Исследование структурных хромосомных и внехромосомных копий мобильных диспергированных генов дрозофилы Любомирская Наталия Вениаминовна

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Любомирская Наталия Вениаминовна. Исследование структурных хромосомных и внехромосомных копий мобильных диспергированных генов дрозофилы : ил РГБ ОД 61:85-3/559

Содержание к диссертации

Введение

1 Повторяющиеся гены и мобильные элементы генома в. melanogasier 10

1. Общая характеристика генома дрозофиш 10

2. Множественные сгруппированные гены 12

1. Гены рибосомной I8S и 28S РНК 12

2. Гены рибосомной 5S РНК 13

3. Гистоновые гены 13

4. Гены тРНК 15

3. Мобильные диспергированные гены 16

1. Общая характеристика структуры и организация в геноме дрозофилы 17

2. Транскрипция ЩГ 22

3. Тонкая структура ДКП и прилежащих к ним участков 25

4. Другие подвижные генетические элементы дрозофиш 30

1. Семейство FB-элементов 30

2. Р-фактор и гибридный дисгенезис 33

3. Перемежающиеся повторы 34

5. Щг в других организмах. Сходство вдг с прорегровиру- сами млекопитащих и птиц 35

6. Возможные механизш перемещения щг 39

7. Возможная роль щг 42

8. Материалы и методы 45

1. Ферменты, меченые предшественники, реактивы и материалы 45

2. Клетки и среды 46

3. Получение ДНК 47

4. Обработка ДНК энзимами и энзиматические методы мечения ДНК 50

5. Фракционирование ДНК 51

6. Получение РНК 53

7. Фракционирование РНК 54

8. Гибридизационные процедуры 55

9. Структурная организация мобильного диспергированного гена щг4 57

1. Рестриктное картирование и определение числа копий ОДДТ4 в геноме дрозофилы 57

2. Организация ЩГ4 в геноме дрозофилы 60

3. Организация МДГ4 в различных типах клеток D. melanogaster 63

4. Амплификация ЩГ4 в культуре клеток дрозофилы 66

5. Транскрипция ВДГ4 72

10. Структура бнехромосомных копий щг 74

1. Обнаружение экстрахромосомных сверхспирализован-ных кольцевых молекул ДНК дрозофилы, соответствующих ВДП, ЩГЗ, ВДГ4 и copia 74

2. Структурная организация кольцевых молекул ДНК, соответствующих МДГІ 79

3. Структурная организация кольцевых молекул ДНК, соответствующих ВДГ copia 81

4. Структурная организация кольцевых молекул ДНК, соответствующих ВДГЗ 85

11. Обсуждение 92

1. Особенности структурной организации МДГ4 92

2. Кольцевая сверхспирализованная ДНК дрозофилы 97

3. Обнаружение и характеристика кольцевых молекул ДНК различных МДГ 98

4. Возможные механизмы образования кольцевых молекул ДНК МЖ 99

Вывода 102

Гены рибосомной 5S РНК
Р-фактор и гибридный дисгенезис
Организация ЩГ4 в геноме дрозофилы
Кольцевая сверхспирализованная ДНК дрозофилы

Введение к работе

Одной из центральных проблем молекулярной биологии является проблема структурной организации генома эукариот. Уже первые работы по общей характеристике ДНК высших организмов с использованием анализа кинетики реассоциации ДНК выявили, что характерной особенностью эукариотического генома является наличие ДНК, повторенной 100-1000 раз /25,26/, которая составляет от 10 до 60% всей ДНК многоклеточных организмов. С помощью гибридизационных экспериментов было показано, что умеренно повторяющиеся ДНК транскрибируются ж эти транскрипты выполняют как структурные (рРНК), так и матричные функции /38/. Однако, эти гибридизационные эксперименты не позволили определить функцию большинства умеренных повторов, поэтому исследователи начали активно изучать организацию этих последовательностей в геномах различных организмов /38/. Детальный анализ кинетики реассоциации ДНК из многих видов эукариот показал, что существует два основных принципа организации умеренно повторяющихся последовательностей ДНК. Первый заключается в том, что сравнительно короткие (в среднем 0,3 тпн) повторяющиеся последовательности соседствуют с неповторяющимися, имеющими размер около 1,5 тпн. Такой тип организации преобладает у большинства изученных видов эукариот, и на основе этого возник целый ряд гипотез, приписывающих умеренным повторам регуляторные функции /38/. Другой принцип, по которому организована меньшая часть ДНК большинства высших организмов, заключается в том, что более длинные (в среднем 5-6 тпн) умеренно повторяющиеся сегменты ДНК чередуются с длинными неповторяющимися участками. В некоторых видах

эукариот, в том числе и у D. melanogaster /93,37/ таким образом

организована большая часть геномной ДНК.

Очевидно, что эксперименты по изучению кинетики реассоциации тотальной геномной ДНК не могли дать точных сведений об организации умеренных повторов в геноме эукариот, так как они позволяют выявить только общую картину.

Большой успех в исследования структурной организации генома эукариот пришел с развитием методов генной инженерии, молекулярной биологии и молекулярной генетики. В 1978 году независимо в лабораториях Хогнесса /52/ и Георгиева /69/, в ходе экспериментов по отбору среди клонированных фрагментов ДНК D. melanogaster, активно транскрибирующихся в культуре клеток, был открыт новый тип генов - мобильные диспергированные гены (МДГ). В настоящее время считается /147/, что большую часть умеренных повторов дрозофилы составляют именно такие гены - множественные, рассеянные по хромосомам с нестабильной локализацией.

В настоящее время хорошо изучены 7 семейств МДГ: МДГС /69, 18,16,8,9,13,84/, ВДГЗ /69,18,16,8,9,19/, copia /52,127,45,88, 103/, 412 (ЩГ2) /52,127,45,103,145/, 297 /52,127,45,103,68/, BI04 /116/ и 17.6 /83/. В данной работе представлены результаты по структурной организации, организации в геноме и транскрипции еще одного семейства МДГ - ЩГ4 (" gypsy "). Показано, что МДГ4 обладает всеми свойствами, присущими ранее описанным ЩГ: множественность, рассеянность по геному, варьирующая локализация на хромосомах, эффективная транскрипция, амплификация в культуре клеток. Наряду с этим выявился ряд интересных особенных свойств МДГ4. Продемонстрировано, что наряду с полноразмерными копиями ВДГ4, соответствующими тем, которые проклонированы нами, в геноме дрозофилы имеются последовательности, гомологичные тем или иным

участкам ВДГ4. Возможно это усеченные или сильно дивергировавшие копии МДГ4.

Кроме того показано, что существует два варианта полноразмерных копий МДТ4, причем структурные различия их незначительны, в то время как по своим свойствам они сильно различаются. Показано, что только один вариант амплифицируется в культуре клеток, и мы предполагаем, что только этот вариант МДГ4 способен перемещаться.

Изучение ВДГ4 в нашей группе развивалось как комплексное исследование, в настоящее время определена первичная структура ДКП и прилежащих к ним участков для нескольких копий МДП /153/ и продемонстрировано сходство их тонкой структуры с ДКП других ОДДГ и проретровирусов позвоночных. В ходе этой работы было показано, что рядом с ДКП имеются участки гомологии с тРНК и полипуриновый блок.

Значительное сходство ВДГ и проретровирусов не может быть случайным, и поэтому высказываются предположения о том, что они имеют общую природу /53,135,51/. Как известно, проретровирусная ДНК обнаруживается в клетках хозяина не только в составе хромосомной ДНК, но также в виде самостоятельных кольцевых сверхспирали-зованных молекул. В связи с этим нам представлялось интересным выяснить, могут ли ВДГ также существовать в виде экстрахромосомных кольцевых молекул. К моменту начала данной работы Флавелл и Иш-Хоровщ показали, что ВДГ copia обнаруживается в составе кольцевой экстрахромосомной ДНК в культуре клеток D. melanogaster линии Кс /54,55/, однако, оставалось неясным является ли этот МДГ исключением, или образование кольцевых ДНК свойственно и другим МДГ.

Вторая часть нашей работы посвящена обнаружению и изучению

организации различных МДГ в составе экстрахромосомных кольцевых ДНК двух линий (67J 25D И Кс) культуры клеток D. melanogaster. Показано, что МДГІ, МДГЗ и copia обнаруживаются в виде кольцевых молекул ДНК в обеих линиях. Кольцевые молекулы ДНК МДІ4 были детектированы только в линии 67J 25 D . Исследована общая структура кольцевых молекул этих МДГ, показано, что в основном кольцевые молекулы ДНК этих МДГ содержат только по одному ДКП, кольцевые молекулы ДНК МДГ соріа в линии Кс могут быть как с одним, так и с двумя ДКП, что согласуется с результатами, полученными Флавеллом и Иш-Хоровицем /54,55/.

Кроме того мы обнаружили, что помимо полноразмерных кольцевых молекул ДНК гена соріа в линии 67J 25D имеются также молекулы, содержащие делецию размером примерно 0,4 тпн, причем такие делетированные копии существуют также и в хромосомной ДНК этой линии культуры клеток.

Нами также продемонстрировано, что в линии 67J 25D выявляются только полноразмерные кольцевые молекулы ДНК МДГЗ с одним ДКП, а в линии Кс - только укороченные молекулы, содержащие I ДКП и делецию размером около 1,3 тпн. Показано -также, что такие делетированные варианты МДГЗ существуют в хромосомных ДНК мух и обеих линий культуры клеток D. melanogaster , однако, в то время как в линии 67 J 25 D амплифицируются только полноразмерные копии МДГЗ, в линии Кс происходит увеличение числа только делегированных копий этого МДГ.

В работе обсуждаются возможные механизмы образования таких кольцевых молекул ДНК ЩГ, которые, вероятно, являются промежуточным звеном в процессе перемещения ВДГ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ГЕНЫ И МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНОМА D. MELANOGAS0IER I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОМА ДРОЗОФИЛЫ

Вце в конце 60-х годов Бриттен и Дэвидсон /25,26/ при изучении кинетики реассоциации ДНК, выделенной из различных организмов, обнаружили, что в отличие от прокариотической ДНК, которая ведет себя как единый ренатурационный комплекс, ДНК эукариот ведет себя как сложная система, состоящая как бы из трех компонентов: сильно повторяющейся (^10 раз), умеренно повторяющейся (^10-10 раз) и уникальной ДНК. В дальнейшем при исследовании чередования повторяющихся и уникальных последовательностей в ДНК были выделены два типа организации генома эукариот /93/.

Первый тип характеризуется чередованием сравнительно коротких (~300 пн) умеренно повторяющихся последовательностей с уникальными последовательностями длиной ^1200 пн. Такой тип организации генома был выявлен у ксенопуса, морского ежа и получил название ксенопус-типа /37-39/.

Второй тип организации генома эукариот представляет собой чередование умеренно повторяющихся последовательностей длиной ^6000 пн с уникальными последовательностями размером ^13000 пн. Такой тип организации генома был впервые обнаружен у D. melanogas-ter, и получил название дрозофила-типа /93,37,36,137/.

Эксперименты по кинетике реассоциации выявили также, что геном дрозофилы, размер которого составляет 1,6*10 тпн /85/, на 7($ состоит из уникальных последовательностей ДНК, ~12% составляют умеренные повторы и ^12$ - сильные повторы. Умеренные повто-

- II -

ры, как показывают расчеты, представлены л^40 семействами, повторяющимися в геноме л/70 раз /2,15,7,121/.

Уникальные последовательности представлены в геноме одной или несколькими копиями, и часть этих последовательностей представляет собой структурные гены, то есть такие гены, с которых считы-вается м-РНК, которая в свою очередь направляет синтез белка.

Высокоповторяющиеся последовательности называют также сател-литной ДЕК, так как во многих случаях она отличается по нуклеотид-ному составу и может быть легко отделена центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Сателлитная ДВК у дрозофилы составляет около 15$ гаплоидного генома, причем Ь% ДТЖ приходится на простые сателлиты, структура которых представляет собой пентануклеотид, тандемно повторенный множество раз. Имеются также сложные сателлиты, в которых в качестве тандемно повторяющегося мономера выступает более длинная последовательность (^400 пн), которая в свою очередь является тандешым повтором пентануклеоти-да с некоторыми вариациями /27,28,130/. Сателлитная ДНК не транскрибируется, локализована в основном, в прицентромерных и тело-мерных участках гетерохроматина. Мутации, затрагивающие сателлит-ную ДНК, приводят к нарушению мейоза, поэтому предполагается, что она играет чисто структурную роль.

