Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время, как в нашей стране, так и за рубежом врожденные пороки развития (ВПР) приобретают все больший удельный вес в структуре детской заболеваемости и смертности (О. В. Антонов, 2005; В. И. Кулаков, 2005; Н. С. Демикова, 2005; А. В, Патрушев, 2006; Н. В. Зарецкая, 2007; М. М. Adams, 2001). По данным ВОЗ частота врожденных пороков развития колеблется в различных странах от 2,7 до 163 % Пятилетний мониторинг врожденных пороков развития в России (1999-2003 гг.), в котором участвовало 35 субъектов Российской федерации, показал, что частота ВПР среди мертворожденных составляет 2,18%о, что более, чем в 12 раз выше, чем у живорожденных (0,18%о). Отмечены значительные колебания частот ВПР по регионам - от 7,3%о до 40,0%о, при среднем показателе -16,6 на 1000 рождений (Н.С. Демикова, 2005). Врожденные пороки развития (ВПР) являются одной из главных причин смерти детей в перинатальном (29%) и младенческом периоде (23%) в Дальневосточном федеральном округе (В.К Козлов, 2004).
Известно, что формирование ВПР у детей происходит в значительной степени под воздействием генетических и средовых факторов, а также имеет мультифакториальную природу (В.А. Цинзерлинг, 2002; H.IL Шабалов, Ю.В. Цвелев, 2004), при этом более 60,0% случаев с ВПР остаются нерасшифрованными (А.Ю. Мощинецкий, 1998). Для разработки методов их эффективной профилактики особую важность приобретает выявление причин и механизмов возникновения раннего нарушения эмбриогенеза, а также совершенствование предгравидарной подготовки женщин с целью выявления групп риска по реализации внутриутробной инфекции. Выяснение роли микроорганизмов в этиологии врожденных пороков и аномалий не теряет своей актуальности, так как может был. основанием для разработки этиотропного лечения жизнеспособных детей с ВПР и внутриутробной инфекцией (ВУИ).
Внедрение современных чувствительных и специфичных методов исследований позволяет более глубоко изучить роль инфекционных возбудителей как одну из основных причин врожденной патологии плода.
Цель исследования: Изучить роль вирусов в этиологии врожденных пороков развития и при инфекционно-воспалительных процессах у погибших плодов и детей в г. Хабаровске.
Задачи:
Провести анализ частоты и структуры врожденных пороков и аномалий развития при антенатальной и перинатальной смертности в г. Хабаровске.
Усовершенствовать метод выявления инфекционных агентов при посмертном исследовании плодов и новорожденных с врожденными пороками развития и внутриутробной инфекцией.
3.-Изучить частоту и структуру инфекционных агентов в
патологоанатомическом материале при фетоинфантильных потерях, обусловленных врожденными пороками развития и внутриутробной инфекцией. '
4. Определить группы риска по формированию врожденных аномалий плодов у женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом в зависимости от наличия маркеров вирусных инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
Частота рождения детей с ВПР в г. Хабаровске имеет тенденцию к нарастанию.
Основной причиной фетоинфантильных потерь в г. Хабаровске является вирусная или вирусно-бактериальная инфекция.
Основными этиологическими агентами при ВПР и ВУИ являются вирусы простого герпеса, цитомегалии, вирус краснухи и энтеровирусы.
Вирусная инфекция у детей с врожденными пороками и аномалиями развития протекает как генерализованная: геномы вирусов обнаруживаются как в пораженном органе, так и в других органах и системах при сопутствующих воспалительно-дегенеративных изменениях.
У женщин с отягощенным акушерским гинекологическим анамнезом во время беременности происходит активизация хронической цитомегаловирусной и герпетической инфекции.
Научная новизна.
Впервые изучена частота и структура ВПР при антенатальной и перинатальной смертности в г. Хабаровске. Выявлена тенденция к нарастанию относительных показателей частоты ВПР при фетоинфантильных потерях за период с 1993 по 2006 год с 14,6% до 29,2%, при относительно стабильных (от 1,4 до 3,5%) показателях уровня ВПР, связанных с геномными и хромосомными аномалиями.
Впервые использован усовершенствованный нами способ для подготовки . патологоанатомического материала, что позволило повысить эффективность выделения нуклеиновых кислот вирусов.
Впервые на основании исследования содержания ДНК и РНК в патологоанатомическом материале изучена частота и структура широкого спектра патогенов вирусной природы в этиологии фетоинфантильных потерь при ВУИ и ВПР. Установлена ведущая роль вирусной инфекции в формировании системных и множественных ВПР.
