигеном клетка активируется. Для такой активации, кроме связывания с антигеном необходимо осуществить контакт с Т-клеткой помощником, или с определенными факторами роста и диф-ференцировки. Пролиферативная фаза активаций ведет к абсолютному увеличению числа клеток, способных к дифференцировке, способных реагировать с чужеродным антигеном, т.е. к обеспечению иммунологической памяти. Рецептор для антигена представляет собой иммуноглобулин и в процессе развития В-клеток экспрессируются вначале IgM, а затем различные классы тяжелых цепей IgG, IgA, IgE (Хаитов P.M., 2002).
Изучение течения экспериментальной полиовирусной инфекции и иммунологического статуса у иммунокомпетентных и обработанных ЦФН мышей
Необходимый для обеспечения выздоровления при вирусных инфекциях процесс элиминации зараженных клеток, обусловленный взаимодействием клеточного и гуморального иммунного ответа, во многом зависит от условий воспроизведения инфекции, особенностей патогена и макроорганизма хозяина. Согласно двухсигнальной теории иммуногенеза при распознавании антигена на поверхности антигенпрезентирующих клеток (макрофагов, дендритных клеток) формируются два сигнала. Специфический сигнал обеспечивается взаимодействием Т-клеточного рецептора с антигеном, а неспецифический, необходимый для дифферециации и пролиферации иммунных клеток, оформляется продуктами макрофагов и лимфоцитов-цитокинами. Первым этапом развития специфического иммунного ответа является поглощение макрофагами антигена, внутриклеточной деградации части антигена и экспрессии вирусных пептидов на клеточной поверхности в комплексе с молекулами II класса МНС. Неспецифический сигнал передается интерлейкином (ИЛ). Активированные Thl-хелперы передают специфическую информацию предшественникам трех функционально активных субпопуляций лимфоцитов и снтезируют ИЛ-2, вызывая дифференциацию предшественников в зрелые цито-токсические CD8 Т-клетки, CD4 Т-клетки воспаления (ТЫ) и хелперные CD4 Т-клетки (Th2). В случае взаимодействия с В-лимфоцитами CD4 ТЫ-хелперы продуцируют не ИЛ, а фактор созревания и репликации В-клеток. В результате распознавания антигена зрелыми цитотоксическими CD 8 Т-клетками в эффекторную фазу иммунного ответа, происходят синтез и секреция цитотоксических белков, которые определяют либо лизис, либо апоптоз клеток-мишеней.
Созревшие CD4 Т-клетки воспаления после распознавания антигена на поверхности макрофагов начинают усиленную секрецию ИФН-гамма и ФНО-альфа и обеспечивают защиту от инфекционных агентов, которые эффективно элиминируются благодаря реакциям клеточного иммунитета. Зрелые CD4 Тп2-клетки секретируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, усиливающие гуморальный иммунитет, в результате чего реализуется защита от патогенов, подавляемых с помощью реакций гуморального иммунитета. Реакция зависимого от антител цитотоксического действия клеточного иммунитета (ЗАЦДКИ) реализуется за счет способности иммунокомпетентных клеток в присутствии противовирусных антител лизировать зараженную культуру клеток. ЗАЦДКИ характеризуется высокой специфичностью и требует минимальных количеств антител. Способность ЗАЦДКИ эффективно разрушать инфицированные мишени, на ранних этапах взаимодействия вирус-клетка, незначительные количества специфических противовирусных антител, необходимые для развития реакции и их ранее появление до активации ЦТЛ или накопления нейтрализующих антител делают этот тип иммунологических реакций важным фактором в обеспечении резистентности организма к вирусу на ранних этапах инфекции. Взаимодействие клеток, антител или их комбинации на ранних стадиях инфекции элиминирует инфицированные клетки из организма, что приводит к развитию протективного эффекта. На поздних стадиях, когда вирусом поражено значительное число клеток в жизнено-важном органе-мишени, эти же механизмы могут оказывать негативный эффект приводящий к отягощению течеия инфекции и гибели организма. При разных инфекциях реализуется разные механизмы повреждающего действия, участвуют разные эффекторы или ПВА.
