Введение к работе
Актуальность проблемы. Гормоны и цитокины обеспечивают согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем человека в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия. Недостаток гормонов и цитокинов является причиной многих заболеваний человека (например, диабет при недостатке инсулина или нарушение гемопоэза при недостатке гемопоэтических факторов), коррекция которых возможна соответствующими препаратами экзогенного происхождения. Антивирусная, иммуномодулирующая и антипролиферативная активность цитокинов - интерферонов, фактора некроза опухолей (TNF), факторов кроветворения - делает перспективными их использование в качестве лекарственных средств. Выделение биологически активных веществ (БАВ) белковой природы из природных источников (донорского материала или тканей животных) малоэффективно из-за низких концентраций целевых продуктов или невозможна из-за иммунологической несовместимости. С другой стороны, гиперпродукция цитокинов лежит в основе патогенеза многих тяжелых заболеваний человека (в случае гиперпродукции TNF - ревматоидного артрита, менингита, септического шока, кахексии и др.).
Фундаментальные достижения молекулярной биологии, молекулярной генетики и энзимологии легли в основу возникновения в 70-х гг. прошлого века генетической инженерии или технологии создания рекомбинантных молекул. Суть этой технологии состоит в соединении in vitro фрагментов ДНК из различных источников и последующем введении «искусственной» ДНК в живую клетку, где она способна реплицироваться, а кодируемая ею информация - экспрессироваться. Наиболее наглядным примером успеха такой методологии является создание новых эффективных лекарственных средств на основе БАВ белковой природы - рекомбинантных гормонов и цитокинов.
К моменту начала работ по теме диссертации было показано, что экспрессия в клетках Escherichia coli генов цитокинов - интерферона а-2 (Nagata et al., 1980; Goeddel D.V. et. al., 1981) или GM-CSF (Burgess A.W. et. al., 1987) позволяет выделить из бактериальных клеток биологически активные рекомбинантные белки. Сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская область) и Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина (г. Москва) методом прямого химического синтеза был получен и клонирован в бактериальной плазмиде (pLeIFlac) синтетический ген ifn а-2 человека (Колосов М.Н. и др., 1984). Необходимым продолжением этих работ является разработка стратегии создания высокопродуктивных штаммов E. coli, обеспечивающих синтез таких важнейших для медицины БАВ, какими являются интерферон и GM-CSF.
В работах ряда исследователей (Щелкунов С.Н., 1995; Alcami A., 2003; Lukas A., McFadden G., 2004) высказаны предположения о возможности использования вирусных иммуномодуляторных белков для антицитокиновой терапии. Получение таких белков в биологически активной форме возможно в ряде случаев только в эукариотических клетках. Удобной системой для решения этой задачи является бакуловирусная система экспрессии.
Настоящая диссертационная работа посвящена конструированию штаммов-продуцентов интерферона a-2b и GM-CSF человека на основе бактерии E. coli, а также рекомбинантных бакуловирусов, содержащих в своем геноме гены ортопоксвирусных TNF-антагонистов, и изучению свойств рекомбинантных белков, выделенных из бактериальных клеток и инфицированных клеток насекомых.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных цитокинов - интерферона a-2b человека (hIFNa-2b), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (hGM-CSF) и эукариотических продуцентов TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян (VARV- CrmB, CPXV-CrmB, МPXV-CrmB), а также изучение физико-химических и биологических свойств этих рекомбинантных белков.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-сконструировать рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых генов в бактериальных клетках E.coli;
-изолировать из вирусных геномов гены TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян и получить рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие гены вирусных TNF- связывающих белков в клетках насекомых;
-выделить из клеток штаммов-продуцентов и изучить физико- химические и биологические свойства полученных рекомбинантных белков (hIFNa-2b, hGM-CSF, VARV-CrmB, CPXV-CrmB и МPXV- CrmB);
-оценить терапевтический потенциал рекомбинантных белков hGM- CSF и VARV-CrmB.
