Содержание к диссертации
Введение
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
II.1. Пектинметилэстераза растений 9
II. 1.1. Клеточная стенка растений... 9
II. 1.2. Биохимические процессы клеточной стенки, с участием пектина. 12
II.1.3. Роль пектинметилэстераз в биогенезе клеточной стенки 15
II.1.4 Классификация Пектинметилэстераз 18
II. 1.5. Трехмерная реконструкция ферментативной части ПМЭ 20
II. 1.6. Взаимодействие ПМЭ с транспортным белком вируса табачной мозаики 21
II.2. УМОЛКАНИЕ ГЕНОВ У РАСТЕНИЙ 23
II.2.1. Короткие двухнитевые РНК (siPHK, miPHK, ta-siPHK) - основные участники УГ 26
II.2.2. Цитоплазматическое умолкание РНК 26
II.2.3. Умолкание эндогенной мРНК с помощью ШІРНК 28
II.2.4. Метилирование ДНК и подавление транскрипции ..28
ІІ.2.5. Дайсеры 28
II.2.6 Аргонавты и индуцируемый РНК комплекс УГ 35
II.2.7 РНК-зависимая РНК-полимераза 37
II.2.8 Системное УГ 38
II.2.9 РНК-зависимое метилирование ДНК и участие РНК-полимеразы. 40
II.2.10 Вирусные супрессоры УГ 41
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 69
IV. 1 Выделение кДНК гена ПМЭ из табака (N.tabacum) и его экспрессия в экспериментах по агроинфильтрации листьев бентамианы (N. benthamiana) 69
IV.2. Подавление репродукции ВТМ-ЗФБ при совместной агроинфильтрации скДНКПМЭ 74
IV.3 Подавление ПМЭ накопления вирусных РНК и стимулирование образования siPHK 80
IV.4 ПМЭ не оказывает влияния на репродукцию ХВК, если активен вирусный ген-супрессор умолкания генов 25К ТБП 82
IV.5 ПМЭ усиливает умолкание РНК трансгенного ЗФБ 84
IV.6 ПМЭ вызывает накопление ядерного белка DCLl в цитоплазме 86
IV.7 Стимулирование процессинга miPHK при экспрессии ПМЭ 88
IV.8 Подавление ингибирующего эффекта ПМЭ предшественником 89
V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 90
VI. ВЫВОДЫ 94
VII. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 96
- Клеточная стенка растений...
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- Выделение кДНК гена ПМЭ из табака (N.tabacum) и его экспрессия в экспериментах по агроинфильтрации листьев бентамианы (N. benthamiana)
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Введение к работе
Умолкание генов (gene silencing), посттранскрипционное умолкание генов или РНК интерференция (РНКІ) - все эти термины обозначают механизм регуляции активности генов, заключающийся в нуклеотид-специфическом контроле активности мРНК, включающем в себя вирус-индуцируемое умолкание генов (ВИУГ) и трансген-индуцируемое умолкание генов (ТИУГ). ВИУГ и ТИУГ имеют общие черты для всех эукариот. Молекулярный механизм умолкапия генов включает: (а) нарезание двухнитевой РНК на короткие (21-25 нт) интерферирующие РНК (siPHK); (б) включение одной из нитей siPHK в так называемый РНК-ипдуцируемый комплекс умолкапия (ИРКУГ), где происходит взаимодействие с мРНК-мишенью, приводящее к ее деградации или ингибированию трансляции. Сейчас известно, по крайней мере, три уровня умолкапия РНК: ВИУГ, ТИУГ и умолкание эндогенной РНК с помощью так называемых микро-РНК (miPHK), которые структурно не отличаются от siPHK. Во всех этих процессах ключевую роль играют два белка: (а) фермент, относящийся к семейству РНКаз III, получивший название дайсера (DCR) и (б) белок ARGONAUTE, способный разрушать мРНК-мишень в ИРКУГ. В растениях дайссры получили название DCR-like (DCL). Эти ферменты могут быть разделены на 4 типа: (a) DCL1, участвующий в биогенезе тіРИК; (б) DCL2, образующий siPHK из вирусных днРНК; (в) DCL3, образующий эндогенные siPHK, ответственные за модификацию хроматина; (г) DCL4, ответственный за образование ta-siPHK.