Последовательности ДНК, относящиеся к фракции умеренных повторов, по крайней мере в большей части, активно транскрибируются в клетках дрозофилы. По своей организации в геноме умеренно повторяющиеся гены можно разделить на два класса: множественные сгруппированные (тандемно повторяющиеся) гены и рассеянные по геному. К первому классу относятся гены рибосомальной РНК и гис-тоновые гены. С определенной долей условности сюда можно отнести

и гены тРНК. Ко второму классу относятся активно изучаемые в настоящее время мобильные диспергированные гены. Для многих генов данное разделение достаточно условно: функционально сходные гены могут быть в некоторых случаях представлены как в виде кластеров, так и в виде единичных рассеянных по геному последовательностей.

П. МНОЖЕСТВЕННЫЕ СГРУППИРОВАННЫЕ ГЕНЫ

I. Гены рибосомной I8S и 26S РНК

Комплекс генов рибосомальных РНК у D. meianogaster находится в двух ядрышковых организаторах,по одному в X и У хромосомах /108/, и представляет собой тандемный повтор, в котором одна последовательность повторена ^300 раз. Повторяющаяся единица состоит из транскриптона и нетранскрибируемого спейсера или просто спейсера. В состав транскриптона входят последовательности, кодирующие I8S рРНК, 5,8s рРНК, 2S рРНК и 26s рРНК. Все эти после-. довательности разделены между собой транскрибируемыми спейсерами. Транскрибируемый спейсер находится также перед геном I8S рРНК /92,91,50/. Примерно половина генов рРНК внутри последовательности, кодирующей 26S рРНК, имеет вставку размером от 0,5 до 6 тпн, причем гены со вставкой, по-видимому, не транскрибируются /66, 143,74/. Транскрипция рибосомных генов осуществляется РНК-полиме-разой I, при этом образуется единый предшественник рРНК, из которого затем вырезаются спейсерные участки, деградирующие в ядре, а зрелая рРНК транспортируется в цитоплазму /50,75/.

Организация рибосомных спейсеров напоминает сателлитную ДНК, состоящую из простых повторов. Помимо повторяющихся последовательностей, спейсеры содержат также уникальные, или же повторяющиеся

- ІЗ -

малое число раз участки ДНК. Инициация транскрипции осуществляется именно внутри нетранскрибируемого спейсера /19,50/.

2. Гены рибосомной 5S РНК

Хотя 5S рРНК связана с рибосомами, ее гены локализованы отдельно от генов других рРНК и представлены одним семейством клас-терированных генов, состоящим из 160 повторяющихся единиц. Кавдая повторяющаяся единица включает в себя 135 транскрибирующихся нук-леотидов и примерно 240 нуклеотидов образуют нетранскрибируемый спейсер. Значительная часть спейсера, подобно другим рибосомаль-ным генам, представлена простыми повторами. Вариации в длине спейсера объясняются наличием гептануклеотида, повторенного варьирующее число раз ( 4-7 ), на левом конце спейсера сразу после участка терминации транскрипции /50,131,139/. Гены 5S рРНК транскрибируются РНК-полимеразой III, причем образующийся продукт всего на 13 3»-концевых нуклеотидов длиннее зрелой 5S рРНК. Исследование роли отдельных участков генов 5S рРНК в направлении синтеза РНК в бесклеточной системе или в овоцитах позволило определить промотор для РНК-полимеразы III и оказалось, что он расположен внутри гена на расстоянии ^50 нуклеотидов от его 5*-конца /71/.

3. Гистоновые гены

которых локализован между HI и НЗ. Всего на гаплоидный геном дрозофилы приходится около 100 повторяющихся единиц гистоновых генов /77/. Имеется два типа гистоновых повторов длиной 4750 пн и 5000 пн. Меньший отличается от большего только тем, что в нем отсутствует 250 нуіслеотидов в спейсере между НІ и НЗ. Изредка гистоновые кластеры прерываются негистоновыми последовательностями. Было обнаружено две вставки, в одном случае длиной 13,5 тпн, которая располагалась между генами гистонов Н2В и НІ; в другом -длиной 7 тпн, и локализовалась она между генами гистонов НЗ и Н4. Обе вставки не имели гомологии между собой, содержали повторяющиеся последовательности, и их можно было наблюдать при гибридизации in situ во многих местах на политенных хромосомах /90/. Природа этих вставок не известна, возможно они представляют собой мобильные диспергированные гены.

Транскрипция гистоновых генов, подобно другим генам, кодирующим белки, осуществляется РНК-полимеразой II. Хотя вопрос о первичных продуктах: еще не решен, наиболее вероятно, что гистоновые гены транскрибируются независимо друг от друга, и размеры первичных продуктов для гистонов равны или немного превышают зрелую гистоновую мРНК. Интересным является тот факт, что мРНК гистонов HI, НЗ и Н2А считываются с одной цепи ДНК, а мРНК гистонов Н4 и Н2В - с другой цепи /90/.

Итак, можно видеть, что множественные сгруппированные гены имеют ряд общих характерных свойств. Это гены особо важных структурных компонентов клетки, возможно этим объясняется значительная повторяемость и эволюционная консервативность этих генов. Размеры первичных транскриптов либо равны, либо не на много, не более чем в 2 раза, превышают размеры зрелой РНК. Кроме того, характерным

свойством всех этих генов является то, что они окружены спейсерны-ми последовательностями, возможная роль .которых связана с регуляцией транскрипции. Наличие простых повторяющихся последовательностей указывает на вероятную роль спейсеров в процессах рекомбинации, ведущей к дупликации или делеции множественных генов, поддерживая их однородность.

4. Гены тРНК

В виде кластеров организованы у дрозофилы и гены тРНК. Гаплоидный геном D.melanogaster содержит ^00 генов тРНК /142/. Из анализа кинетики гибридизации тРНК с ДНК следует, что тРНК представлена ^60 разными семействами, каждое из которых состоит в среднем из 10 одинаковых генов. С помощью методов гибридизации in situ было показано, что индивидуальные тРНК гибридизуются по меньшей мере, с 30 участками хромосом, и что гены многих семейств сгруппированы /44/. Более детальное исследование одного из таких участков с использованием методов клонирования выявило, что в нем сгрушшровано 8 генов аспарагиновой тРНК, 4 гена аргинино-вой, 5 - лизиновой и I ген изолейциновой тРНК. Гены разделены спейсерами разной длины. Транскрипция не имела единой направлен-

ности и осуществлялась с разных цепей /146/. Таким образом, определенной регулярности в организации генов тРНК, подобной организации рибосомных генов, не существует.

III. МОБИЛЬНЫЕ ДИСПЕРГИРОВАННЫЕ ГЕНЫ

Более 30 лет назад Б.Мак-Клинток с помощью генетических экспериментов показала, что в кукурузе имеются подвижные генетические элементы /94,95/. Позднее у дрозофилы также были обнаружены подвижные генетические элементы. Один такой описанный элемент -сегмент ДНК, несущий w^c аллель локуса white /65/. другой подвижный элемент получил название ТЕ. Он значительно большего размера и часто переносит не только локус white , но и соседний локус roughest /70/. Иногда ТЕ инициирует транспозицию и других локусов, прилежащих к white и roughest

Однако активное изучение подвижных элементов началось только с конца 70-х годов, когда исследователи начали интенсивно использовать методы генной инженерии /6/.

Одновременно в лаборатории Георгиева и Хогнесса при отборе клонированных фрагментов ДНК дрозофилы, наиболее сильно гибриди-зующихся с цитоплазматической поли/А/⁺-РНК, были получены несколько последовательностей, дальнейшее исследование которых показало, что они являются представителями отдельных семейств множественных рассеянных по геному генов с варьирующей локализацией /69,18/. В американской литературе для обозначения этих последовательностей часто используется термин "copia-like elements".

В настоящее время известно около 20 семейств таких генов, но наиболее изученными из них являются: ВДГІ /69,18,16,4,133,60, 8,9,13,132/, ВДГЗ /69,18,16,4,133,60,8,9,19/, copia /52,110,

127,103,45,88,117,48,56/, 412 /52,110,127,103,117,145/, 297 /52,110,127,103,68/, BI04 /116/.

I. Общая характеристика структуры и организация в геноме дрозофилы

ЩО? имеют размер от 5 до 8 тпн и представлены в геноме в количестве от 20 до 200 копий. Гибридизационные эксперименты не выявили никаких гомологии между представителями различных семейств. С другой стороны, практически все члены одного и того же семейства представлены в геноме идентичными по размеру и сходными по нуклеотидной последовательности фрагментами ДНК. Это было показано следующим образом. Геномную ДЖ обрабатывали какой-либо рес-триктазой и фракционировали в агарозном геле. Затем ДНК переносили из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с мечеными клонированными копиями ВДГ. При этом наблюдали ряд полос, абсолютно совпадающих с теми, которые получаются при обработке клонированной копии ВДГ той же рестриктазой. В некоторых случаях можно было видеть слабые полосы, отличающиеся от основных. Из этого следует, что в основном все копии данного ДІЛ?, представленные в геноме d. meianogaster , идентичны, однако, есть незначительное число, отличающихся по рестриктной карте /52,8,103/. Из перечисленных выше семейств ВДГ наиболее выражена такая внутренняя гетерогенность у ВДГ 297 /60,127/. Обычно такие отличия связаны с делениями или изменениями в нуклеотидной последовательности. Описаны случаи, когда замещения негомологичными последовательностями затрагивают до 50$ всей длины ВДГ /52,103,121,83,134, ИЗ/.

Эксперименты по перекрестной гибридизации внутренних фрагментов ЩО? показали, что все ВДГ имеют прямые длинные концевые повто-

ры, размером 250-500 пн /52,8/.

Сразу же за длинными концевыми повторами (ДКП), являющимися составной частью ЩГ, начинаются геномные последовательности, различающиеся для каждого члена данного семейства МДТ /52,8,103/. Это было продемонстрировано следующими экспериментами. В качестве гибридизационной пробы использовали краевой фрагмент клонированной копии МДГ, а геномную ДНК обрабатывали рестриктазой, которая имеет один сайт узнавания внутри этого фрагмента, а другой - снаружи, причем вне тела МДТ. Затем ДНК фракционировали электрофорезом в агарозном геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с меченой пробой. При этом для всех гибридизующихся фрагментов ДНК один конец строго фиксирован, так как находится внутри ЩГ, а другой расположен в последовательности ДНК, непосредственно примыкающей к МДГ, Оказалось, что после гибридизации можно видеть серию дискретных полос, причем число их, как правило, примерно совпадало с числом копий данного МДГ в геноме /52,8,103/. Таким образом, мобильные диспергированные гены рассеяны по геному.

Непосредственно это было показано с помощью гибридизации in situ . Было обнаружено, что в случае всех МДТ, клонированная копия гибридизовалась с целым рядом мест на политенных хромосомах дрозофилы /121,52,8,103/, причем число мест гибридизации примерно совпадает с числом копий данного МДГ в геноме мух. Если использовать для гибридизации in situ разные линии D. meianogasteri то места локализации одного и того же МДТ на политенных хромосомах различаются. Например, для МДГІ только 6 из 21-23 мест общие для линий gtw^a и gt¹3z /69,18/. Более того, даже у разных особей одной и той же линии они различаются /18,127,147/. Таким образом, существует межлинейная и внутрилинейная вариабельность в локализации МДТ на политенных хромосомах.

В локализации МДТ на политенных хромосомах не наблюдается специфичности. Они обнаруживаются с равной вероятностью во всех хромосомах (из этого анализа ускользает только У-хромосома, так как она не политенизируется), в районах эу- и гетерохроматина, в хромоцентре /52,8,103,121,147/. В окружении МДТ встречаются самые разные последовательности, такие как сателлитная ДНК, умеренно повторяющиеся и уникальные последовательности генома /52,8, 103,121,31,32/. В ряде случаев МДТ были локализованы внутри рибо-сомных и гистоновых кластеров, а также вблизи или внутри других умеренно повторяющихся и уникальных генов /18,113,31/.

