Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Структурная организация генома 11
1.1 Основные принципы организации хроматина в ядре клетки 11
1.2 Доменная организация хроматина 12
1.3 Топологические ассоциированные домены (ТАД) .14
1.4 Механизмы образования хроматиновых доменов .15
ГЛАВА II. ЦИС-регуляторные элементы. общие свойства инсуляторов и промоторов 16
2.1 Цис-действующие регуляторные элементы 16
2.2 Барьерные инсуляторы и промоторы 21
2.3 Энхансер-блокирующие инсуляторы и промоторы .23
2.4 Белки инсуляторов Drosophila melanogaster 25
2.5 Энхансер-блокирующие инсуляторы и хроматиновые петли 26
2 Материалы и методы 29
2.1 Генетические методы 29
2.1.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе 29
2.1.2 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий 29 2.1.4 Генетические скрещивания 31
2.2 Биохимические методы .33
2.2.1 Работа с бактериальным штаммом E.coli DH5 33
2.2.2 Работа с ДНК 34
2.3 Создание трансгенных конструкций .37
3 Результаты 42
Часть I: Исследование SCS- и SCS -инсуляторов 42
3.1 Исследование функционального взаимодействия между SCS- и SCS инсуляторами .42
3.2 Тестирование SCS- и SCS -инсуляторов на промоторную активность в эмбриональных S2-клетках 45
3.3 Обнаружение функционаьного сигнала полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора 47
3.4 Тестирование SCS-инсулятора на терминирующую активность в глазных имагинальных дисках Drosophila melanogaster 48
3.5 Тестирование SCS-инсулятора на промоторную активность в глазных имагинальных дисках Drosophila melanogaster .50
Часть II: Дистальное взаимодействие промоторов CG3777 и yellow 52
3.6 Промоторы генов CG3777 и yellow функционально взаимодействуют друг с другом 52
3.7 Результат взаимодействия между промоторами генов CG3777 и yellow зависит от их взаимного расположения .54
4 Заключение 58
4.1 Новые свойства SCS- и SCS -инсуляторов 58
4.2 Функциональные взаимодействия промоторов yellow и CG3777 60
Выводы .62
Список литературы .
- Доменная организация хроматина
- Барьерные инсуляторы и промоторы
- Обнаружение функционаьного сигнала полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора
- Функциональные взаимодействия промоторов yellow и CG3777
Введение к работе
Актуальность работы
Геном эукариот является сложноорганизованной системой, координированная работа которой необходима для осуществления всех этапов передачи и реализации генетической информации. Последовательная активация и инактивация генов происходит, в том числе и благодаря четкой и скоординированной во времени и пространстве регуляции всех этапов транскрипции. В этом процессе необходимо особо отметить важность цис-регуля-торных элементов генома, под строгим контролем которых происходит правильная и своевременная активация/репрессия генов высших эукариот. За счет взаимодействия специфичных транскрипционных белковых факторов, на которых собираются особые регуляторные белковые комплексы, с промоторами генов и дистально-расположенными элементами (эн-хансерами и сайленсерами) происходит включение или выключение промоторов генов.
Энхансеры эукариот не обладают специфичностью действия и взаимодействуют с промотором вне зависимости от положения относительно направления старта транскрипции мишеневого гена. Часто энхансер и промотор гена находятся на расстоянии десятков тысяч пар нуклеотидов друг от друга, кроме того, между геном и энхансером может располагаться ген с другой программой экспрессии, и гены могут перекрываться. Следовательно, клетки эукариот должны были выработать механизмы, определяющие специфичность действия энхансера. Существуют экспериментальные доказательства того, что в процессе активации энхансер и промотор физически сближаются в пространстве, а расположенный между ними участок ДНК выпетливается. Однако механизм и движущая сила такого явления остаются слабо изученными.
Помимо энхансеров в геноме существует другой класс регуляторных элементов -сайленсеры. Сайленсерные элементы репрессируют транскрипцию генов, и, подобно энхансерам действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия.