Поиск и идентификация клеточных белков, участвующих в ВИУГ и ТИУГ, расширяет наше представление об этом важном общебиологическом явлении. Одним из таких белков является пектинметилэстераза (ПМЭ). Этот фермент катализирует деэстерификацию пектина и участвует в биогенезе клеточной стенки (КС), развитии корневой системы, стебля, росте пыльцевой трубки и созревании плодов. Однако в последнее время становится все более очевидным, что роль ПМЭ в жизни растений этим не ограничивается. Ранее в нашей лаборатории было показано, что ПМЭ табака способна взаимодействовать с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ). Полагают, что ПМЭ клеточной стенки может выполнять функцию клеточного рецептора транспортного белка и взаимодействие ПМЭ с транспортным белком необходимо для эффективного вирусного транспорта.
В данной работе нами выделена полная кДНК гена ПМЭ табака и исследована роль ПМЭ в вирус-индуцируемом и траис-индуцируемом умолкании генов.
Клеточная стенка растений
Клеточная стенка является важнейшим компонентом растительной клетки. Она образует внешний скелет клетки, определяет её форму, обеспечивает адгезию соседних клеток(І\уаі et al., 2002); (Parre and Geitmann, 2005). Клеточная стенка играет важную роль в проведении межклеточного сигнала, участвует в дифференцировке и определяет направление роста клетки (Carpita and Gibeaut, 1993). Растения должны защищать себя не только от поедания животными и насекомыми, которых можно отпугнуть шипами, стрекательными клетками, алкалоидами или горьким вкусом, но и от атаки фитопатогенных бактерий, грибов и растительных вирусов. Если у животных хорошо развита иммунная система, в виде макрофагов, лейкоцитов или антител, которые могут быть доставлены в пораженные патогенами участки, то у растений нет системы циркуляции и каждая отдельная клетка должна автономно содержать весь набор защитных механизмов. Растения являются неподвижными организмами, поэтому клеточная стенка, является самым главным элементом защиты против внешних воздействий. Клетки растений ограничены клеточной мембраной, за которой следует первичная клеточная стенка, толщиной около 1 мкм, затем между ними начинает формироваться вторичная клеточная стенка более толстая и жесткая, которая начинает образовываться после того, как клетка в основном перестала расти и выполняет опорную функцию (Varner and Lin, 1989). Жесткость клеточной стенке придают целлюлозные кристаллические фибриллы уложенные в несколько параллельных слоев, соединяясь между собой гемицеллюлозными цепочками, образуя целлюлозный каркас (Engelscn et al., 1996). Схематичное строение клеточной стенки представлено на рис.(1).
Материалы и методы
Для клонирования последовательности кДНК гена ПМЭ была использована табачная библиотека в фаговом векторе NM1149, содержащая 1.5x106 независимых клонов. В этот вектор была клонирована кДНК табака с использованием EcoPJ-Notl адаптеров. Библиотека была любезно предоставлена Dr.W.Rohde. Фаговая библиотека разводилась таким образом, чтобы в верхнем слое 0.8% -ного агара в чашке Петри было 105 бляшек. Верхний слой агара приготовлен из расчета 100 мкл ночной культуры клеток Е. coli штамма LE 392 на 5 мл агара. Бляшки гибридизовали радиоактивно меченным 0.8 кб фрагментом гена ПМЭ, который был получен ранее. Бляшки, которые дали сильный положительный сигнал, высевали отдельно и гибридизовали ещё раз. Всего было получено 12 клонов. ДНК из фаговых бляшек, которая гибридизовались с ПМЭ-зондом, подращивали, выделяли ДНК и гидролизовали её EcoPJ рестриктазой. Полученные фрагменты переклонировали в плазмидный вектор pUC19 и секвенировали на автоматическом секвенаторе (Applied Biosystems) по Сэнгеру, Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что они принадлежат к двум классам. П из 12 клопов имели только часть последовательности ПМЭ (Dorokhov et al. 1999) и, только один клон содержал полную последовательность кДНК гена ПМЭ. Этот клон был обозначен, как ргоРМЕ-1 (EMBL код доступа No. AJ401158).