Так при изучении клещевого энцефалита показано, что повреждающее действие Т-лимфоцитов опосредующих реакцию ГЗТ, может ингибироваться Т-супрессорами. Подавление иммунопатологического действия ЦТЛ in vivo, может защищать организм и пролонгировать сроки жизни зараженных животных. а) штамм MEF-1, вируса полиомиелита типа 2, получен из музея энтеро вирусных штаммов лаборатории иммунологии энтеровирусных инфекций Ин ститута полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, на уровне 8 пассажа на культуре RD (рабдомиосаркомы) с титром 107,5 ТСБ50/мл. В опытах использо вали дозу вируса от 10 до 10 ТСБ50/мл. Исследуемый вирус культивировали в роллерных стеклянных бутылях, вместимостью 1 л, на перевиваемой культуре клеток RD и хранили при - 20 С. Титрование вируса проводили в пробирках с перевиваемой культурой RD путем серийных разведений. Расчет титров вируса проводили по методу Рида и Менча (Reed L.J. & Muench Н. 1938; Ворошилова М.К.идр., 1964). б) Для доказательства специфичности индуцированных полиовирусом эффекторов ГЗТ и угнетающих их активность Т-супрессоров, использовали жи вую вакцину против желтой лихорадки (шт. 17 Д) производства Института по лиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН. 2. Культура клеток. В экспериментах использовали: а) перевиваемую культуру клеток почек обезьян FRHK-4, выращенную на сре де Игла MEM (с двойным набором аминокислот и витаминов) с 10% фетальной бычьей сыворотки, фирмы ICN FLOW; б) линию диплоидных клеток эмбриона человека КЭЧ-3, выращенную на среде Игла с глютамином и 10% нормальной бычьей сыворотки; в) перевиваемую культуру клеток рабдомиосаркомы человека (RD), выращен ную на среде Игла и 10% нормальной бычьей сыворотки; г) первичную культуру ткани почек обезьян (КТП), выращенную на среде с 0,5% гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса с рН 7,0 с добавлением 5% нормальной бычьей сыворотки.
Повреждающее действие противовирусных антител и предотвращение его развития макрофагами при эксперименталь ной полиовирусной инфекции у мышей
Таким образом, основным отличием патоморфологических изменений в ЦНС зараженных, на фоне введения ЦФН, мышей по сравнению с иммуноком-петентными, является выраженное подавление воспалительных и реактивных изменений, преобладание дегенеративных изменений нейронов в различных отделах головного мозга. Эта закономерность прослеживалась с 8 по 12 дни инфекции, т.е. сроки гибели подавляющего числа животных (Таб. 10., гр. 1 и 7; 5, 6 и 11, 12). Несмотря на столь выраженные различия в патоморфологической картине поражения ЦНС иммунокомпетентных (гр 1, ВП2) и обработанных ЦФН мышей, животные обеих групп заболевали и гибли в одни и те же сроки (Таб. 8., гр. 1 и 2). Логично предположить, что в этих двух случаях в основе генеза поражений ЦНС, приводящих к гибели организма, лежат различные механизмы.