Хотя мобильные диспергированные гены являются "прыгающими", перемещение МДТ - довольно редкое явление. При изучении линии, содержащей сцепленные XX и ХУ-хромосомы, у всех изученных особей локализация МДТ2 была постоянной; неизменным было и расположение генов МДТІ, МДТ2 и ВДГЗ в Х-хромооомах инбредной линии g^, анализированной в течение нескольких лет /133,1/. Такие же данные, но уже для всех хромосом были получены при гибридизации мобильного элемента Dm 25 с политенными хромосомами различных линий дрозофилы /101/. Лишь одно изменение (потеря ЩГ) было обнаружено при изучении локализации гена соріа в одной из лабораторных линий, D. melanogaster , но эта линия ведется уже 50 лет /121/. Однако, недавно появилась работа, противоречащая вышеизложенным. В ней опубликованы результаты гибридизации генов copia , 412, МДТІ, 297 и ВІ04 с нитроцеллюлозными фильтрами, содержащими рес-триктированную ДЕК, выделенную из разных стоков некоторых линий D. melanogaster . Стоки отбирались с интервалом примерно в 10 поколений. Было обнаружено, что различия между стоками сравнимы с различиями между линиями, из чего следует, что частота перемеще-

ния перечисленных ВДГ довольно высока /76/. Таким образом, этот вопрос требует дальнейшего исследования.

Для выяснения вопроса о том, сохраняется ли неизменным расположение ЩГ в ходе онтогенеза, было изучено их распределение по хромосомам в различных типах клеток. Эти опыты показали, что в дифференцированных клетках локализация ЩГ на хромосомах сохраняется стабильной /121/.

Отличительной чертой МДТ является их видоспецифичность, однако, она может не иметь универсального характера, так как недостаточно семейств еще изучено. Показано, что ряд МДТ, выделенных из D.melanogaster отсутствует у других видов дрозофилы. Так, например, ВДГІ и МДТЗ не найдены у D. virilis /133/, a copla и 412 у D« hydei /121/. Это не означает, однако, что у этих видов нет МДТ. Г.Ениколоповым в нашей лаборатории были выделены из ДНК D. virilis МДТ-элементы, которые, в свою очередь, отсутствуют у D.melanogaster /4,133,47/.

Даже у близкородственных видов таких как D. meianogaster , D. simulans и D.pseudoobscura , обнаружены большие вариации в повторяемости и консервативности MJIJl, которые не обязательно строго отражают эволюционные отношения между видами. В геноме D.simulans ген copia повторяется всего 4 раза, а у D. pseudoobscura - 30 раз /121/. В целом же, сравнение гибридизации 15 клонированных МДТ *> melanogaster с политенными хромосомами D. simulans показало, что некоторые из них вообще отсутствуют, а другие присутствуют в значительно меньшем количестве /43/. Таким образом, некоторые МДТ проявляют высокую видоспецифичность, что существенно отличает МДТ от всех других уникальных и повторяющихся генов.

йце одним характерным свойством ЩГ является их амплификация

в культуре клеток дрозофилы. Это четко видно при сравнении числа копий ВДГ в ДНК, выделенной из мух или эмбрионов, и числа копий МДТ в ДНК, выделенной из культуры клеток (см. таблицу I). Различия в повторяемости наблюдаются и при сравнении их числа в разных линиях D, melanogaster , однако эти различия не бывают большими. /69,18,127,147,9/. Это говорит об относительном постоянстве числа копий МДТ в соматических клетках /147/. При культивировании же клеток дрозофилы in vitro число копий ВДГ на гаплоидный геном в некоторых случаях увеличивается в 10 раз, что говорит о сильной амплификации ВДГ в культуре клеток /8,103/. Показательно, что в различных культурах наблюдается выборочная амплификация ВДГ. Так число копий МДТІ, ВДГЗ увеличивается в культуре клеток линии 67 J25D почти в 10 раз, а число копий ВДГ2 (412) остается неизменным /133,8/. В другом случае, в культуре клеток линии Кс происходит трехкратная амплификация ВДГ2 /103/.

Таблица I

Основные характеристики мобильных диспергированных

генов дрозофилы

Название Длина Длина Число Число Размеры пг>_итго._т,

ВДГ в тпн ДКП в копий копий осн.дит. ^ЫЛКИ

тн на гапл. в кул. поли/А/ -
геном клеток РНК в S
эмб. или тн

240 29S,I5S

230 26S,I5S

170 5,2 2,1

120 7,5 2,2

170 6,5

95 8,0

ВДГІ 7,2

ВДГЗ 5,5

copia 5,2

412 7,5

297 6,5

BI04 8,7

69,18.16.4,133, 60,9,8,13,132

69,18.16.4,133, 60^9,8,I

52,110,127,103. 45,88,117,48,56

52,110,127,45, 11^,145

52,110,127,45, 68

Механизмы амплификации ВДГ, тесно связанные с их транспозицией, не ясны. Прямая дупликация ЩГ кажется маловероятной. Например, при анализе окружения гена ВДП в клонированных ДНК клеточной линии 67J 25D показано, что во всех случаях последовательности, окружащие ВДГІ различны /133,8,134/. В других случаях также не найдено тандемов, состоящих из одинаковых ВДГ, при их амплификации /8,103/. По-видимому, в клетках, культивируемых in vitro , амплификация ВДГ происходит за счет образования новых копий, которые затем встраиваются в новые места генома.

2. Транскрипция мобильных диспергированных генов.

Характерной чертой МДГ является обязательная транскрипция всей повторяющейся единицы, в том числе и ДКП, обрамляющих ВДГ с двух сторон. По-видимому, во всех случаях инициация и термина-ция синтеза РНК осуществляется внутри ДКП /4,9,110,121,148,46/. В ряде случаев это показано строго, например, для BI04 была определена первичная структура двух клонов, содержащих ДНК, комплементарную в одном случае началу, а в другом - концу цитоплазмати-ческой поли/А/⁺-РНК, транскрибируемой с этого гена, и оказалось, что и начало и конец транскрипции находятся внутри ДКП /116/.

Показано, что ВДГ считываются без какого-либо перерыва, в результате чего первичный транскрипт представляет собой молекулу РНК, соответствующую по величине всему ВДГ (см. таблицу I).

Помимо полноразмерных транскриптов, которые обнаруживаются как в ядре, так и в цитоплазме, в цитоплазме имеются также РНК меньшего размера, гибридизующиеся с ВДГ /110,9,148,46/. В случае ВДГІ и ВДГЗ их происхождение, по-видимому, связано со сплайсингом больших транскриптов. Действительно, гибридизационные эксперименты показали, что 3» и 5»-концевые последовательности малых РНК

соответствуют концевым последовательностям полноразмерных РНК /60,9/. Интересно, что оба типа РНК присутствуют в цитоплазме примерно в эквимолярных количествах.

Сходные по величине транскрипты были обнаружены и для двух других ВДГ дрозофилы-copia и 412 /110,148/. Возможно, что происхождение РНК длиной л/ 2 тн в этих случаях также связано со сплайсингом исходных больших транскриптов. В ряде случаев обнаружены также еще более мелкие транскрипты, но они присутствуют в клетке в меньшем количестве /148/.

Была исследована также транскрипция ЩГ copia и 412 на разных стадиях развития дрозофилы. Для этого выделяли цитоплазма-тическую поли(А)⁺-РНК из яиц, личинок и зрелых мух, фракционировали в агарозном геле в присутствии формальдегида, переносили на диазо-бумагу,и такие Нозерн-блоты гибридизовали с клонированными копиями ВДГ. Оказалось, что ВДГ транскрибируются на всех стадиях развития дрозофилы, однако, выяснилось, что ВДГ copia интенсивней всего транскрибируется в личинках, а 412 - в эмбрионах. Было также показано, что такое различие не может быть объяснено различиями в хромосомной локализации /117/.

Пожалуй самой интересной специфической особенностью ВДГ, которая может служить тестом для их выявления, является симметричная транскрипция. По крайней мере, ряд ВДГ дрозофилы был выделен именно таким образом /16,60/. Изучение этого явления показало, что хотя транскрипция в обоих направлениях происходит полностью, однако, довольно неравномерно. Одна из цепей транскрибируется в 10-20 раз интенсивнее /16,9/.

Для объяснения симметричной транскрипции ВДГ возможны 2 гипотезы. Первая заключается в том, что на обоих концах ВДГ в ДКП

имеются промоторы, действующие в противоположных направлениях, однако, по какой-либо причине, один из них значительно слабее другого. Второе предположение заключается в том, что в ДКП каждой копии МДГ имеются промоторы, направляющие синтез РНК только с одной цепи ДНК ЩГ, другая же цепь транскрибируется только у тех копий данного МДГ, которые случайно попали под влияние сильного клеточного промотора. По ряду причин первое объяснение кажется более вероятным /16,6/.

Симметричная транскрипция ІУЩГ вызывает особый интерес в связи с проблемой общей организации транскрипции у эукариот. Уже давно замечено, что в клетках млекопитающих содержатся самокомплементарные последовательности РНК /14,12/. При выделении РНК методом горячей фенольной экстракции большая часть РНК (до 1%) представлена двуцепочечной РЖ не палиндромной природы (дцРНК-А), которая, как было показано, считывается с повторяющихся последовательностей генома. Так как обнаружение такой РНК сильно зависит от метода выделения, то можно думать, что такая РНК образуется в результате отжига самокомплементарных последовательностей в условиях обработки клеток горячим фенолом, что как известно сильно ускоряет реакцию гибридизации /80/. Во всяком случае показано, что у дрозофилы самокомплементарные последовательности РЖ, гиб-ридизующиеся с МДГ, в цитоплазме клеток исходно не связаны друг с другом /16/.

Сходство в характеристике самокомплементарных последовательностей РЖ дрозофилы и млекопитающих, и тот факт, что дцРЖ считывается с ЩГ, позволяет предполагать, что МДГ имеются не только у дрозофилы, но и у млекопитающих. Здесь их аналогом могут быть проретровирусы группы А /99/.

Интересно также, что дцРНК-А млекопитающих гибридизуется в значительной степени (до 20%) с неполисомной цитоплазматической поли(А)⁺-РНК, тогда как с полисомной лишь в незначительной степени /81/.

Аналогичную картину мы видим и с транскрипцией МДГ у дрозофилы. Показано, что более 10$ цитоплазматической поли(А)⁺-РНК гибридизуется с МДГ /121,16,4/. Но несмотря на такую высокую представительность транокриптов с ВДГ в цитоплазматической поли(А)⁺-РНК, почти вся она обнаруживается в составе свободных РШ-частиц, и лишь очень незначительная часть ее (10-20%) выявляется в полисомах /60,9,148/.

В бесклеточной системе суммарная поли(А)⁺-РНК, гибридизую-щаяся с МДГ copia , способна направлять синтез трех полипептвдов с молекулярным весом 51000, 33000 и 21000 Дальтон. Не установлено разные это белки, или же белки с меньшим молекулярным весом являются частями большего. Предполагается, что транслируется меньший транскрипт гена copia ( 2,1 тн) /48,56/. Однако, in vivo обнаружить белковые продукты мобильных диспергированных генов пока не удалось, и вопрос о трансляции in vivo РЖ, считываемой с ВДГ, остается открытым.

3. Тонкая структура длинных концевых повторов и прилегающих к ним участков.

Характерной особенностью мобильных диспергированных генов является наличие на их концах ДКП длиной 250-500 пар нуклеотидов. Первоначально они были выявлены с помощью электронно-микроскопических или гибридизационных экспериментов /52,8/. Вероятно, именно ДКП ответственны за транспозицию МДГ. В пользу этого говорит

тот факт, что все известные элементы, способные к транспозиции, включая прокариотические is -элементы и транспозоны, содержат на своих концах зоны гомологии /29/. С другой стороны, в пределах ДКП начинается и оканчивается транскрипция. Все это обусловило повышенный интерес к изучению тонкой структуры ДКП.

В настоящее время определены первичные последовательности следующих мобильных диспергированных генов: ВДГІ /ІЗ/, ВДГЗ /19/, copia /88/, 412 /145/, 297 /68/, BI04 /116/ и 17.6 /83/. Ана-лиз секвенированных последовательностей показывает, что различные МДГ имеют много общих черт организации, особенно в отношении ДКП и прилежащих к ним участков. Схематически это можно представить следующим образом (рисунок I).