Впервые выявлено сходство структуры антенатальной инфекции у детей и плодов с ВУИ и ВПР.
Впервые изучена роль вирусов Эпштейна-Барр, герпеса человека 6 типа и парвовируса В-19 в этиологии врожденных пороков и аномалий развития в г. Хабаровске.
Практическая значимость работы:
1. Установлено, что около половины детей с врожденными пороками и аномалиями развития погибают в возрасте от 28 дней до 1-го года жизни. Полученные данные о текущей генерализованной инфекции у детей с ВУИ и ВПР указывают на необходимость раннего проведения вирусологического обследования живорожденных детей с симптомами ВПР и ВУИ с последующим назначением противовирусного лечения, начиная с первых дней жизни.
Выявление ведущего значения генерализованной вирусной инфекции как причины смерти детей дают основание рекомендовать вирусологическое исследование постаортального материала для уточнения этиологии нарушения антенатального развития плода и новорожденного с целью разработки программы подготовки женщины к последующей беременности.
Анализ анамнестических данных об исходном состоянии женщины необходим для прогноза степени риска развития ВПР и ВУИ у будущего ребенка.
Полученные в ходе исследования доказательства активизации хронической герпетической и другой инфекции уже в первом триместре беременности являются основанием рекомендовать вирусолого-серологическое обследование женщин групп риска с первых недель гестации для разработки в дальнейшем оптимальной программы наблюдения во время беременности.
5. Полученные доказательства эффективности генодиагностики вирусов и
бактерий в ПНР и повышения чувствительности метода обнаружения как ДНК, так и
РНК при ранней обработке постмортального материала с применением
дополнительного лизиса, позволяют рекомендовать его в лабораторной практике для
скрининга на широкий спектр патогенов.
Формы внедрения:
- Патент на изобретение №2292551 от 27.01.2007г. «Способ ранней
диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных».
- Информационно-методическое письмо «Клинический материал для
диагностики вирусных и бактериальных инфекций, условия забора и
транспортировки» г. Хабаровск, 2004. - 18с.
Апробация материалов диссертации:
Материалы диссертации представлены на конференции с международным участием «Комплексная оценка состояния здоровья детей и подростков в Дальневосточном регионе» (Хабаровск, 2004); на конференции по генодиагностике (Новосибирск, 2005); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы охраны здоровья женщин и детей на современном этапе» (Хабаровск, 2006); на научно-практической конференции «Клинические и фундаментальные аспекты состояния здоровья коренного и пришлого населения в Дальневосточном федеральном округе» (Хабаровск, 2007); на научно-практической конференции с международным участием «Роль вирусной и бактериальной инфекции в формировании перинатальной и соматической патологии у детей» (Хабаровск 2008).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 работы - в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объём диссертации.
Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация изложена на 150-и листах машинописного текста,
иллюстрирована 32-я таблицами и 5-ю рисунками. Библиографический указатель включает282 источника, из которых-191- российскийи 92-иностранных. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант 04-04-97006 «Оценка роли инфекционных факторов в формировании перинатальной смертности». «Приамурье - 2004», 2004-2005 гг. Г.Р. 0120.0-500685 и в соответствии с темой ИОМиД НИР 014 «Усовершенствование дородовой диагностики внутриутробных инфекций», выполненной в Хабаровском филиале Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства.
Материалы и методы исследования
Для определения частоты и структуры ВПР при фетоинфантильных потерях ретроспективно изучено 3762 протокола вскрытия погибших плодов с массой тела выше 500г и умерших новорожденных, проживших от нескольких минут до 7 дней за период с 1993 по 2006 годы. У 714 погибших детей с установленными врожденными пороками развития был проведен углубленный анализ причин перинатальной смерти. Для синдромологического анализа постмортального фенотипа в группе системных и множественных пороков развития использовали компьютерные базы данных «Syndiag» (Минск) и «OMD-LDDD» (Лондон).
С целью определения частоты и структуры вирусной инфекции при фетоинфантильных потерях обусловленных ВПР и ВУИ методом ПЦР исследован ' секционный материал от 147 умерших плодов и новорожденных (1253 препарата внутренних органов - головной мозг, сердце, легкое, печень, почка, селезенка, тимус, плацента). Группу сравнения составил секционный материал (88 проб) от 11 плодов, полученных при прерывании беременности на 20-23 неделях гестации по социальным показаниям и эмбриональный абортный материал от 70 случаев добровольного прерывания беременности на 5-12 неделях.