Сопоставление динамики развития иммунного ответа и накопления вируса в ЦНС животных обеих исследуемых групп позволяет полагать, что на фоне интактной иммунной системы развитие специфического противовирусного иммунитета с одной стороны ограничивает размножение вируса в ЦНС, но с другой, антитела и специфически сенсибилизированные эффекторы, взаимодействуют с вирусиндуцированными антигенами на поверхностных мембранах инфицированных клеток ЦНС и обуславливают развитие вышеописанных патологических изменений во всех исследованных отделах ЦНС (Таб. 10., гр. 2 и 8; 3 и 9; 4 и 10). Введение ЦФН сопровождается полным подавлением образования ПВА, которые не обнаруживали в этой группе во все исследованные сроки (с 7 по 12 сутки инфекции) и задержкой развития ГЗТ, которую обнаруживали только на 11 сутки опыта (Таб. 10., гр. 2, 3 и 8, 9). Отсутствие развития противовирусного клеточного и гуморального иммунного ответа у этих животных коррелировало с более интенсивным накоплением вируса в ЦНС и массированной гибелью нейронов в спинном, продолговатом и головном мозге мышей, без выраженного развития клеточных реакции, выявляемых у иммунокомпетентных мышей (Таб. 10., гр. 2, 3 и 8, 9; 4 и 10; 5, 6 и 11, 12). Очевидно, в этой группе на первый план выступает инфицирование и лизис нейронов за счет репликации в них возбудителя инфекции. Правомерность представления патогенеза у мышей по вышеизложенной схеме нашла подтверждение при исследовании патоморфологических изменений в ЦНС животных, подвергнутых адоптивной иммунизации на фоне подавленного ЦФН иммунитета и сопоставлении этих результатов с динамикой гибели реципиентов. Как было показано выше, введение специфических ПВА, зараженным, на фоне подавленного ЦФН иммунного ответа, реципиентам на 7 сутки инфекции сопровождалось резким сокращением инкубационного периода заболевания и СПЖ этих мышей на 2,8-3 суток по сравнению с контрольной группой животных, не получавших ПВА (Раздел 7.1.).
При гистологическом исследовании тканей ЦНС было выявлено следующее. Уже на 8 день опыта, т.е. через 24 часа после введения ПВА, отмечали выраженную воспалительную реакцию и ее распространенность с охватыванием ствола, подкорковых образований и мягких мозговых оболочек. Состав клеточных инфильтратов смешанный, преобладают нейтрофилы и лимфоциты, встречаются лимфобласты. Выявляются множественные мелкие васкулиты. Клеточные элементы расположены в стенках сосудов в один ряд (мелкие «муфты») и инфильтрируют окружающую ткань мозга (Фото 4). Отмечается также диффузная пролиферация микроглии, преимущественно в стволе мозга. Вблизи васкулитов, вокруг погибающих нейро нов, идет формирование мелких гранулем из лимфоцитов. Отмечается иммунный лизис нейронов, преимущественно в передних рогах спинного мозга и в продолговатом мозге (Фото 4). На 9 день опыта характер изменений и распространенность процесса в основном сохраняется на том же уровне. Несколько усиливается интенсивность поражений нейронов в передних рогах спинного и продолговатого мозга. Отмечается выраженная воспалительная реакция, активная глиальная пролиферация и распространенная мелкоочаговая гибель нейронов вблизи пораженных сосудов (Фото 6). На 10, 11 и 12 сутки инфекции картина поражения тканей ЦНС была аналогичной. При анализе полученных данных обращает на себя внимание следующее.
Прежде всего, быстрое развитие тяжелых патоморфологических изменений, выраженная воспалительная реакция и гибель нейронов через 24-48 часов после введения ПВА по времени совпадает с развитием парезов и параличей и последующей гибелью большинства реципиентов (Таб. 10., гр. 13, 14, 15 и 7, 11, 12). Таким образом, введение ПВА сопровождалось значительным усилением гибели нейронов по сравнению с группами, не получавшими антител, именно в сроки, когда происходила «ранняя» гибель пассивно иммунизированных мышей (Таб. 10., гр. 7 и 13; 11 и 14). В эти же сроки, особенно ярко это проявляется через 24 часа после адоптивной иммунизации, наблюдали наиболее выраженную воспалительную реакцию, по своей интенсивности превышающую даже показатели, как иммунокомпетент-ной группы, так и, как будет показано ниже, групп обработанных ЦФН и адоптивно иммунизированных неиммунными, иммунными или спленоцитами в смеси с антителами (Таб. 10., гр. 15 и 6, 12, 18, 21, 24). Еще одной существенной особенностью патоморфологической картины этой группы являлось то, что после введения ПВА вокруг разрушающихся нейронов чаще отсутствуют ней-ронофагические узелки или макрофагальные гранулемы, регулярно выявляемые в гистологических препаратах тканей ЦНС иммунокомпетентных животных. Гибель нейронов в очагах воспаления, индуцированных введением ПВА, носит иммунолитический характер.