Интересно, что хотя у каждого члена данного семейства ВДГ оба ДКП имеют абсолютно одинаковую последовательность нуклеотидов, у разных членов одного и того же семейства в первичной структуре ДКП могут быть некоторые замены, а также вставки или делеции /13,88,145/. Обычно такие отличия составляют несколько процентов, например, для двух копий ВДГІ число нуклеотидных замен в ДКП составляет 3$ /ІЗ/. В одной из копий ВДГ 412 обнаружена вставка длиной 90 нуклеотидов /145/. Недавно выявлено еще одно семейство їда - 17.6, которое авторы считают самостоятельным, но которое родственно семейству ВДГ 297. ДКП ВДГ 17.6 имеет 4 протяженных участка сильной гомологии с ДКП 297, которые разделены негомологичными участками. Общий процент гомологии составляет около 60$ /83/. Из этих данных можно сделать вывод, что точная последовательность нуклеотидов в ДКП не находится под жестким эволюционным давлением, но при каждом акте транспозиции происходит коррекция одного ДКП по другому.

Рис. І. Организация ДКП и прилежащих к ним последовательностей у МДГ дрозофилы. Стрелками показаны элементы двойной симметрии в участках, расположенных по краям или непосредственно рядом с ДКП. Цифры - число нуклеотидов, цифры в скобках - количество нуклеотидов, способных к образованию несовершенных палиндромов. Заштрихованная область - дупликация хозяйской ДНК - мишени.

Другой характерной особенностью структуры МДГ является присутствие коротких несовершенных палиндромных последовательностей на его концах. У всех ВДГ такие палиндромы входят в состав ДКП /13,88,145,68,116,83/. Схематично организацию несовершенных палиндромных последовательностей в связи с общей структурой МДТ можно представить следующим образом (рис. 2).

Почти все МДГ - элементы начинаются с последовательности ТОТ и оканчиваются последовательностью аса /13,19,88,145,116/. Исключение составляют 297 и 17.6 и МДТ4 /68,83,5/. 7 всех без исключения ЩГ снаружи от ДКП, вне тела МДГ, расположены короткие повторы длиной 4-5 нуклеотидов. Для разных представителей одного и того же семейства эти последовательности могут различаться по составу, но число дуплицирущихся нуклеотидов всегда фиксировано /13,19,45,145,68,116,83/. Наличие таких коротких прямых повторов еще раз доказывает транспозиционную природу МДТ, так как такая дупликация хозяйской ДНК - мишени происходит за счет несимметричного разрыва цепей ДНК и дальнейшего застраивания брешей при внедрении їда в этот участок ДНК. Отсутствие гомологии между последовательностями-мишенями для разных членов одного и того же семейства свидетельствует в пользу неспецифичности интеграции . МДГ. Однако, некоторая специфичность интеграции наблюдается для ВДГ 297 и 17.6. Обнаруживаемая дупликация хозяйской ДНК - їлишени для этих МДГ представляет собой последовательность ТАТАТА /68,18/. Поэтому неслучайно 297 очень часто обнаруживается в ТАТА - блоках /68/, а 17.6 был клонирован в составе АТ-богатого спейсера между гистонами НІ и НЗ /83/.

В составе ДКП МДТ можно выявить последовательности типа блока Хогнесса и ААТААА - последовательности /13,19,88,145,68,116,

внутренняя часть МДТІ

T-A' А-тТ A-T G-C T-G T T T-A -A-T T-A. T-A-G-C A-T T-A G-C T-A

CGAT TCTCCCTCCTTTT 6300 _H....TCAGGCTCGCCA CGAT

Рис. 2. Схематическое изображение концов ЩГІ, демонстрирующее несовершенные палиндромы и прямые повторы на концах. Двойной чертой подчеркнуты дупликации хозяйской ДНК в месте интеграции ВДГ. Одной линией подчеркнуты последовательность, комплементарная полипуриновому блоку и последовательность, гомологичная тРНКТ дрозофилы.

_{- so -}

83/, которые можно предположительно рассматривать как промотор для инициации и сигнал для полиаденилирования РНК, особенно если учесть, что транскрипция 1\ЩГ начинается и оканчивается внутри ДКП. Эти последовательности имеются в некоторых ВДГ в обеих цепях ДКП, что возможно объясняет симметричную транскрипцию ВДГ. В некоторых случаях промоторные последовательности предшествуют терминирующим /13,19,145/. Таким образом, наличие в ДКП сигналов для начала и окончания синтеза РНК делает транскрипцию ВДГ независимой от остального генома.

Еце одно очень интересное свойство ВДГ выявляется при анализе первичной структуры последовательностей, примыкающих к ДКП и входящих в состав тела ВДГ. Сравнение первичной структуры ВДЕТ и 412 /13,145/, выявило наличие областей сильной гомологии в районах стыка ДКП с телом ГДЦГ длиной в 35 нуклеотидов с одной стороны и 18 нуклеотидов с другой. Дальнейший анализ показал, что один из этих участков гомологичен 3*-концу аргининовой тРНК дрозофилы, а в составе другого имеется полипуриновый блок. Подобные гомологии, правда не так ярко выраженные, были выявлены и для некоторых других ВДГ /68,116,83/.

Наличие такого большого количества общих черт в организации первичной структуры ДКП у разных семейств мобильных диспергированных генов может указывать на непосредственное участие ДКП в транспозиции этих элементов.

ЗУ. ДРУГИЕ МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ" ЭЛЕМЕНТЫ ДРОЗОФИЛЫ

I. Семейство FB -элементов

Помимо мобильных диспергированных генов в геноме D. meianogas ter обнаружены последовательности, также имеющие варьирующую

- ЗІ -

локализацию в хромосомах, но устроенные иначе, чем ГДДГ. Их характерной особенностью является наличие на их концах длинных инвертированных повторов, благодаря чему они получили название " fold back sequences ". Один из классов таких последовательностей, названный FB-семейством, в настоящее время довольно хорошо изучен /104,102,138/. FB -семейство состоит примерно из 30 членов, сильно различающихся как по размерам, так и по первичной структуре. Длина fb -элементов варьирует от 0,4 до 4 тпн. Общим для всех членов этого семейства является присутствие гомологичных последовательностей на концах в области инвертированных повторов. Протяженность обращенных повторов также варьирует в диапазоне от 0,2 до 1,3 тпн.

Внутри ЕВ-элемента иногда имеется последовательность, не входящая в состав концевого повтора, петля, которая у разных членов FB-семейства таїте очень гетерогенна как по величине, так и по последовательности нуклеотидов. Таким образом, петля является очень изменчивой и необязательной для членов этого семейства. Вероятно, она соответствует участку генома, захваченному FB-эле-ментом при его транспозиции.

Интеграция ів-злемента сопровождается дупликацией 9 -нуклеотидной последовательности-мишени в геноме хозяина, что приводит к образованию прямого повтора на концах FB-элемента /138/.

Исследование тонкой структурной организации (рестриктное картирование и определение первичной структуры) неожиданно выявило необычную организацию концевых обращенных повторов FB-элемен-тов. Так, например, инвертированные повторы в FB3 и FB4,b свою очередь, состоят из множества простых повторов длиной 10, 20 и 31 нуклеотид, причем по мере удаления от левого конца повтора

вглубь к петле элемента 10 - нуклеотидаый повтор превращается в 20 - нуклеотидный (первые 10 нуклеотидов в 20 - нуклеотидном повторе совпадают с 10 - нуклеотидным), который затем, в свою очередь, превращается в 31 - нуклеотидный. Между повторами находятся участки неповторяющейся ДНК различной протяженности /102,138/.

По своей структуре инвертированные повторы FB-элементов несколько напоминают сателлитную ДНК и некоторые участки нетранскри-бируемых спейсеров рибосомной ДНК /7,28/. По-видимому, различной степенью повторенности простых повторов и обусловлены различия в длине обращенных повторов.

Концевые участки FB-элементов весьма консервативны. Так, например, аналогичные концевые последовательности в FB3 и FB4 на протяжении первых 200 нуклеотидов имеют 99$ гомологии. Судя по рестриктным картам также устроены концевые повторы и других членов FB-семейства. Обращенные повторы одного и того же FB-эле-мента обладают значительно меньшей гомологией: в них встречаются точечные замены, а также выпадения целых блоков простых повторов. Так, в FB4 левый и правый инвертированные повторы отличаются по длине на 200 нуклеотидов /102/. То же характерно и для других FB -элементов. Это свойство значительно отличает концевые повторы этих элементов от ДКП МДГ и напоминают некоторые транспозоны бактерий /29/. По-видимому, и сами механизмы транспозиции МДТ и FB -элементов различны. Предполагается, что перенос последних осуществляется особым ферментом - транспоазой, которая, возможно, кодируется самим подвижным элементом. Так, FB4 имеет петлю, длиной около 1700 пар нуклеотидов, которая сама многократно повторяется в геноме дрозофилы, либо в окружении FB-палиндромов, либо без них. В этой последовательности имеется блок Хогнесса, усили-

тель и последовательность для полиаденилирования транскрипта. Имеется также открытая рамка для считывания белка, а через 148 триплетов кодон стоп - сигнала трансляции /102/.

Fb-семейство составляет лишь небольшую часть ( 2$) от общего числа протяженных палиндромных последовательностей у дрозофилы /138/. Структурная организация других семейств протяженных палиндромных последовательностей не изучена.

2. Р-фактор и гибридный дисгенезис

В настоящее время показано, что клонированный интактный Р-

ЭЛемеНТ МОЖеТ бЫТЬ введен В ГеНОМ D.melanogaster (М-ЛИНИИ) НЄ-

посредственно и с очень высокой эффективностью (^bCffa) путем инъекции ДНК в яйца. При этом, в геноме затем были обнаружены 1-5 копий полноразмерного Р-элемента, локализованных в разных участках хромосом. Штегрировались в геном только сами Р-элементы без окружающих их плазмидных и геномных последовательностей /122/. Показано также, что Р-элементы могут быть использованы как векторы для генетической трансформации /112/.

В настоящее время известна еще одна система гибридного дис-генезиса -1-Е /78/ и выделен, подобно Р-элементу, 1-элемент.

3. Перемежающиеся повторы

Существует еще один класс подвижных генетических элементов дрозофилы - перемежающиеся повторы ("scrambled sequences *), который пока еще очень слабо изучен. Протяженные последовательности этого типа предотавляют собой набор повторяющихся последовательностей генома длиной 0,2-1 тпн. Каждый такой кластер состоит из большого числа различных коротких повторов, индивидуальные последовательности внутри кластера могут встречаться как в прямой, так и в обратной ориентации. Одни и те же повторы могут встречаться в разных кластерах, но порядок чередования их и сам набор в целом строго специфичен для данного кластера. В одном из кластеров была обнаружена рассеянная по хромосомам последовательность, повторяющаяся 1000 раз в геноме дрозофилы. Один из таких перемежающихся повторов был обнаружен на расстоянии 9 тпн от одного из генов теплового удара ( heat shock ), другой - в нитроне рибосомного гена и вблизи от ВДГ 412.

Детальный анализ 4-х клонированных кластеров показал, что вместе они содержат по крайней мере 17 различных семейств повто-

ряющихся последовательностей, что составляет около 25% умеренных повторов. Предполагается, что короткие повторяющиеся последовательности, входящие в состав больших кластеров, являются мобильными элементами, а их интеграция в геном наиболее эффективно проходит вблизи других таких же последовательностей /144/.

У. МОБИЛЬНЫЕ ДИСПЕРГИРОВАННЫЕ ГЕНЫ В ДРУГИХ ОРГАНИЗМАХ. СХОДСТВО ВДГ С ПРОРЕТРОВИРУСАМИ.

Вслед за открытием ВДГ у дрозофилы были обнаружены подобные элементы у дрожжей. В настоящее время хорошо изучено семейство ВДГ у дрожжей Ту I /30,109,89,79,49,57/. Это семейство представлено в гаплоидном геноме дрожжей ^35 копиями /30/. Размер Ту I составляет 5,9 тпн /57/, на концах имеются ДКП, которые получили название 8 -повтор, длиной 338 пн /49,57/. Основной транскрипт имеет длину 5,7 тн, выявляется также еще один длиной 5,0 тн /46/. Также как и ВДГ дрозофилы, Ту I рассеян по геному, причем локализация его в различных штаммах отличается /30/. Для Ту I было показано, что могут появляться новые копии Ту I, а старые остаются на прежних местах /46/. Встраивание новой копии сопровождается дупликацией 5 нуклеотидов /49,57/. Структура ДКП очень похожа на ДКП ВДГ дрозофилы /49,57,46/. Особенностью Ту I элемента является наличие 5-нуклеотидного повтора внутри гена, непосредственно примыкающего к ДКП. Интересно также, что 8-повтор обнаруживается самостоятельно, а не только в связи с полным Ту I /30/. Ряд мутаций дрожжей связан со встраиванием этого ВДГ /109,89,126/.