Влияние на транскрипционный статус гена оказывают упаковка ДНК в хроматин, а также формирование внутри ядра определенных хромосомных территорий, содержащих регуляторные белковые комплексы. Одним из уровней осуществления координированной регуляции транскрипции является организация генов в независимые кластеры (домены) с одинаковыми профилями экспрессии. Формирование независимых функциональных доменов подразумевает наличие дополнительных регуляторных элементов, защищающих от позитивного или негативного влияния окружающего хроматина и участвующих в
координации энхансер-промоторных взаимодействий. Принято считать, что эту функцию выполняют инсуляторы.
Инсуляторы – это цис-регуляторные элементы, которые блокируют промотор гена от действия энхансера, если располагаются между ними, а также ограничивают распространение репрессионных сигналов, индуцированных действием сайленсеров или гетерохромати-ном. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера, сайленсера и промотора: энхансер (сайленсер) сохраняет способность влиять на незаблокированный промотор, а промотор может быть активирован (репрессирован) другим энхансером (сай-ленсером).
На современном этапе развития молекулярной генетики идентификация последовательностей, вовлеченных в регуляцию транскрипции, выяснение их основных свойств и функциональной роли в поддержании экспрессии генов является одной из важнейших задач. Это определяет актуальность подобных исследований в настоящее время.
Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы явилось изучение свойств SCS- и SCS’-инсуляторов и взаимодействия между промоторами соседних генов yellow и CG3777 у Drosophila melanogaster.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать в трансгенных линиях дрозофилы способность SCS- и SCS’-инсуляторов функционально взаимодействовать друг с другом на расстоянии, на котором эти инсуляторы находятся in vivo.
-
Проверить SCS- и SCS’-инсуляторы на промоторную активность в трансгенных линиях дрозофилы и S2-клетках.
-
Выяснить, входят ли в состав SCS-инсулятора активные сигналы полиаденилирования.
-
Исследовать функциональное взаимодействие между промоторами генов yellow и CG3777 в трансгенных линиях дрозофилы.
Научная новизна и практическая ценность работы
В работе были исследованы фрагменты SCS- и SCS’-инсуляторов, и было показано, что взаимодействие между SCS и SCS’ усиливает энхансер-блокирующую активность SCS’-инсулятора. Установлено, что на концах SCS- и SCS’-инсуляторов находятся промоторы, которые активны в эмбриональных S2-клетках. Несмотря на то, что энхансер-блокирующая
активность SCS-инсулятора была продемонстрирована в трансгенных линиях D.melanogaster, промоторы генов CG31211 и Cad87A, которые его фланкируют, практически не работают в глазах. Таким образом, активность промоторов не определяет функциональность инсуляторов. Впервые было показано в последовательности SCS-инсулятора наличие активных сигналов полиаденилирования, работающих как в S2-клетках, так и в глазных имагинальных дисках. Выявлено функциональное взаимодействие промоторов соседних генов yellow и CG3777. Результаты данной работы расширяют представление о регуляторных элементах с энхансер-блокирующими и промоторными свойствами и позволяют по-новому оценить функциональное значение инсуляторов и промоторов в геноме.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на XIX международной конференции «ЛОМОНОСОВ-2012» (Москва, 9-13 апреля, 2012).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы. Из них статей – 2, тезисов устных и стендовых сообщений – 1.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 70 страницах, включает 16 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 139 источников.
Доменная организация хроматина
Расположение хромосом в ядерном пространстве не случайно; эксперименты наглядно продемонстрировали, что в клетках высших эукариот генетический материал индивидуальных хромосом занимает определенные ограниченные в пространстве территории (Lanctot et el., 2007; Misteli, 2007; Rajapakse and Groudine, 2011). У низших эукариот (например, у дрожжей) хромосомные территории не имеют строгих пространственных координат в ядре, хромосомы самоорганизуются за счет теломер, взаимодействующих с ядерным матриксом, сближения центромер друг с другом и кластеризацией рибосомальных генов в нуклеолусе (Wong et el., 2012; Tjong et el., 2012; Zimmer and Fabre, 2011). В геноме мух и млекопитающих хромосомные территории локализованы на периферии ядра, где они находятся в тесном контакте с ядерной ламиной и белковыми компонентами ядерной оболочки (Guelen et el., 2008; Kind and van Steensel, 2010). Считается, что многие активно транскрибируемые ко-регулируемые гены часто собираются в так называемых «транскрипционных фабриках», в то время как неактивные участки генома локализуются в особых ядерных тельцах (Eskiw et el., 2010; Bantignies et el., 2011; Cheutin and Cavalli, 2012) (Рис. 1).