Научная новизна и практическая значимость результатов исследования. Впервые получены рекомбинантные бакуловирусы BTRi67 и BTRz96, детерминирующие в клетках насекомых линии Sf21 синтез TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы обезьян (белков VARV- и MPXV-CrmB), и впервые проведено сравнительное изучение свойств белков VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB in vitro. Впервые оценен TNF-нейтрализующий потенциал белка VARV-CrmB относительно некоторых TNF-антагонистов (клеточных TNF-рецепторов, поликлональных антител, TNF- нейтрализующего моноклонального антитела МАК 195, коммерческого препарата Ремикейд) на клетках мышиных фибробластов линии L929. Впервые показана TNF-нейтрализующая активность белка VARV-CrmB in vivo: увеличение количества выживших животных в экспериментальной модели эндотоксического шока и снижение МuTNF- индуцированной подвижности дендритных клеток кожи мышей линии Balb/с. Впервые показана нейтрализация белком VARV-CrmB эффектов МuTNF на модели костномозгового гемопоэза мышей Balb/c.
Сконструированы оригинальные рекомбинантные ДНК, обеспечивающие эффективный синтез в клетках E.coli продуктов экспрессии синтетических генов ifna-2b и gm-csf человека. Получен и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов высокоэффективный штамм E.coli SG20050/рIF16 (B- 5809) - продуцент рекомбинантного интерферона a-2b человека с
выходом целевого продукта 3-4 х 10' МЕ/мл/10 кл. На основе этого штамма в ГНЦ ВБ «Вектор» разработана технология получения субстанции интерферона a-2b и его лекарственных форм. Получен и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов штамм E.coli SG20050/p280GM (B-6613) - первый отечественный продуцент рекомбинантного GM-CSF человека, обеспечивающий выход целевого продукта в количестве 20-50 мг/л клеточной суспензии. Показано, что продукт экспрессии синтетического гена gm-csf в клетках E.coli видоспецифически стимулирует гранулоцитарно-макрофагальную дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток и дендритных клеток. Получен штамм-продуцент и препарат рекомбинантного MuTNF, что позволило использовать этот рекомбинантный белок в экспериментальных моделях при изучении терапевтического потенциала поксвирусных TNF-антагонистов.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международный симпозиум «Регуляция трансляции», Рига (1989); III-я Всесоюзная конференция «Макромолекулы и клетки», Москва, Россия (1989), 2nd International conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St. Petersburg, Russia (1992); XI Poxvirus and Iridivirus Meeting, Toledo, Spain (1996); 2nd Russian Principal Investigator Conference, Holland (2001); Международная школа - конференция «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, Россия (2002); 1st International Congress BIOTECHNOLOGY- state of the art&prospects of development, Moscow, Russia (2002); Workshops "Review of Cooperative Biodefense Research Projects, Serpukhov, Russia (2002), St. Petersburg, Russia (2003); International conference "Chemical and biological problems of proteomics", Novosibirsk, Russia (2004); CBR annual review conference, St. Petersburg, Russia (2004); 12th International Congress of Immunology, Montreal, Canada, (2004); XVth International Poxviral and Iridoviral Symposia, Oxford, UK
-
; Всероссийский научный симпозиум с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск, Россия,
-
; 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary
-
; Научно-практическая конференция «Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики», Харків, України, (2006); 17th International Poxvirus and Iridovirus Conference, Grainau, Germany, (2008); XIV International congress of virology, Istanbul, Turkey (2008); Всеросийская научно-практическая конференция «Современные представления об иммунокоррекции», Пенза, Россия, (2008); 18-я Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье»,
Санкт-Петербург, Россия (2009); Всероссийская научная конференция «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск, Россия (2010).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список работ, опубликованных по теме диссертации, и библиографический список. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста и включает 126 рисунков и 50 таблиц. Библиографический список содержит 643 источника.