Некоторое сходство обнаруживается между ВДГ и транспозонами бактерий /29,106/, но пожалуй, самым интересным и поразительным является сходство мобильных диспергированных генов с провирусами

ПРОВИРУСНАЯ ДНК
#

П УП5
5» Г"¹ ^ь

вирусная РНК

jU-

КАІЗ»

УПЗ п

геном хозяина

место интеграции

Рис. 3. Соотношение между ретровирусной ДНК и провирусной последовательностью генома /108,III/. I - ДКП, 2 -инвертированные повторы, 3 - короткие прямые повторы, 4 и 5 - блок Хогнесса и последовательность ААТААА, 6 и 7 - последовательность, комплементарная 3»-концевой части тРНК, и полипуриновый блок. П - повтор в РНК, УП5 и УПЗ - уникальные последовательности РНК, (А) -поли(А)последовательность в РНК.

Таблица 2

Сравнение характеристик ЩГ дрозофилы и проретровирусных последовательностей позвоночных.

Свойство

ВДГ-эле-менты

Проретро-вирусы

Величина

Повторяемость в геноме (число копий)

Рассеянность по геному

Гомогенность элементов

Гетерогенность окружающих последовательностей

Варьирующая локализация в геноме

Возможность существования в клетках в виде кольцевых нехромосомных молекул ДНК

Активная транскрипция

Транскрипция всего генетического элемента в виде непрерывной цепи РНК

Симметричность транскрипции с предпочтением одной цепи

Наличие сплайсированных б'-З»-транскрипт ов

Концентрирование транскриптов в свободных РНП-частицах

Видовая специфичность

Наличие ДМ на концах элементов

Палиндромы в ДМ

Зона гомологии с тРНК и полипуриновая последовательность рядом с ДМ

Дупликация короткой последовательности хромосомной ДНК (4-6 нуклеотидов) в месте внедрения в геном МДТ-элементов и проретровирусов

эукариотических ретровирусов /17,24,11/. Наиболее ярко это выявляется при сравнении организации ДКП. Можно видеть, что все свойства ДКП ЩГ обнаруживаются и в ДКП проретровирусов /119,128/ (см. табл. 2).

Для ретровирусов механизм их репликации относительно хорошо изучен (рис. 3).

Известно, что после инфекции репликация вирусной РНК идет через обратную транскрипцию с последующим синтезом второй цепи ДНК, причем функцию затравки для минус-цепи выполняет одна из клеточных тРНК, а для синтеза плюс-цепи важен полипуриновый блок, расположенный вблизи одного из ДКП. В результате синтеза образуется линейная двуспиральная молекула ДНК, на обоих концах которой обнаруживаются полные последовательности ДКП. На следующем этапе линейные молекулы переходят, в кольцевые, содержащие I или 2 ДКП. Хотя в настоящее время неизвестно какая форма молекул (линейная или кольцевая) встраивается в геном хозяина, но большинство исследователей считает, что в интеграции участвуют кольцевые молекулы проретровирусов /141а/.

Для репликации вирусной РНК существенно присутствие на ее концах повторяющихся последовательностей длиной 20-60 нуклеоти-дов, что обеспечивается тем, что в ДКП последовательности, необходимые для инициации транскрипции (блоки Хогнесса) всегда предшествуют сигналам окончания транскрипции и полиаденилирования РНК (блоки ЛАТАМ) /62/. В результате в вирусной РНК на обоих ее концах находятся повторяющиеся последовательности /141а/.

Как уже указывалось ранее МДГ дрозофилы также содержат районы, напоминающие участки связывания тРНК-праймера и полипуриновые блоки ретровирусов. Блоки Хогнесса у МДТ также предшествуют после-

довательностям ДАТАМ.

Более того, ДКП обнаруженного недавно ВДГ 17.6 имеет около 6($ гомологии с ДКП вируса лейкоза-саркомы птиц ( AL-sv ). Это позволило разделить ДКП ВДГ 17.6 на участки УП5,П и УПЗ, аналогичные таковым вируса AL-SV /83/. Этими же авторами были обнаружены в культуре клеток дрозофилы ретровирус-подобные частицы, содержащие РНК длиной 5 тн, которая гибридизовалась с ДНК МДТ copia . Эта РНК в бесклеточной системе направляла синтез полипептидов, которые осаждались сывороткой против этих ретровирусо-подобных частиц /П8а/.

Очевидно, что сходство ретровирусов и ВДГ не случайно. Несомненно, что те и другие имеют родственную природу. И тут появляются две противоположные точки зрения. Некоторые авторы считают, что МДТ произошли от древнего ретровируса, заразившего предков современной дрозофилы /83/. Другие же полагают, что поскольку, вообще, мобильные генетические элементы обнаруживаются и у прокариот, то МДТ являются эволюционно более древними и ретровирусы произошли от мобильных диспергированных генов /53,135,51/.

УІ. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕМЩЕНИЯ МДТ.

Можно предположить два принципиально различающихся механизма перемещения мобильных элементов - механизм с участием обратной транскрипции (ревертазный путь) и механизм, заключающийся в ре-комбинационных перестройках (рекомбинационный путь).

То удивительное структурное сходство, которое существует между МДТ и проретровирусами, позволяет предполагать, что образование новых копий МДТ и их интеграция в хромосомную ДНК может происходить ревертазным путем. Ярким свидетельством в пользу учас-

тия обратной транскрипции в образовании инсерций в эукариотичес-ких клетках является структура псевдогенов. Псевдогены обычных генов лишены интронов /141,97,105/. Это возможно лишь в том случае, если матрицей для синтеза ДНК служит зрелая мРНК, которая, как известно, не содержит интронов. Об инсерционной природе псевдогенов говорит наличие дупликации нескольких нуклеотидов по краям псевдогенов, аналогичной дупликации хозяйской ДЖ - мишени в месте интеграции ВДГ и других транспозонов /72,140/.

Как для провирусов ретровирусов, так и для одного из ВДГ -copia обнаружена в клетках экстрахромосомная кольцевая ДНК, которая может служить промежуточным звеном в акте транспозиции /54/. Однако, существование таких колец не исключает, что транспозиция может происходить рекомбинационным путем, так как такие кольца могут образовываться и при рекомбинации по повторяющимся последовательностям. При этом возможно образование кольцевых молекул, содержащих как I, так и 2 ДКП (рис. 4). В пользу рекомбинационно-го пути образования кольцевых молекул свидетельствует обнаружение нескольких нуклеотидов хозяйской ДЖ, разделяющих ДКП в кольцевых молекулах МДГ copia , содержащих 2 ДКП /54,55/.

Вероятней всего, существуют оба пути, причем в тех случаях, когда появление новой копии ВДГ сопровождается потерей одной из старых, то можно говорить о транспозиции путем рекомбинации. При этом число копий ВДГ остается неизменным. В случаях же, когда при появлении новой копии МДТ сохраняются и все старые, то вероятней всего говорить о ревертазном пути транспозиции. Этот путь возможно превалирует в культуре клеток, в которых часто наблюдается резкая амплификация ВДГ. В пользу этого говорит и недавнее обнаружение в одной из культур вирусоподобных частиц, содержащих РЖ ВДГ copia ,

-#-

Рис. 4. Модель рекомбинации МДТ, приводящая к образованию кольцевых ДНК с одним (а) или двумя (б) ДКП. а. Рекомбинация происходит между ДКП; б. Рекомбинация происходит между короткими дуплицированньми последовательностями генома хозяина, прилежащими к МДТ /15^.

эти частицы также содержали ревертазную активность /118а/.

УІІ. ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ мдг.

Несколько лет назад была выдвинута гипотеза, согласно которой в геноме присутствуют элементы, которые не выполняют никаких полезных функций, но благодаря тому, что они обладают способностью к независимой репликации и транспозиции, они удерживаются в ходе эволюции /42,114/. Их утрата из одного участка генома уравновешивается внедрением в новые места. К этой "эгоистической" или "паразитической" ДНК были, прежде всего, отнесены повторяющиеся последовательности. Их присутствие в геноме, коль скоро их количество не превышает неких предельных допустимых величин, по-видимому, не является слишком обременительным для клетки.

Эти идеи вскоре нашли свое подтверждение в том отношении, что многие повторяющиеся последовательности способны встраиваться в новые места генома и являются, таким образом, транспозонами. Для некоторых случаев показано, что их присутствие не является круциальным для клетки /82/.

Однако нельзя считать, что присутствие МДГ в геноме организма абсолютно для него безразлично. Совершенно очевидно, что инсер-ция повтора внутрь смысловой части гена во многих случаях должна сопровождаться инактивацией последнего. Действительно, большинство так называемых "точечных" мутаций у дрозофилы ныне объясняется внедрением тех или иных инсерций, часто ВДГ-элементов, обращенных повторов и т.п. /34/. В настоящее время исследователи успешно используют этот факт для клонирования тех или иных генетических ло-кусов. Так локус white был клонирован с использованием МДГ copia /22/, а обнаружение МДГ 412 при некоторых мутациях в локусе ante-

nopedia позволило проклонировать и этот генетический локус.

В принципе, возможно не только негативное, но и позитивное влияние МДГ на работу генов. Прежде всего, в самой структуре ВДГ-элементов заложены возможности для влияния на работу прилежащих к ним генов. В их ДКП в обеих цепях имеются промоторы, которые могут действовать в обоих направлениях. Так как ДКП расположены на обоих концах ВДГ, то транскрипция с их промоторов может идти как в одну, так и в другую сторону от МДГ. Таким образом, внедрение МДГ может влиять на экспрессию окружающих МДГ генов. Как правило, промоторы МДГ слабые, но есть и исключения. Промотор гена copia достаточно сильный. Известны примеры такой стимуляции работы гена. Так, например, внедрение ВДГ Ту І в окружение ряда генов приводит к появлению конститутивного синтеза продуктов этих генов у дрожжей.

В свете "промоторной" гипотезы онкогенеза /59,3/, инсерция МДГ-элементов рядом с протоонкогенами может вести к их активации и клеточной трансформации. Можно также предположить, что активация других генов иногда оказывается полезной для организма в целом, создавая для него селективные преимущества.

Таким образом, очевидно, что МДГ-элементам принадлежит существенная роль в мутагенезе. Более того "размножение" подвижных генетических элементов может в определенных случаях происходить в форме взрыва, являясь, скажем, результатом инфекции организмов вирусоподобными факторами, обеспечивающими, например, клетки энзи-мологическими системами для транспозиции /102,112,122/. При этом, в результате большого числа одновременных геномных изменений между организмами могут возникнуть существенные генетические различия, не совместимые с последующими скрещиваниями между ними. Таким об-

_ 44 -

разом, транспозоны могут участвовать в процессе видообразования. Все эти гипотезы требуют экспериментальной проверки. Можно, однако, думать, что хотя ннсерционные элементы генома и являются "геномными паразитами", их последовательности могут иногда служить для осуществления ряда клеточных функций.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ I. Ферменты, меченые предшественники, реактивы и материалы

Рестрикционные эндонуклеазы EcoRI, Hindlll, BamHI, BsuRl, Білої Bspl, Xhol, PstI , а также ДЖ фага Я были получены от А.А.Яну-лайтиса (ВНИИ прикладной энзимологии Главмикробиопрома) и с завода ферментных препаратов Главмикробиопрома (г.Вильнюс). Рестрикционные эндонуклеазы Bglll и Pvull были получены от Р.Хечумяна из нашей лаборатории, а ДНК-полимераза I была любезно предоставлена Р.Бибилашвили (ВКНЦ АМН СССР).

Кроме этих ферментов в работе использовали ДНКазу, РНКазу А ( Worthington , США), проназу, свободную от нуклеазной активности, протеиназу К ( Calbiochem , США) и лизоцим (СССР).

В качестве предшественника для мечения ДНК в культуру клеток дрозофилы вводили ^с1ї-тимидин с удельной радиоактивностью примерно 20 кюри/ммоль (Изотоп, СССР), а для мечения РНК - %-уридин с удельной радиоактивностью 20 кюри/ммоль (Изотоп, СССР).

Для ферментативного мечения ДНК использовали о{ -Ч? -дез-оксинуклеотидтрифосфаты с удельной активностью 3000 кюри/ммоль (Amersham , Англия) и с удельной активностью 1000 кюри/ммоль (Изотоп, СССР).