Поскольку каждая хромосома имеет свою собственную территорию, то возникает следующий вопрос, каким именно образом происходит организация этих хромосомных территорий, и, следовательно, расположенных в ней генов, в трехмерном ядерном пространстве: случайно или же имеется определенная закономерность в выборе координат (Misteli, 2007). Расположение хромосом и отдельных генных локусов сильно отличаются друг от друга в зависимости от типа клеток, более того они подвержены существенным перестановкам в процессе эмбрионального развития, старения, а также при появлении различных патологий (Sanyal et el., 2012). 1.2. Доменная организация хроматина
Структурная и функциональная организация хроматина не ограничивается хромосомными территориями. Обнаружение различных белков, связывающихся непосредственно с хроматином, а также детальное картирование модификаций гистонов и метилированных участков ДНК в самых разных типах клеток позволило более детально описать принципы организации хроматина в ядре. Было показано, что в пределах одной хромосомной территории хроматин укомплектован неоднородно и состоит из дискретных, с отличающимися профилями экспрессии генов, доменов (Ernst et el., 2011; Filion et el., 2010; Kharchenko et el., 2011; Liu et el., 2011; Schwartz et el., 2010; Dunham et el., 2012). Размер отдельного домена в зависимости от конкретного хромосомного участка, типа клеток и вида организма варьирует в пределах от 10 т.п.н. до 1 м.п.н.
Домены хроматина можно разделить на «открытые» и «молчащие», в первых гены транскрибируются и находятся в активном состоянии, а в других, напротив, активность генов полностью подавлена (Рис.2). «Молчащие» домены делятся на три типа: домены эухроматина, связанного с белками группы Polycomb, домены гетерохроматина, обогащенные репрессорным белком HP1, и участки хроматина, не обогащенные какими-либо специфическими факторами (Filion et el., 2010; Kharchenko et el., 2011; Schwartz et el., 2010).
Модель корреляции структуры и функции эукариотического генома. Транскрипционная активность различных районов генома определяет образование и сегрегацию активных (черный цвет) и неактивных (светло-серый цвет) хроматиновых доменов. Эти домены отличаются позициями нуклеосом на хроматиновой нити и модификациями гистонов. Активность «нейтральных» (темно-серый цвет) участков генома определяется взаимодействием этих участков с активным или неактивным хроматином, и эти дальние контакты способствуют изменению транскрипционного статуса домена, расположенного на другой хромосоме (белый цвет). Структурно-функциональные особенности хроматина являются наследственными и передаются от клетки к клетке в зависимости от типа ткани.
Можно выделить следующие основные элементы в «открытых доменах»: энхансеры, промоторы, активно транскрибируемые участки и участки хроматина, связывающиеся с инсуляторными белками (Dunham et el., 2012) (Рис.3). Это позволяет выдвинуть предположение, согласно которому хроматиновые домены способны предоставлять отдельным генам определенную степень свободы в регуляции своей активности. Вследствие этого, домены формируют вокруг транскрибируемых участков соответствующую для правильной экспрессии среду
Домены хроматина и регуляторные элементы. На рисунке схематично показаны взаимодействия между промоторами, сайленсерами, энхансерами и инсуляторами. Белыми эллипсами обозначены нуклеосомы, а темно-серыми овалами – белки сайленсинга (например, HP1 и Sir3). Сайленсерные элементы (С) являются сайтами инициации гетерохроматиновых областей, которые блокируют активность ближайшего промотора (П2) и останавливают транскрипцию. Инсулятор (И1) ограничивает распространение окружающего хроматина. Энхансер (Э1) расположен в открытом хроматиновом домене, связан с транскрипционном фактором (ТФ) и активирует промотор (П1). Энхансер (Э2) не способен функционально взаимодействовать с П1, поскольку между ним и промотором находится последовательность инсулятора (И2), блокирующего эти взаимодействия.