Обсуждение полученных результатов
Многолетние исследования полиовирусной инфекции позволили достаточно подробно изучить роль и показать большое значение гуморального иммунитета в обеспечении резистентности организма к вирусу полиомиелита. В качестве основного механизма элиминации полиовируса из организма рассматривается взаимодействие возбудителя инфекции с нейтрализующими антителами (Sabin А.В.,1962; Page et а/.,1988; ВОЗ, 1998, 2002). Однако, механизмы клеточной защиты при полиовирусной инфекции остаются малоизученными. Имеется весьма ограниченное количество работ, где изучалось состояние Т-системы иммунитета при острой и бессимптомной экспериментальной полиовирусной инфекции. Описаны различия в динамике нарастания количества Т-лимфоцитов, а также сенсибилизации Т-клеток в зависимости от формы инфекции. Показана активация ЦТЛ (Simons, Kutubuddin et al., 1993; Mahon B.P. , Katrak et ai, 1995). Изучение ГЗТ при экспериментальной полиовирусной инфекции позволило выявить межтиповые антигены трех типов вируса полиомиелита, т.к. спленоциты мышей, инфицированных вирусом полиомиелита, были сенсибилизированы не только к антигенам гомологичного штамма, но и одновременно к антигенам всех трех типов вируса полиомиелита (Wang К., & Sun L., 1989). Исследовалось также иммунодепрессивное действие энтеровиру-сов (Васильева И.Г., 1978). Тем не менее, многие основные вопросы состояния клеточного иммунитета в целом и роли отдельных компонентов иммунного ответа в защите животных против вируса полиомиелита остаются неизученными.
В связи с вышеизложенным, основной целью проведенных исследований было изучение некоторых, неизвестных ранее, механизмов развития иммунного ответа при экспериментальном полиомиелите у мышей и определение их роли в защите животных против вируса полиомиелита.
На первых этапах исследований нами было проведено изучение динамики инфекционного процесса, клеточного и гуморального ответа у мышей, зара женных полиовирусом на фоне интактного или подавленного иммунного ответа. В качестве модельного нами был выбран полиовирус типа 2, патогенный при интрацеребральном заражении для мышей. Установлено, что заражение мышей в головной мозг 3 х 104 TCD 50/мл полиовирусом (типа 2) штамм MEF -1 (ВП 2) сопровождается развитием характерных симптомов нейроинфекции -парезов и параличей с последующей гибелью свыше 90 % инфицированных животных. Первые признаки инфекции и гибель зараженных особей начинаются после 8 дня опыта с дальнейшим резким нарастанием симптомов заболевания и гибелью подавляющего числа мышей к 13 - 14 дню инфекции. Сходную картину развития симптомов заболевания наблюдали и у животных, одновременно с вирусом, получивших 200 мг/кг массы тела иммуномодулятора цикло-фосфана (ЦФН). Не оказывая существенного влияния на динамику гибели зараженных мышей, введение ЦФН способствовало более быстрому накоплению вируса в ЦНС. Во все исследованные сроки: 3, 5, 7, 9, 11, 13 дни опыта титры вируса в головном мозге обработанных иммуномодулятором мышей были более чем в 10 раз выше, по сравнению с иммунокомпетентными животными.