Для наращивания E.coli использовали дрожжевой экстракт, пептон, бактотриптон, казаминовые кислоты (все фирмы Difco , США). Антибиотики хлорамфеникол и ампицилин были отечественного производства.

В работе также использовали следующие реактивы: трис, доде-цилсульфат натрия, дитиотреитол, бромистый этидий, бромфеноловый

синий, поливинилпиролидон, бычий сывороточный альбумин (все фирмы Sigma , США), Brijj 58, дезоксихолат, ЭДГА ( Serva , фрг), Тритон Х-100 ( Ferak , Берлин), фикол ( Pharmacia , Швеция), формальдегид и формамид ( Fluka _t ФРГ).

Немеченые предшественники для синтеза ДЖ in vitro были фирмы Sigma , США..

Для фракционирования нуклеиновых кислот использовали агарозу ( Sigma , США И Bio-Kad , США).

В работе были использованы следующие смолы: дауэкс AG50WX8, биогель AI5M ( Bio-Had , США), сефадекс G-50 и поли(У)-сефароза ( Pharmacia , Швеция).

Для переноса денатурированной ДНК и РНК из агарозных гелей и фиксации их на нитроцеллюлозных фильтрах использовали НА и GS фильтры (Millipore , США) и фильтры фирмы Schleicher & Schuell.

В работе также использовали фильтры gfa, gfb, gfc и ватман ЗЩ (Whatman , США). Для получения радиоавтографов использовали рентгеновскую пленку PM-I и экраны ЭУ-ВЗА (СССР).

Просчет радиоактивности вели в сцинтилляционных счетчиках SL 30 и SL 40 ( Inter technique , Франция).

Ультрацентрифугирование проводили на центрифугах Spinco 50L (Австрия) и К32 (СССР).

2. Клетки и среды.

Наращивание плазмиды pBR322 и рекомбинантных плазмид в клетках E.coli KI2 802 гК~ тк⁺ проводили согласно методу Тана-ки /128/. Клетки растили в течение ночи в ь-среде, содержащей 1% дрожжевого экстракта, 0,5$ NaCl и 0,5$ пептона, рН 7,1. Ночную культуру разбавляли в 30 раз средой М 9, содержащей 0,1$ NH^ci ;

0,75$ Na₂HP0₄ J 0,3$ KH₂P0₄ ; 0,5$ NaCl ; 0,005$ MgS0₄ ; 0,022$ СаСІ^'б^О; 0,2$ глюкозу; 0,5$ казаминовых кислот, рН 7,1. Культуру инкубировали 2 часа при интенсивной аэрации до 0д_00нм = = 0,8-1, затем добавляли хлорамфеникол (170 мкг/мл) и наращивание продолжали еще 8-Ю часов. Все процедуры роста проводили при 37С, среда во всех случаях содержала ампицилин (50 мкг/мл).

ДНК и РЖ Drosophila melanogaster выделяли из культуры клеток диплоидной линии 67J 25D /130/. Клетки получали из лаборатории Н.Г.Щуппе (Институт общей генетики).

3. Получение ДВК

Все процедуры по выделению ДНК и РНК за исключением специально оговоренных, проводили при 0^С. Плазмидную ДНК получали щелочным методом /23/. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок промывали раствором, содержащим 0,1 М NaCl , 10 мМ трис-НСІ, рН 7,8 и І мМ ЭДГА и вновь осаждали центрифугированием. Осадок суспендировали в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-НСІ, рН 8,0, 10 мМ ЭДГА и 5 мкг/мл лизоцима (все объемы добавляемых растворов приводятся на 500 мл исходной культуры) и выдерживали 5 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 20 мл раствора, содержащего 0,2 н NaOH, 1$ додецилсульфата натрия, осторожно перемешивали и выдерживали 10 минут. Полученный лизат нейтрализовали 15 мл З М ацетата натрия, рН 4,8, в течение 30 минут. От хромосомной ДНК освобождались центрифугированием при 6000 об/мин в течение 50 минут. Плазмидную ДНК из супернатанта осаждали добавлением 0,6 объема изопропанола или 2,5 объемами этилового спирта. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15

минут, промывали 70% спиртом и высушивали.

Осадок растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трис-НСІ, рН 8,0, I мМ ЭДГА, добавляли бромистый этидий (100 мкг/мл) и OsCl (I г/мл). От остатков хромосомной ДНК освобождались центрифугированием на центрифуге К32 при 50000 об/мин, 28 часов при 18С. Фракцию, содержащую суперспирализованную плазмидную ДЕК отсасывали при ультрафиолетовом освещении и наносили на колонку, содержащую биогель AI5M (нижний слой, высотой 15 см) и натриевую форму смолы дауэкс AG50Wx8 (верхний слой, высотой 5 см). Колонку предварительно уравновешивали раствором, содержащим 0,5 М NaCi , 10 мМ трис-НСІ, рН 7,4, I мМ ЭДГА. Этот способ позволяет в один этап очистить ДЖ от РНК, CsCl и бромистого этидия. Затем ДНК диализовали против нескольких смен І мМ трис-НСІ, рН 7,4, 0,2 мМ ЭДГА.

ДЇЇК D. melanogaster ИЗ мух линии Oregon ЕС и S"bw^a , а также из слюнных желез личинок была предоставлена Е.Ананьевым (Шститут общей генетики). Из культуры клеток ДНК выделяли следующим образом. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут, промывали раствором Хэнкса, суспендировали в 0,1 М NaCi , 0,01 М трис-НСІ, рН 7,5, 0,01 М ЭДГА, после чего добавляли к ним додецилсульфат натрия до 0,5%.

После инкубации лизата с проназой (200 мкг/мл) в течение 3 часов при 37С проводили тщательную депротеинизацию фенолом и хлороформом. После переосаждения спиртом к ДНК растворенной в 0,14 м NaOl , 0,01 М трис-НСІ, рН 7,5, добавляли панкреатическую РНК-^азу (50 мкг/мл) и инкубировали ее I час при 37С. Затем к смеси добавляли проназу (100 мкг/мл) и через два часа после этого проводили повторную депротеинизацию, после чего переосаждали ДНК

спиртом. Диализ полученной ДНК проводили против 10 мМ трис-НСІ, рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА. Полученные препараты имели размер не менее 30^0 тпн.

Выделение кольцевой ДНК из дрозофилы осуществляли по методу Хирта /67/ с некоторыми модификациями. Клетки (^10 ) осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут. Осадок промывали раствором Хэнкса, суспендировали в 240 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-Н01, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА, добавляли 36 мл 10$ додецилсульфата натрия и 140 мл З М Nad , полученную смесь оставляли на ночь при 0С. От образовавшегося осадка освобождались центрифугированием при 25000 об/мин (ротор SW -27) в течение I часа. К супернатанту ( 400 мл) добавляли 100 мл 0,2 н NaOH и выдерживали 15 минут при комнатной температуре. Затем проводили нейтрализацию добавлением 20 мл 4 М ацетата калия, рН 7,0. Полученную смесь просветляли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 50 минут. К супернатанту добавляли 1100 мл этилового спирта, инкубировали 2 часа при 0С и затем центрифугировали 10 минут при 4000 об/мин. Осадок растворяли в 70 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-НСІ, рН 7,5, 10 мМ ЭДГА, 1% додецилсульфата натрия, 0,15 М NaCl , после чего проводили тщательную депротеинизацию фенолом, смесью фенол:хлороформ и хлороформом. После последней де-протеинизации к водной фазе добавляли 2,5 объема спирта и оставляли на ночь при 0С.

Спиртовой осадок ДНК собирали центрифугированием и растворяли в 50 мл 20 мМ трис-НСІ, рН 7,4, 10 мМ ЭДТА и добавляли туда 22 г ацетата натрия. Высаливание проводили в течение 3 часов при 0С после чего проводили центрифугирование при 5000 об/мин в течение 20 минут, супернатант разбавляли в 2 раза водой и к нему

добавляли 2,5 объема спирта. Образовавшийся осадок растворяли в 20 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА и добавляли 5 мл 0,2 н NaOH . Полученную смесь инкубировали 15 минут при 20С и затем к ней добавляли ацетат калия до нейтрализации, после чего к смеси добавляли бромистый этидий до концентрации 400 мкг/мл и хлористый цезий до 50$. Затем проводили центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия при 33000 об/мин в течение 60 часов при 18С. После окончания центрифугирования пробирки раскапывали по фракциям и в каждой фракции определяли количество метки, а также плотность (по рефрактометру). Затем ДНК во фракциях разбавляли водой в 3 раза и осаждали спиртом. Осадок собирали центрифугированием при 30000 об/мин в течение I часа (ротор SW-40), растворяли в буфере, содержащем 0,15 М NaOl , 10 мМ трис-НСІ, рН 7,4, 5 мМ ЭДГА и переосаждали спиртом. В конечном итоге ДНК растворяли в 0,3 мл 10 мМ Трис-НСІ, рН 7,5, 0,2 мМ ЭДТА. Из каждой зоны отбирали аликвоты по 10 мкл и анализировали их с помощью электрофореза в агарозном геле и после последующей гибридизации выявляли зоны, содержащие суперспирализованную ДНК.

4. Обработка ДНК энзимами и энзиматические методы

мечения ДНК.

Обработку ДНК рестрикционными эндонуклеазами EcoRI, Hindlll, ВатШ, Pstl, Xhol, BsuBl или Bsp, Bglll проводили 3 часа при 37С в рестрикционном буфере, содержащем 50 мМ ^NaCJl , 10 мМ трис-НСІ, рН 7,5, 10 мМ MgCl2 , 10 мМ дитиотреитола и бычий сывороточный альбумин (20 мкг/мл). Реакцию останавливали нагреванием 5 минут при 65С. После этого к пробам добавляли в количестве 1/5 от их объема раствор, содержащий 50$ глицерина, 5 мМ ЭДТА,

рН 7,5 и 0,05% бромфенолового синего и проводили разделение полученных фрагментов в агарозном геле.

Для получения высокомеченных препаратов метку в ДНК вводили методом замещения с использованием ДНК-полимеразы I и ДНКазы /107/. Реакционная смесь содержала 50 мМ трис-HGI, рН 7,8, 5 мМ MgClp t 5 мМ дитиотреитола, 20 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,5-0,05 мкг ДНК. В качестве меченых предшественников ис-пользовали один или несколько о< - Р -НТФ. Немеченые предшественники брали в концентрации 10 мкМ. Реакцию инициировали 1-2 единицами ДНК-полимеразы I, содержащей ДНКазу I, и вели реакцию в 10-20 мкл при І5С в течение 1-3 часов. После окончания реакции в смесь добавляли 30 мкл буфера, содержащего 0,1 М NaCl , ю мМ трис-НСІ, рН 7,5, 5 мМ ЭДТА, 0,25% додецилсульфата натрия, и наносили на микроколонку, уравновешенную тем же буфером (смола се-фадекс G-50 грубый). Для отделения ДНК от невключившейся метки материал пропускали через колонку с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 3 минут, затем колонку промывали 20 мкл того же буфера. Меченый материал разбавляли раствором, содержащим 10 мМ трис-НСІ, рН 7,5, до нужного объема, денатурировали кипячением, быстро охлаждали во льду, добавляли 20 SSC до 2 ssc и использовали для гибридизации.

5. Фракционирование ДНК

Препараты ДНК фракционировали в плоских горизонтальных ага-розных гелях (0,7^-3%) по методу Шарпа и соавторов /118/. ЭД)ер для электрофореза имел состав: 40 мМ трис-НСІ, рН 7,4, 5 мМ ацетат натрия, I мМ ЭДТА. Электрофорез вели при 18-30 вольтах в течение 10-12 часов. После прекращения электрофореза гель прокрашивали

бромистым этидием, фотографировали в ультрафиолетовом свете, и затем дЖ переносили из агарозы на нитроцеллюлозные фильтры по методу Сазерна /120/. Гель для денатурации ДНК инкубировали I час в растворе 0,5 н NaOH , 1,5 М NaOl . Нейтрализацию проводили I час в растворе, содержащем I М трис-HCI, рН 7,5, I М NaCl . Затем гель вымачивали в растворе 6 sso , переносили на ватман ЗШ, смоченный 6ssc , прокладывали его с обеих сторон пластмассовыми прокладками, сверху на гель клали нитроцеллюлозный фильтр, обработанный горячей водой и смоченный 6 ssc , сверху помещали стопку сухой фильтровальной бумаги и небольшой груз. В ванночку, где находился гель наливали 6SS0 и с помощью фитилей подавали 6ssc постоянно на ватман. Процедура переноса ДЕК продолжалась в течение 10-12 часов. Нитроцеллюлозный фильтр затем высушивали под вакуумом 2-3 часа при 80С.