Моделирование трехмерной структуры геномов человека, мыши и мухи позволило вывести из полученных данных концепцию организации хроматиновых доменов. 3С- и FISH-анализы локальных ДНК-контактов продемонстрировали, что последовательности, принадлежащие одному и тому же геномному локусу, имеют свойство образовывать «топологические ассоциированные домены» (ТАД). Форма этих доменов, а также степень их компактизации и пространственного расположения сильно различаются в зависимости от типа ткани (Nora et el., 2012).
Протяженность ТАД варьирует от десяти до сотен т.п.н. у Drosophila и до одного м.п.н. у млекопитающих (De Graaf and van Steensel, 2013; Tanay and Cavalli, 2013; White, 2012). Основной отличительной чертой ТАД является наличие четких границ, часто соответствующих сайтам связывания для CTCF или других инсуляторных белков (Dixon et el., 2012; Hou et el., 2012; Sexton et el., 2012). Известно, что дополнительными факторами, участвующими в разделении доменов, являются пост-трансляционные модификации гистонов, такие как H3K9me2, H3K9me3 и H3K27me3 (Pauler et el., 2009; Wen et el., 2009; Hawkins et el., 2010). Однако искусственное нарушение активности ферментов, вносящих данные модификации в гистоны, и изменение структуры хроматина во время клеточной дифференцировки не влияют на расположение ТАД на хромосоме (Nora et el., 2012). Если ТАД имеют сходную транскрипционную активность, то такие домены часто кластеризуются друг с другом, формируя хромосомные территории.
Барьерные инсуляторы и промоторы
Методы генетической инженерии Рестрикцию ДНК, тупление «липких» концов, дефосфорилирование и лигирование фрагментов ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook et al. 1989) с использованием реактивов фирмы Fermentas и предлагаемых этой фирмой протоколов.
Выделение фрагментов ДНК из геля и определение концентрации Продукты рестрикции ДНК разделяли методом горизонтального гель-электрофореза, вырезали из агарозного геля с помощью ультрафиолетовой лампы (=360нм) участок, содержащий интересующий нас фрагмент ДНК, и переносили в эппендорфы. Далее использовался набор очистки плазмидной ДНК фирмы Zymoresearch. Следуя инструкции производителя к агарозному гелю добавляли необходимое количество соответствующего буфера и инкубировали на 55С до полного растворения агарозы ( 15`). Затем раствор переносили на колонку, центрифугировали 30`` при 12000 rpm и промывали спиртом. Фрагменты ДНК смывали 50 мкл mQ (3` при 12000 rpm).
Концентрацию выделенной или очищенной ДНК определяли либо спектрофотометрическим методом при =260 нм, либо по силе флуоресценции комплекса бромистого этидия с ДНК в ультрафиолете (=254нм) на агарозном геле, сравнивая исследуемые образцы с образцами известной концентрации.
Выделение плазмидной ДНК из большого объема (Maxiprep) Одну колонию помещали в 50 ml среды LB с ампицилином (Tryptone 1%, yeast extract 0,5%, NaCl 1%, Ампициллин 50 mg/l) и инкубировали 12 часов (до заметного помутнения раствора) при интенсивном перемешивании на качалке при 37С. После достижения оптимальной плотности клетки переливали в фалькон и центрифугировали на 4750 rpm 10 . Осадок растворяли в 4 мл буфера S1 (Tris-HCl 0,05M, EDTA 0,01M), тщательно перемешивали на Vortex и выдерживали 2 при комнатной температуре. Затем добавляли 4 мл буфера S2 (NaOH 0,2M, SDS 1%), и проинкубировав 2 при -20С, добавляли 4 мл холодного AcK (3M, pH 5,2). Полученную «творожную» смесь плавно перемешали и оставили инкубироваться 15 на -20С. После центрифугирования на 4750 rpm 20 , супернатант перенесли в свежий фалькон, добавили 10 мл изопропанола, тщательно перемешали и инкубировали 10 . Отцентрифугировав 20 на 4750 rpm и выкинув супернатант, осадок просушили и растворили в 1 мл AcNH4 (2M, pH 7,4). Проинкубировав в течение 10 на холоде, отцентрифугировали на 13200 rpm 5 -6 . Супернатант перенесли в свежий эппендорф, добавили 700 мкл изопропанола и вновь инкубировали 10 . После очередного центрифугирования на 13200 rpm 10 , супернатант отбросили, а осадок промыли 100-200 мкл C2H5OH 70%. Предварительно подсушив, осадок растворяли в нужном объеме H2O mQ.