При обследовании сывороток иммунокомпетентных мышей, зараженных ВП 2 показано, что специфические противовирусные антитела (ПВА), выявляемые в реакции нейтрализации в культуре клеток обнаруживали к 7 дню инфекции в титрах от 1:8 до 1:32 и прослеживали их присутствие на этом уровне до 14 дня опыта. У мышей, наряду с вирусом получавших ЦФН, ПВА обнаружить не удавалось во все сроки обследования (со 2 по 14 дни инфекции).Изучение реакции ГЗТ проводилось на животных с интактным или подавленным с помощью ЦФН иммунным ответом. Активность эффекторов ГЗТ при полиовирусной инфекции исследовалась ранее (Wang К., Sun L., et al. 1989), однако механизм проявления реакции ГЗТ у иммунокомпетентных и иммуно-супрессированных животных оставался неизученным.
У иммунокомпетентных мышей проявление ГЗТ, в ответ на введение, предварительно зараженным полиовирусом (типа 2) животным, специфического антигена, обнаруживали на 4 сутки после заражения и прослеживали при близительно на одном уровне до 14 дня инфекции (момента гибели подавляющего числа животных). Динамика развития реакции ГЗТ у иммунокомпетент-ных мышей, зараженных ВП 2 была сходной с описанной в экспериментах с вирусами энцефаломиелита и бешенства (Tsiang Н., Langrauge Р.Н., 1990; Erlich S.S., Matsushima G.K., 1989).Аналогичные результаты развития реакции ГЗТ были получены и в опытах с адоптивным переносом спленоцитов зараженных мышей, полученных на 7 день после заражения доноров, незараженным сингенным реципиентам. Сыворотка крови зараженных доноров, полученная в аналогичные сроки, была неспособна переносить состояние ГЗТ незараженным реципиентам. Реакция также не воспроизводилась, если реципиентам инокулировали спленоциты неза-раженных доноров. Описываемая реакция была направлена против вируса полиомиелита типа 2 (ВП 2) и строго специфична. Об этом свидетельствуют опыты, в которых у зараженных ВП 2 мышей отек стопы задней конечности наблюдали только после введения в качестве разрешающей дозы гомологичного полиовируса типа 2, но не суспензию вируса желтой лихорадки.
В экспериментах, в которых клетки селезенки зараженных доноров до введения их незараженным реципиентам, обрабатывали in vitro антиh -1,2 или сывороткой против иммуноглобулинов мышей (СПГГМ) в присутствии комплемента или наслаивали на пластиковую поверхность для удаления прилипающих элементов, установлено, что иммунокомпетентные клетки, опосредующие развитие отека инокулированной ВП2 стопы у адоптивноиммунизиро-ванных животных, относятся к популяции Т-лимфоцитов. Во всех случаях, активной в индукции реакции оказалась чувствительная к действию антиh 1,2 сыворотки, не прилипающая к пластиковой поверхности, резистентная к сыворотке против иммуноглобулинов мышей, популяция спленоцитов. В общем виде наши данные подтверждают наблюдения Wang К., et а/.(1989), описавших Т-эффекторы ГЗТ при экспериментальной полиовирусной инфекции у мышей.В экспериментах по изучению реакции ГЗТ у животных с подавленным иммунным ответом установлено, что введение иммуномодулятора ЦФН одно временно с вирусом полиомиелита сопровождалось транзиторным подавлением ГЗТ. У таких животных проявления реакции не обнаруживали до 9 дня инфекции включительно. Однако если ЦФН вводили за 48 часов до заражения, то наблюдали резкое возрастание интенсивности реакции в ответ на введение разрешающей дозы вируса (с 23% у иммунокомпетентных животных до 38% в группе, предварительно за 48 часов обработанной ЦФН). У таких животных проявление реакции ГЗТ выявляли в те же сроки, что и у иммунокомпетентных особей (4 день инфекции) и регистрировали до 14 дня опыта - момента гибели подавляющего числа мышей.