Для выбора оптимального метода выявления инфекционных агентов в патологоанатомическом материале проведено сравнение эффективности трех методов исследования: культурального метода (КМ), реакции иммунофлюоресценции (РИФ), полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве модели индикаторов эффективности использованы эталонные вирусы: вирус простого герпеса 1 типа (штамм Л-2) и цитомегаловирус (штамм АД 169). Для накопления вирусов использована клеточная культура ФЭЧ (фибробласты эмбриона человека), культуральные среды производства ГУЛ ИПВЭ им. М.ПЛумакова, РАМН, г. Москва.
Фрагменты органов от 15 погибших детей с подтвержденной в ПЦР вирусной инфекцией были параллельно исследованы методами РИФ, РНИФ мазков-отпечатков и быстрым культуральным методом (БКМ). Для выявления антигенов вирусов в мазках-отпечатках и в клеточной культуре использовали тест-системы, разработанные в НИИ гриппа РАМН (ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург). Для детекции антигенов CMV использовали моноклональные антитела против сверхраннего белка р72 CMV, набор «ЦитомегаФлюоСкрин» (НИАРМЕДИК ПЛЮС, Москва).
Для оптимизации выделения нуклеиновых кислот (НК) из секционного материала 149
, фрагментов органов были исследованы с помощью 3-х вариантов подготовки проб с
применением диагностических наборов, разработанных разными фирмами: 1. Фенольно-
хлороформная экотракция с применением наборов «ВекгоДНК - экстракция», производства ЗАО «Вектор - Бест», пос. Кольцово Новосибирской обл. Метод был нами модифицирован: фрагменты органов предварительно измельчались и обрабатывались лизирующим раствором (0,1% раствора capKO3Hna,0^%DSN, l,5MNaCl,03M NaOH, при t=+4C в течение 16-18 ч). Способ был использован нами для изучения этиологической структуры фетоинфантильных потерь (получен патент), 2. Фенольно-хлороформная обработка «ДНК/РНК экстракция», производства НПФ «Литех», г. Москва, 3. Сорбционный метод, производство ООО «Изоген», г. Москва.
Для ПЦР использованы тест-системы АмплиСенс, производства ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва с целью выявления ДНК или РНК следующих возбудителей: Herpes simplex virus 1,2 (HSV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), Human herpes virus 6 type (HHV6), Human Influenza virus A(InfVA), Human Influenza virus B(InfVB), Human Respiratory Syncytial virus (HRSV), Enteroviruses (EVs), Parvovirus В19, Rubella virus (RuV), Chlamydia trachomatis (Ctr), Mycoplasma hominis (Mho), Mycoplasma genitalium (Mge), Ureaplasma urealyticum (Uur), Toxoplasma gondii (Tgo). Результаты ПЦР учитывали методом электрофореза в агарозном геле.
Для определения факторов риска у женщин с отягощенным акушерским анамнезом (ОАГА) проанализированы ретроспективно анамнестические данные 57 женщин с ОАГА (группа наблюдения) и 100 здоровых женщин.
Методом ПЦР исследованы эпителиоциты цервикального канала 165 беременных и небеременных женщин с ОАГА и 223 здоровых женщин на наличие ДНК вирусов герпеса 1,2 типов, цитомегаловируса, хламидий, микоплазм.
Для ПЦР использовались тест-системы АмплиСенс, производства ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва.
Сыворотки крови 462 беременных и небеременных женщин с ОАГА, а также здоровых женщин группы контроля исследованы иммуноферментным методом (ИФА) на присутствие антител классов Ig М и IgG к HSV, CMV, Rub, антител IglEM и IglEG к сверхранним белкам CMV, низкоавидных IgG к HSV-2, CMV и Rub, IgM, IgA, IgG к возбудителю хламидиоза - СЫ. trachomatis, IgG, IgA к возбудителям M.hominis и Ur. urealyticum, IgM и IgG к возбудителю токсоплазмоза - Toxoplasma gondii (тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» пос. Кольцово Новосибирской обл.
Анализ патологоанатомических данных проведен совместно с заведующей патологоанатомическим отделением ДККБ г. Хабаровска, врачом высшей категории Т.М. Бутко. Генетические исследования выполнены совместно с заведующим медико-генетической консультацией ГУЗ Перинатального центра, врачом высшей категории С.А.Гончаром.
Статистическая обработка полученных показателей проводилась с использованием методов вариационной статистики с расчетом относительных показателей и их ошибок, с оценкой достоверности различий по t-критерию Стьюдента. Обработка материала проводилась на ПК с применением пакета прикладных программ MicrosoftOffiisXP, «Statistica, версия 6,0».