Выделение плазмидной ДНК из меньшого объема (Miniprep) Одну колонию перенесли в 5 мл среды LB с ампицилином в стеклянные пробирки. Клетки наращивали 12-18 часов (до заметного помутнения раствора) на качалке при 37С. Далее среду с бактериями перенесли в эппендорф и отцентрифугировали на 13200 rpm в течение 5 . Слив супернатант, осадок сначала растворили в 200 мкл буфера S1 (Vortex, инкубация 2 при комнатной температуре), затем добавили 200 мкл буфера S2 (инкубация 2 -4 на льду) и 400 мкл AcNH4 7,5M (10 -15 на -20С). Отцентрифугировав смесь 10 на 13200 rpm, супернатант перенесли в 400 мкл изопропанола, предварительно охлажденного на -20С. Пробирки проинкубировали 10 , центрифугировали на 13200 rpm 15 . Осадок промыли в 100 мкл C2H5OH 70%, высушили и растворили в необходимом объеме H2O mQ.
Выделение геномной ДНК из Drosophila melanogaster Мух (0,1-0,12г) растирали пестиком в рабочем буфере А (Tris-HCl 0,1М, pH 9,0; ЭДТА 0,1M, pH 8,0; SDS 1% и DEPC 1%). Смесь выдерживали 30` при 70С, затем добавляли раствор AcK 8М (объем должен был составить 1/7 от объема буфера А), перемешивали и ставили на 30` в ледяную баню. После чего смесь центрифугировали, отбирали водную фазу, затем ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом. Экстрагированную ДНК осаждали добавлением 0,6 объема изопропанолового спирта, промывали 70% этанолом и растворяли в необходимом количестве mQ. В некоторых случаях для получения особо чистой ДНК пробы обрабатывали РНКазой А с последующей очисткой фенолом, фенол-хлороформом и хлороформом. Горизонтальный гель-электрофорез
Для гель-электрофореза использовали 1% агарозный электродный буфер ТАЕ (Tris-base 0,04М, EDTA ImM, СНзСООН 0,0 ЇМ) с бромистым этидием (итоговая концентрация 0,2 нг/мл). Пробу наносили на гель с соответствующим буфером (бромфеноловый синий 0,25%, ксиленцианол 0,25%, ЭДТА (pH 8,0) 10mM, глицерол 50%) в отношении 5:1. В качестве маркера использовали GeneRuler lkb DNA Ladder Mix #SM0331 (Fermentas) или ДНК фага , порезанную по сайтам для эндонуклеазы Pstl. Электрофорез проводили на 90-180 V, Ю -120 .
Спиртовое переосаждение ДНК ДНК разводили в mQ до необходимого объема. Затем к раствору добавляли 2.5 объема охлажденного С2Н5ОН 96% и 1/10 объема 3М AcNa. Сильно перемешав, охлаждали 20 на -70С и центрифугировали на 13200 rpm 20 (желательно с охлаждением). Осадок промывали 70% С2Н5ОН, высушивали и растворяли в необходимом объеме Н20 mQ или 1ХТЕ (10 тМ Tris-HCl, 0,1 тМ ЭДТА (рН 8,0)).
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР)
Для получения амплифицированных фрагментов ДНК мы использовали метод ПЦР на матрице геномной ДНК Drosophila melanogaster (Saiki et al., 1985; Mullis and Faloona, 1987) или плазмидной ДНК.
Приготовление реакционной смеси: 10-30 нг ДНК, 10Х ThermoBuffer (ЮОтМ Трис-НСІ (рН 8,8 при 25С), 500mM КС1, 0,8% Nonident Р40), 2.5тМ MgCb (рабочая концентрация (1-4)mM), 0.2тМ dNTP (2тМ), по 1 мкл праймеров (5рто1/l), 0.2-0.5 мкл Taq ДНК-полимеразы (2.5 ед/мкл) и необходимое количество mQ Н20.