Для препаративного выделения фрагментов ДНК использовали метод замораживания-оттаивания /136/. После визуализации полос ДНК в геле под ультрафиолетовым светом их вырезали, помещали в конические пробирки и несколько раз подвергали замораживанию при -70С и оттаиванию при комнатной температуре. Затем размороженные куски поднимали в пробирке на 2-3 см и отжимали шпателем. Отжатую агарозу переносили в гомогенизатор Даунса ., заливали 1-2 мл элек-трофорезного буфера и таким же объемом фенола, гомогенизировали смесь и оставляли на ночь при 0С. Агарозу осаждали центрифугированием, водную фазу объединяли с жидкостью, выделенной из агарозы после ее отжатия шпателем, добавляли NaCl до 0,5 Ми несколько крупинок Дауэкса AG50Wx8 (Na-форма) для удаления бромистого этидия. От смолы освобождались центрифугированием. Супернатант, содержащий экстрагированную ДНК концентрировали упариванием на

роторном испарителе, после чего диализовали его против I мМ трис-HCI, рН 7,5, 0,2 мМ ЭДТА. Затем упаривали досуха, сухой остаток промывали 70$ спиртом, высушивали и растворяли в небольшом объеме І мМ трис-НСІ, рН 7,5, 0,2 мМ ЭДТА.

6. Получение РЖ

Выделение суммарной клеточной РНК проводили по методу Шерре-ра и Дарнелла /115/. Клетки (^4*10 ) суспендировали в 30 мл 0,14 М NaCl , добавляли додецилсульфат натрия до 1% и встряхивали 20 секунд. Затем приливали равный объем нагретого до 65С фенола, рН 5,0, насыщенного 0,1 М ацетатом натрия. Смесь встряхивали при 65С 3 минуты, быстро охлаждали и центрифугировали 10 минут при 5000 об/мин. Водную фазу отбирали, а интерфазу суспендировали в 0,14 м NaCl, дважды экстрагировали горячим фенолом. Водные фазы после трех экстракций объединяли и тщательно депро-теинизировали фенолом, рН 8,0, и хлороформом. РЖ из водной фазы переосаждали несколько раз спиртом и осадок подсушивали вакуумом. РЖ растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трис-НСІ, рН 7,4, 2 мМ Mgci₂ и обрабатывали ДЖазой I (100 мкг/мл) в течение I часа при 37С, после чего добавляли ЭДТА до 5 мМ, NaCl до 0,2 М и РНК переосаждали спиртом. Цитоплазматическую поли(А)⁺РЖ выделяли из суммарной клеточной РЖ. Для этого спиртовой осадок РЖ подсушивали, растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трис-НСІ, рН 7,4, 0,1 М NaCl , 5 мМ ЭДГА, 0,25$ додецилсульфата натрия, так, чтобы концентрация РЖ была не более 200 мкг/мл и наносили при комнатной температуре на колонку с поли(У)-сефарозой, предварительно уравновешенную этим буфером. Материал пропускали через колонку дважды, поли(У)-сефарозу промывали 10 объемами буфера, после чего поли(А)⁺-РЖ элюировали при 50С буфером, содержащем 10 мМ трис-НСІ, рН

7,4, 0,25$ додецилсульфат натрия и I мМ ЭДТА. Поли(А) РНК переосаждали спиртом.

Для получения "Чїчуієчєной РНК в одну чашку (^2*10 клеток в 20 мл) вносили 5 мкюри ^-уридина за 40 минут до начала выделения (короткая метка) и за 20 и за 4 часа до выделения (долгая метка).

7. Фракционирование РНК

Фракционирование РНК проводили с помощью электрофореза в 1$ агарозном геле в присутствии формальдегида /86,64/. Агарозу расплавляли в воде, охлаждали до 60С и добавляли 0,1 М NaHgPO^. рН 7,0 до 0,01 М и формальдегид до конечной концентрации 2,2 М (6,5$). РНК, 200-400 мкг, в растворе, содержащем 0,01 М NaH₂P0₄рН 7,0, 6,5$ формальдегид и 50$ формамид прогревали 15 минут при 55С, добавляли І/І0 от объема пробы раствор, содержащий 50$ глицерин, I мМ ЭДТА, 0,4$ бромфенолового синего и затем РНК вносили в лунку геля шириной 5-Ю см. Электрофорез проводили при 5-Ю в при постоянном перемешивании буфера (0,01 М NaHgPO/,., рН 7,0) в ванночках в течение 10 часов. Длина геля составляла 20 см. В качестве маркеров использовали рестриктированные фрагменты ДНК известной длины. Определение положения маркеров осуществляли с помощью гибридизации. После окончания фореза гель отмывали от формальдегида, выдерживая его несколько раз по 5 минут в воде. Затем гель вымачивали 45 минут в 50 мМ NaOH , 10 мМ NaCl при комнатной температуре, после чего нейтрализовали 0,1 М трис-НС1, рН 7,5. Далее гель выдерживали І час в 20 ssc и осуществляли перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр аналогично переносу ДНК за исключением того, что использовали 20 SSC , в течение 10-12 часов.

Далее фильтр споласкивали в 3 SSC , высушивали на воздухе и затем под вакуумом при 80С в течение 2-3 часов.

8. Гибридизационные эксперименты

Высушенные фильтры с фиксированной на них ДНК инкубировали в течение ночи в 5-кратном растворе Денхардта, содержащем /40/ 0,01% поливинилпиролидон, 0,01% фикол, 0,01% бычий сывороточный альбумин и 2SS0 . Гибридизацию вели по методу Гилеспи и Спигель-мана /63/ на нитроцеллголозных фильтрах в 2 SSO , 0,2% додецилсуль-фате натрия, 2-кратном денхардте при 65С в течение 24 часов. В гибридизационную пробу добавляли также 100 мкг/мл дробленой денатурированной ДНК спермы лосося. В случае гибридизации с РНК в качестве конкурента добавляли 100 мкг/мл поли(А). В опытах по определению числа копий клонированных фрагментов в геноме дрозофилы, когда проводился количественный обсчет гибридизации меченой ДНК дрозофилы с ДНК клонов, иммобилизованной на фильтрах, меченую ДНК предварительно деградировали инкубируя ее при І00С в 0,3 н щелочи в течение 15-30 минут с дальнейшей нейтрализацией. Размер ДНК в этом случае составлял 100-300 пн. ДНК для иммобилизации на фильтрах выдерживали в растворе, содержащем 0,5 н НаОН I час при 37С в объеме 0,4 мл. Затем добавляли 7 мл раствора, содержащего 6 ssc, 5% формальдегид и 0,4 мл I М КНг>Р0₄ и сажали на холоду денатурированную ДНК на нитроцеллюлозные фильтры, помещенные на тефлоно-вые воронки.

Фильтры с фиксированной на них РНК инкубировали в течение ночи при 37С в растворе, содержащем 50% формамид, 2SS0 , 0,2% додецилсульфат натрия, 5-кратный Денхардт, 0,01 М НаН₂Р0₄ , рН 7,0. Гибридизацию проводили в том же растворе с добавлением дроб-

леной денатзфированной ДНК спермы лосося (100 мкг/мл) при 37С в течение 2-3 суток.

После гибридизации фильтры многократно отмывали в растворе, содержащем 0,1 sso , 0,1$ додецилсульфат натрия при 43С. В случае гибридизации с РНК, меченной по тритию, фильтры дополнительно обрабатывали РНК-азой в 2SSC (10 мкг/мл, 30 минут, 20С) и затем отмывали их при комнатной температуре раствором 2S5C , о,2% додецилсульфат натрия. После высушивания фильтры либо просчитывали в сцинтилляционном счетчике, либо проводили радиоавтографию, используя рентгеновскую пленку PM-I с экранами ЭУ-ВЗА при -70С.

РЕЗУЛЬТАТЫ

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЩИ

Ранее в нашей лаборатории в ходе экспериментов по отбору клонированных последовательностей ДЖ дрозофилы, гибридизующихся с дцРНК D.melanogaster , наряду с клонами, содержащими полные копии ВДГІ и ВДГЗ, был получен также клон рП, несущий фрагмент ДНК дрозофилы Дм-П, который представлял собой неполный ген, названный ВДИ. В дальнейшем этот фрагмент ДНК (ДмІІ) был использован для получения полной копии ВДГ4. Была сконструирована Bam HI библиотека клонов, содержащих ДНК, выделенную из культуры клеток дрозофилы, из которой затем с помощью гибридизации с ДмІІ были изолированы клоны рШ и рП2, фрагменты ДНК которых ДяІІІ и Дм112 содержали полные копии ЩГ4.

I. Рестриктное картирование и определение числа копий ОДГ4 в геноме D. melanogaster

Для определения положения сайтов узнавания различных рестрик-таз ДНК клонов рШ и рП2 обрабатывали рестриктазами EcoRl , Hindill , Bglll _lBamHl , PstI и Xhol в различных сочетаниях. ДНК затем фракционировали с помощью электрофореза в агарозном геле и определяли размер фрагментов по маркерам известной длины. В качестве маркеров использовали ДНК фага Л и вируса SV-40, обработанных Hindill . В результате были построены рестриктные карты ДНК ДмШ и ДмП2, которые представлены на рис. 5.

Как видно из рис. 5 общий для ДмШ и ДМІ2 фрагмент, соответствующий ВДГ4 имеет длину ^7,5 тпн. Никаких различий в рес-триктной карте между этими двумя копиями ВДГ4 не наблюдается, в

» - *

^ГГ Dm 11

Н ИР 6ХЯЯН

I и—-

Ьшйврахя н нр ьхВя

і * і—*-<—t 1 (і і

-*»' Ukb '*.

DmHI

2 2kb 2.8 kb

bmA RRPP H ЛХ R H HP &JK B*.

——~r"~ — *- r=r Dm 112

МДГА

Ьг^ВатИІ H-Hindlll 6-BglII

r EcoRl p- PstI x -Xhol

Рис. 5. Рестриктные карты клонированных фрагментов ДНК D. melanogaster , содержащих ЩГ4.

то время как фланкирующие последовательности - различны. ВДГ4 ограничен с обеих сторон двумя ДКП, ориентированными в одном направлении. Это следует из взаимного расположения сайтов Bglll и Xhol , а также из опытов по перекрестной гибридизации, в которых рестриктиые фрагменты из правого конца МДГ4 гибридизовали с фрагментами из левой части ВДІ4. Из этих опытов мы оценили длину ДКП ^500 пар нуклеотидов, что в дальнейшем было подтверждено секвенированием ДКП и прилежащих к ним участкой ВДГ4 /153/.

Для определения числа копий ЩГ4 в геноме дрозофилы мы гибридизовали малые количества высокомеченой 'ЧР-ДНК D.melanogaster , выделенной из культуры клеток и из мух линий Oregon ЕС и gtw^aс избытком иммобилизованного на фильтрах Xhol фрагмента ВДГ4. Величина этого фрагмента составляет 7 тпн и он почти полностью охватывает ВДГ4 (рис. 5). Величины c₀t были достаточно велики, чтобы достигнуть полного связывания всей способной к гибридизации , меченой ДНК. Для контроля проводили повторную гибридизацию несвя-завшейся метки с новым фильтром, содержащим Xhol -фрагмент ЩГ4, чтобы убедиться, что уже в первом цикле вся способная к связыванию меченая ДНК уже сгибридизовалась. Для максимально точной оценки числа копий меченую ДНК дробили щелочью до средней величины 150-200 пар нуклеотидов. В качестве контроля, в этих же экспериментах определялось число копий ВДЕТ» ВДГЗ и рибосомного гена. В таблице 3 приведены результаты этих экспериментов. Число копий рассчитывали исходя из цроцента связавшейся метки и размеров ДНК, иммобилизованной на фильтре и гаплоидного генома дрозофилы (1,6*10 тпн). Для МДП и ВДГЗ число копий совпало с определенным ранее, а для рибосомного гена - с известным из литературы.