Выделение кДНК гена ПМЭ из табака (N.tabacum) и его экспрессия в экспериментах по агроинфильтрации листьев бентамианы (N. benthamiana)
Ранее в нашей лаборатории с помощью RT-PCR была выделена кДНК зрелого фермента ПМЭ табака (Dorokhov et al., 1999). Исследование мы начали с выделения полноразмерного гена. Для этой цели была использована фаговая библиотека табачной кДНК. Используя гибридизацию с клоном, выделенным paiiec(Dorokhov et al., 1999), мы выделили и определили нуклеотидные последовательности двенадцати клонов. Анализ этих нуклеотидных последовательностей показал, что все они принадлежат к мультигенному семейству растительной ПМЭ (Micheli, 2001). На рис. 19 показана аминокислотная последовательность табачной ПМЭ (tobPME) и проведено ее сравнение с последовательностями ПМЭ томатов (tomPME), лимона (citPME) и моркови (сагРМЕ). В начале аминокислотной последовательности ПМЭ находится домен гидрофобных аминокислот. Компьютерный анализ окружающих его аминокислот показывает, что белок должен встраиваться в мембраны как мембранный белок второго типа, т.е. N-конец аминокислотной цепи находится снаружи, а С-конец - внутри мембранных везикул (Hartmann, Rapoport, and Lodish, 1989; Hartmann, Wiedmann, and Rapoport, 1989).
Известна трехмерная структура ПМЭ из Daucus сагоіа (Johansson et al., 2002), полученная с помощью рентгепоструктурного анализа кристалла зрелого белка. На основании этих данных была предложена модель структуры активного центра ПМЭ, в состав которого входят аминокислоты, отмеченные звездочкой.
Обсуждение результатов
Известно, что ПМЭ участвует в биогенезе клеточной стенки, развитии корневой системы (Stephenson and Hawes, 1994), стебля, росте пыльцевой трубки и созревании плодов (Arancibia and Motsenbocker, 2006; Ciardiello et al., 2004; Frenkel et al., 1998; Steele, McCann, and Roberts, 1997). Однако, в последнее время становится все более очевидным, что роль ПМЭ в жизни растения этим не ограничивается. Ранее в нашей лаборатории было показано, что ПМЭ табака способна взаимодействовать с ТБ ВТМ (Dorokhov et al., 1999). Полагают, что ПМЭ КС может выполнять функцию клеточного рецептора ТБ и взаимодействие ПМЭ с ТБ требуется для эффективного вирусного транспорта (Chen et al., 2000).
ПМЭ синтезируется в клетках всех высших растений. Важно знать особенности структуры гена ПМЭ, и недавно была сделана попытка систематизировать наши представления об этом. ПМЭ как семейство генов разделили на 8 групп, кладов. Табачная ПМЭ, выделенная и секвен про ванная в нашей работе, попадает в группу Plant 1, к которой относятся ПМЭ с длинной лидерной областью (255 а.к.) и пятью консервативными сигнатурными доменами зрелого фермента.
В нашей работе впервые изучена транзиентная (временная) экспрессия полноразмерной кДНК ПМЭ в растительной клетке. Показано, что ген экзогенной ПМЭ хорошо экспресс ируется и повышает уровень ферментативной активности ПМЭ КС, в то время как асПМЭ резко блокирует эндогенную ПМЭ. Проведенный мутационный анализ впервые экспериментально подтвердил ранее предполагавшуюся модель активного центра ПМЭ.
Тестирование биологической активности гена ПМЭ и его мутантов было только прелюдией к решению основной цели данного исследования -выявлению роли ПМЭ в развитии вирусной инфекции. Известно, что растение реагирует на проникновение чужеродного генетического материала развитием механизма умолкания РНК. Более того, растения были первым биологическим объектом, где это явление было показано в 1990 году. Сейчас известно, по крайней мере, три уровня умолкания РНК: ВИУГ, ТИУГ и умолкание эндогенной РНК с помощью miPHK. События, сопровождающие агроинфекцию растений вирусным вектором (метод, используемый в данной работе), являются примером первого уровня умолкания РНК, сопровождающегося разрушением вирусной РНК и накоплением siPHK. Наши эксперименты показывают, что этот процесс резко усиливается при введении в клетки экзогенной ПМЭ. Достоверно установлена обратная зависимость между уровнем ферментативной активности ПМЭ и способностью клеток репродуцировать вирус. Разрушение вирусной РНК сопровождается одновременным накоплением siPHK, которая является отличительной чертой умолкания РНК. ПМЭ индуцирует не только ВИУГ, но и ТИУГ, что может указывать на общие механизмы развития этих процессов.