Обнаружение функционаьного сигнала полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора
Тестирование промоторов генов (а) CG31211 и (б) Cad87A в глазах. SCSA соответствует фрагменту SCS (516 п.н.), включающему промотор гена CG31211. SCSB соответствует фрагменту SCS (477 п.н.), содержащему промотор гена Cad87A. Серая звезда является четырьмя сайтами связывания для GAL4-активатора. «+GAL4» обозначает индукцию экспрессии white GAL4-активатором. Гены white и yellow показаны белым и черным прямоугольниками, соответственно. Черная горизонтальная стрелка указывает на направление транскрипции с промотора yellow. Знак означает, что промотор white был предварительно удален из конструкции. SCS-инсулятор показан небольшим белым прямоугольником. Вертикальные черные стрелки, направленные вниз, являются сайтами узнавания для рекомбиназ FLP (frt) и CRE (lox). N показывает количество линий, где мухи приобретали новый фенотип после удаления () соответствующих последовательностей ДНК, а Т обозначает общее количество линий, участвующих в эксперименте. Далее, мы проанализировали трансгенные линии, содержащие фрагмент SCSB. Во всех полученных линиях исследуемые мухи имели пигментированные глаза, что подтверждает способность промотора Cad87A запускать транскрипцию гена mini-white (Рис. 13б). Делеция энхансера глаз приводила к уменьшению степени пигментации глаз в большинстве анализируемых линий. Возможно, этот эффект можно объяснить слабой стимуляцией промотора Cad87A энхансером глаз. При этом ни GAL4-активатор, ни энхансер глаз не способны эффективно стимулировать транскрипцию гена white, лишенного своего промотора.
Часть II: Дистальное взаимодействие промоторов CG3777 и yellow В последние годы появляется все больше данных, согласно которым промоторы генов, обладающих сходным профилем экспрессии, могут взаимодействовать. Однако функциональная роль таких взаимодействий остается неизвестной. В данной работе было изучено функциональное взаимодействие между промоторами ко экспрессирующихся генов yellow и CG3777.
Ген yellow D. melanogaster определяет пигментацию личинок и имаго. Максимальный уровень экспрессии гена yellow детектируется на поздней эмбриональной, ранней личиночной и средней куколочной стадиях. Исследование супернестабильных мутаций в гене yellow позволило ранее продемонстрировать, что промотор соседнего гена CG3777 может стимулировать yellow в щетинках, когда находится от него на расстоянии 35 т.п.н. (Pomerantseva et el. 2006). Кроме этого, на модели в трансгенных линиях было показано, что промотор CG3777 способен функционировать в качестве инсулятора, блокируя активацию yellow энхансерами, стимулирующими экспрессию гена в теле и крыльях.
Промоторы генов CG3777 и yellow функционально взаимодействуют друг с другом Для исследования способности промоторов генов yellow и CG3777 функционально взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях использовалась неспособность GAL4-активатора стимулировать транскрипцию с промотора yellow в том случае, если его сайты связывания находятся за 3 -концом гена (Erokhin et el. 2011). Опираясь на этот факт, промотор CG3777, фланкированный frt 53 сайтами для сайт-специфической рекомбиназы FLP, был встроен в двух противоположных ориентациях за десятью сайтами связывания для GAL4-активатора (Рис. 14).
Рисунок 14. Тестирование характера взаимодействия между промоторами генов CG3777 и yellow. Промотор гена CG3777 обозначен белым квадратом «Pr». Черные стрелки указывают на направление промоторов генов yellow и CG3777. Черные маленькие прямоугольники на концах конструкций являются последовательностями Р-элемента. Вертикальные черные стрелки являются сайтами узнавания для рекомбиназы FLP (frt). Знак указывает на делецию промотора CG3777. «+GAL4» означает индукцию GAL4-активатором. N показывает количество линий, где мухи приобретали новый фенотип после удаления () промотора гена CG37777, а Т обозначает общее количество линий.
В результате трансформации конструкции, в которой промоторы генов yellow и CG3777 были сонаправленны друг другу, в эмбрионы Drosophila было получено 10 трансгенных линий (Рис. 14а). Во всех линиях мухи имели желтые тело и крылья, а также окрашенные щетинки, что связано с наличием в конструкции только одного энхансера, активирующего экспрессию гена yellow в щетинках (Geyer et el. 1987). Индукция GAL4-активатором привела к значительному увеличению уровня пигментации крыльев (до 4–5 баллов) и тела (до 3 баллов). При удалении промотора СG3777 GAL4-активатор переставал стимулировать промотор yellow. Полученные данные демонстрируют способность GAL4-активатора стимулировать промотор гена yellow только в присутствии промотора CG3777.
В случае расположения промотора CG3777 в обратном направлении относительно промотора yellow наблюдался противоположный эффект (Рис. 14б): GAL4 не стимулировал промотор гена yellow ни в исходных, ни в производных трансгенных линиях, где промотор СG3777 был делетирован.
Согласно полученным данным промоторы генов СG3777 и yellow способны функционально взаимодействовать друг с другом и наблюдаемый эффект взаимодействия зависит от взаимной ориентации данных промоторов друг относительно друга.
Результат взаимодействия между промоторами генов CG3777 и yellow зависит от их взаимного расположения
В геноме Drosophila промоторы CG3777 и yellow сонаправленны и находятся на расстоянии порядка 80 т.п.н. друг от друга (Рис. 15). Схема расположения генов CG3777 и yellow в геноме D. melanogaster. Для более точного воспроизведения нативной конфигурации промоторов этих генов в геноме, была создана конструкция (Рис. 16а), в которой промоторы CG3777 и yellow располагались сонаправленно относительно друг друга. При этом десять сайтов GAL4 были встроены выше промотора CG3777, под контроль которого размещали ген mini-white, а за ним был встроен полный ген yellow. Между 3 -концом гена mini-white и энхансерами тела и крыльев гена yellow, был встроен SV40-терминатор. Этот шаг был осуществлен для обеспечения эффективной терминации транскрипции гена mini white, чтобы исключить возможное влияние транскрипции на активность энхансеров.
Как и в предыдущем эксперименте, промотор СG3777 был фланкирован frt-сайтами. Для выяснения позитивного/негативного влияния промотора CG3777 на экспрессию yellow был использован укороченный вариант энхансера, определяющий полноценную экспрессию гена yellow в крыльях и очень слабую – в теле. В результате было получено девять трансгенных линий, содержащих единичную копию конструкции. Полученные трансгенные линии имели пигментацию глаз в диапазоне от светло-желтых до оранжевых, а стимуляция GAL4-активатором приводила к усилению экспрессии гена mini-white в глазах. Делеция промотора СG3777 приводила к фенотипу «белые глаза», подтверждая способность промотора CG3777 запускать транскрипцию гена mini-white в глазах. Большая часть трансгенных линий имела слабый уровень пигментации в теле и нормальный уровень пигментации в крыльях, экспрессия в которых находилась под контролем полноценного энхансера (данные не приведены). Введение GAL4-активатора никак не повлияло на пигментацию тела и крыльев (Рис. 16а).
Возможно, отсутствие эффекта функционального взаимодействия между промоторами генов yellow и CG3777 объясняется эффективным взаимодействием промотора гена yellow с энхансерами, в результате взаимодействие между промоторами оказывается заблокированным. Для проверки этой гипотезы энхансеры тела и крыльев были удалены из конструкции (Рис. 16б). В результате промоторы CG3777 и yellow оказались разделены только кодирующей частью гена mini-white длиной в 6 т.п.н.
Функциональные взаимодействия промоторов yellow и CG3777
В настоящей работе было использовано свойство GAL4-активатора стимулировать промотор гена yellow только в том случае, если сайты связывания для GAL4-активатора находятся не далее 1 т.п.н. от промотора гена. Например, GAL4 не способен стимулировать ген yellow, если сайты для его связывания находятся с 3 -стороны гена (Erokhin et el. 2011). В результате, если два элемента, окружающие ген, способны функционально взаимодействовать друг с другом, то происходит сближение GAL4-активатора с транскрипционным комплексом, собранным на промоторе на расстоянии 5 т.п.н. от GAL4-сайтов, и, как следствие, стимуляция транскрипции. Таким образом, полученные с использованием данной модельной системы результаты предполагают наличие взаимодействия между промоторами генов yellow и CG3777.
При этом изменение расположения промоторов друг относительно друга приводит к исчезновению эффекта функционального взаимодействия в используемой нами модельной системе. Таким образом, можно сделать вывод, что промоторы генов CG3777 и yellow способны функционально взаимодействовать друг с другом на больших расстояниях, и данный эффект носит ориентационно-зависимый характер.
В геноме D. melanogaster гены CG3777 и yellow соседствуют друг с другом и имеют сходный профиль экспрессии. Нами была создана модельная система, приближенная к геномному относительному расположению промоторов этих генов у D. melanogaster. Однако в данном случае нам не удалось детектировать эффект функционального взаимодействия. Возможно, промотор CG3777 в определенном контексте способен функционировать в качестве инсулятора, блокируя активацию yellow энхансерами. Стоит отметить, что инсуляторная активность была недавно продемонстрирована для ряда промоторов D. melanogaster. Инсуляторными свойствами, например, обладают промоторы генов Abd-B, Ubx, Antp (Chopra et el.2009). Кроме того, в ряде работ было показано, что ряд инсуляторных белков дрозофилы, CP190, dCTCF, Mod(mdg4) и BEAF32, часто ассоциируются с областями промоторов различных генов (Smith et el. 2009, Bartkuhn et el. 2009, Jiang et el. 2009, Bushey et el. 2009, Nиgre et el. 2010).
Поэтому вероятным объяснением полученных результатов является предположение, согласно которому промоторы генов CG3777 и yellow в используемых нами трансгенных системах всегда функционально взаимодействуют друг с другом, однако в одних случаях эффект данного взаимодействия выражается в стимуляции транскрипции гена yellow, а в других – в блокировании энхансеров. Перемещение сайтов связывания GAL4-активатора в нашей модельной системе за 3 -конец гена mini-white привело к неожиданным результатам: при введении GAL4-активатора происходила сильная активация транскрипции гена mini-white, управляемого промотором CG3777, в то время как yellow транскрибировался крайне слабо. Удаление же промотора CG3777 приводило к значительному усилению уровня экспрессии гена yellow. Вероятным объяснением данных результатов является модель, по которой в результате взаимодействия между изучаемыми промоторами формируется петля определенной конфигурации, в которой GAL4-активатор оказывается приближен к промотору CG3777, что приводит к его активации. Одновременно происходит частичная инактивация промотора гена yellow. Возможно, последовательность промотора CG3777 является более предпочтительной для взаимодействия с GAL4-активатором по сравнению с последовательностью промотора yellow, однако экспериментальных данных, подтверждающих эту гипотезу, пока нет.
Таким образом, полученные данные демонстрируют, что взаимное расположение взаимодействующих промоторов друг относительно друга играет важную роль в процессе проявления результирующего эффекта. Выяснение молекулярного механизма данного явления межпромоторных взаимодействий требует проведения дополнительных исследований. ВЫВОДЫ 5. Продемонстрировано, что SCS-инсулятор усиливает способность SCS -инсулятора блокировать энхансеры в трансгенных линиях дрозофилы. Таким образом, впервые показано наличие функционального взаимодействия между SCS- и SCS -инсуляторами. 6. Показано, что инсуляторы SCS и SCS на концах своих последовательностей содержат функциональные промоторы, активно работающие в эмбриональных S2-клетках, но не в глазных имагинальных дисках трансгенных линий дрозофилы. Таким образом, активные промоторы не играют ключевой роли в реализации активности SCS- и SCS -инсуляторов. 7. Впервые найдены функциональные сигналы полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора. 8. Продемонстрировано наличие функционального взаимодействия между промоторами ко-экспрессирующихся генов yellow и CG3777 в трансгенных линиях дрозофилы. Впервые показано, что результат функционального взаимодействия (активация или репрессия транскрипции) зависит от взаимной ориентации взаимодействующих промоторов.