Как видно из таблицы 3 число копий ВДГ4 в геноме дрозофилы

Таблица З

Определение числа копий ВДГ в геноме дрозофилы. Приведены значения % связывания тотальной ДНК {%) и примерное число копий ВДГ (п ).

Размер в тпн

rw -рл Культура клеток Oregon RC 67«J 25D

мух линий Oregon EC и gtw^a составляет 19 копий, а в культуре клеток - 170. Таким образом, подобно другим мобильным диспергированным генам, чиоло копий ВДГ4 в культуре клеток возросло по сравнению с мухами ^ в 10 раз, что говорит об амплификации ВДГ4 в клетках дрозофилы, культивируемых in vitro. .

2. Организация ВДГ4 в геноме дрозофилы.

Рис. 6. Гибридизация ТР- меченых фрагментов ДНК ВДГ4 с нитро-целлюлозными фильтрами, содержащими рестриктированную ДНК дрозофилы, выделенную из культуры клеток линии 67 J25D (а) и из мух линии Oregon ЕС (в). В качестве гибридизационных проб использовали I -Hindlll-EcoRI -фрагмент, 2 - Hindlll - фрагмент, 3 - Xhol -фрагмент МДТ4. В качестве маркеров использовали ДНК фага Л , обработанную Hindlll.

тпн)-фрагментами ВДГ4. На рис. 6 представлены результаты этих экспериментов.

Мэжно видеть, что наряду с полноразмерными копиями, величиной в 7 тпн имеются рестриктные фрагменты большей или меньшей величины, причем доля этих рестриктных фрагментов повышена для ДНК из мух, по сравнению с ДНК из культуры клеток. По-видимому, это не случайно и связано с тем, что при переводе клеток дрозофилы в культуру только полноразмерные копии ЩГ ашлифицировались. Интересно, что в случае мух Oregon НО , кроме основного рес-трикта длиной 7 тпн, большинство остальных Bgili- и xhol -рес-триктов не совпадают друг с другом по величине. Таким образом, появление этих фрагментов ДНК не связано, по-видимому, с удалением или инсерцией последовательностей ДНК в теле ЩГ4. Наиболее вероятно здесь предположить, что в геноме дрозофилы имеются последовательности, гомологичные тем или иным участкам ЭДДГ4. Этот вывод следует из анализа гибридизации Bgili- и Jhoi- рестриктов ДНК дрозофилы с Hindlll- и flindlll-EcoRI - фрагментами МДТ4 (рис. 6). Действительно, можно видеть, что наряду с общими для этих двух фрагментов f/ДГ, имеются полосы, которые появляются только лишь при гибридизации с одним из них. Не исключено также, что минорные полосы соответствуют последовательности, которые являются сильно дивергированныгли вариантами ВДГ4.

Если провести подобный анализ с рестриктами ДНК из культуры клеток, то, помимо общей основной полосы, размером 7 тпн, обнаруживается еще целый ряд общих полос в дорожках с ДНК, рестриктиро-ванной Bgili и Xhol . По-видимому, в этом случае мы имеем дело с копиями ВДГ4, в которых произошли делеции или инсерции некоторых последовательностей ДНК.

3. Организация ВДГ4 в различных типах клеток D, melanogaster Е.В.Ананьевым были проведены эксперименты по гибридизации in situ МДТ4 с политенными хромосомами дрозофилы, которые показали, что на политенных хромосомах мух линии Oregon ЕС имеются 2 места гибридизации, а в хромосомах мух линии gtw^a - 4. Ив том и в другом случае активно также метился хромоцентр. Как видно из табл. З для МДТ4 наблюдается несоответствие между числом копий ВДГ4 в геноме дрозофилы и числом мест гибридизации на политенных хромосомах, хотя для МДП и ЩГЗ эти характеристики примерно совпадали. Можно предположить несколько альтернативных объяснений этих данных. Одно из них заключается в том, что ЩГ4 представлен в хромосомах тандемно организованными копиями, другое, - что ВДГ4 может недореплицироваться при политенизации хромосом в слюнных железах. Необходимо также учитывать, что, как показано наїли (рис. 6), в геноме дрозофилы имеется большое число последовательностей, гомологичных некоторым участкам ЩГ4.

Для того, чтобы выяснить, все ли копии ВДГ4 реплицируются при политенизации хромосом, мы обрабатывали ДНК, выделенную из мух

_{и b}

12 3 А 2 З

Рис. 7. Гибридизация *Т-меченых фрагментов ДНК ВДГ4 с нитро-целлюлозными фильтрами, содержащими обработанную рест-ржтазой ватШ ДНК, выделенную из различных клеток D.melanogaster. В качестве гибридизационных проб использовали a) Xhol -фрагмент, в) Hindlll -фрагмент ДНК ЩГ4. ДНК была выделена из I - эмбрионов, 2 - слюнных желез личинок, 3 - взрослых мух, все линии Oregon RC. В качестве маркера использовали ДНК фага J , обработанную BamHI .

линии Oregon ЕС , из эмбрионов и из слюнных желез личинок рестриктазой BamHi, которая не имеет сайтов узнавания внутри ВДГ4 (рис. 5), фракционировали ее электрофорезом в агарозном геле, затем переносили на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с 'т-мечеными Xhol-фрагментом (7 тпн) и Hindlii-фрагментом (1,7 тпн) ВДГ4. (рис. 5). Результаты этих экспериментов представлены на рис. 7.

Несколько выводов молено сделать из этих экспериментов: I) Число сильных полос примерно совпадает с числом мест гибридизации на политенных хромосомах. Особенно четко это видно на препаратах ДНК из слюнных желез. 2) Помимо сильных полос можно видеть ряд более слабых. На препаратах с ДНК из слюнных желез их число снижено по сравнению с остальными препаратами ДНК. По-видимому, исчезновение ряда полос связано с недорепликацией некоторых последовательностей, гомологичных ЩГ4 при политенизации хромосом в слюнных железах. 3) Некоторые из слабых полос видны только при гибридизации с Xhol -фрагментом ЩГ4, но их не видно при гибридизации с Ніпйігцррагментом. Эти данные также подтверждают предположение, что отдельные участки ВДГ4 гомологичны некоторым последовательностям дрозофилы, которые в целом не являются ВДГ4. Опыт, проведенный аналогичным образом с ДНК из мух линии gtw³- , обработанной рестриктазой BamHl , также показал, что число сильных полос гибридизации примерно совпадает с числом мест гибридизации ЩГ4 на политенных хромосомах дрозофилы, если не учитывать хромоцентра.

4. Амплификация ВДГ4 в культуре клеток D,melanogaster

Как уже отмечалось, в культуре клеток дрозофилы происходит амплифжация ІУЩГ4. Кроме того, опыты по гибридизации геномной ДНК дрозофилы с фрагментами МДТ4 показали, что не все копии этого гена идентичны друг другу, и что в культуре клеток амплифицируют-ся только полноразмерные копии, имеющие Xkol -фрагмент величиной 7 тпн. В связи с этим, интересным представлялось сравнить организацию внутренних фрагментов МДТ4 в геноме мух Ът melanogaster и в культуре клеток. Для этого ДНК из мух линий Oregon ЕС и gtw^a и культуры клеток дрозофилы линии 67J 25D обрабатывали теми же рестриктазами ( EcoRI и Hindlll ), которые как было показано, имеют сайты узнавания внутри ЩГ4 (рис. 5). Затем ДНК фракционировали электрофорезом в агарозном геле и после переноса на нит-роцеллюлозные фильтры гибридизовали с внутренними фрагментами ЩГ4, которые образуются при его обработке этими же рестриктазами ( Hindlll-EcoEl - фрагмент длиной 2,2 тпн и Hindlll - фрагмент длиной 1,7 тпн). На рис. 8 представлены результаты этих экспериментов.

Можно видеть, что большинство полос в препаратах с ДНК из мух_/обработанных рестриктазой Hindiii_/ имеет размер более 4 тпн (рис. 8Ад ₅ и рис. 8В₃ ₅), причем они совпадают как для фрагмента в 1,7 тпн, так и для фрагмента в 2,2 тпн, в то же время, после дополнительной обработки рестриктазой EcoKi почти все эти полосы переходят в полосы, соответствующие фрагменту размером в 3,9 тпн,как при гибридизации с фрагментом 1,7, так и с фрагментом в 2,2 тпн. Интенсивность же полос, соответствующих самим этим фрагментам невелика (рис. 8Ад g и 8В. /). Из этих результатов следует,

что большинство копий ЩГ4 в геноме мух не содержит Hindlll сайта,

_{ч ч %}

_{Ь її}

.Ъ .- - U-f - і^

_{-I 2 3}

_і_{2 3}

Рис. 8. Гибридизация P- меченых Hindlll- (а) и Hindi 11-Е с oEl (в) -фрагментов ДІіК ВДГ4 с нитроцеллюлозными фильтрами, содержащими рестриктированную ДНК дрозофилы, выделенную из культуры клеток линии 67J 25D (І), мух линий Oregon ЕС (2), gtw^s).

Гены рибосомной 5S РНК

Единственные хорошо охарактеризованные повторяющиеся гены, ответственные за синтез белка, - гистоновые. Гистоновые гены у D.meianogaster организованы в один кластер, гибридизующийся с одним местом на политенных хромосомах /100/. Порядок расположения генов в повторяющейся единице следующий: Н1,НЗ,Н4,Н2А и Н2В. Гены гистонов разделены между собой спейсерами, самый большой из которых локализован между HI и НЗ. Всего на гаплоидный геном дрозофилы приходится около 100 повторяющихся единиц гистоновых генов /77/. Имеется два типа гистоновых повторов длиной 4750 пн и 5000 пн. Меньший отличается от большего только тем, что в нем отсутствует 250 нуіслеотидов в спейсере между НІ и НЗ. Изредка гистоновые кластеры прерываются негистоновыми последовательностями. Было обнаружено две вставки, в одном случае длиной 13,5 тпн, которая располагалась между генами гистонов Н2В и НІ; в другом -длиной 7 тпн, и локализовалась она между генами гистонов НЗ и Н4. Обе вставки не имели гомологии между собой, содержали повторяющиеся последовательности, и их можно было наблюдать при гибридизации in situ во многих местах на политенных хромосомах /90/. Природа этих вставок не известна, возможно они представляют собой мобильные диспергированные гены. Транскрипция гистоновых генов, подобно другим генам, кодирующим белки, осуществляется РНК-полимеразой II. Хотя вопрос о первичных продуктах: еще не решен, наиболее вероятно, что гистоновые гены транскрибируются независимо друг от друга, и размеры первичных продуктов для гистонов равны или немного превышают зрелую гистоновую мРНК. Интересным является тот факт, что мРНК гистонов HI, НЗ и Н2А считываются с одной цепи ДНК, а мРНК гистонов Н4 и Н2В - с другой цепи /90/. Итак, можно видеть, что множественные сгруппированные гены имеют ряд общих характерных свойств. Это гены особо важных структурных компонентов клетки, возможно этим объясняется значительная повторяемость и эволюционная консервативность этих генов. Размеры первичных транскриптов либо равны, либо не на много, не более чем в 2 раза, превышают размеры зрелой РНК. Кроме того, характерным свойством всех этих генов является то, что они окружены спейсерны-ми последовательностями, возможная роль .которых связана с регуляцией транскрипции. Наличие простых повторяющихся последовательностей указывает на вероятную роль спейсеров в процессах рекомбинации, ведущей к дупликации или делеции множественных генов, поддерживая их однородность.

Как показали недавние работы, рибосомные и гистоновые гены не всегда организованы в тандемные повторы. Было обнаружено, что у исследованных на этот предмет эукариот, в том числе и у дрозофилы, эти гены, помимо основной повторяющейся единицы, организованной в кластер, представлены также отдельными единичными последовательностями, имеющими различное окружение. Для них было предложено название орфонов (orphan -сирота) /33/. Значение этих генов не известно, возможно это псевдогены. 4. Гены тРНК В виде кластеров организованы у дрозофилы и гены тРНК. Гаплоидный геном D.melanogaster содержит 00 генов тРНК /142/. Из анализа кинетики гибридизации тРНК с ДНК следует, что тРНК представлена 60 разными семействами, каждое из которых состоит в среднем из 10 одинаковых генов. С помощью методов гибридизации in situ было показано, что индивидуальные тРНК гибридизуются по меньшей мере, с 30 участками хромосом, и что гены многих семейств сгруппированы /44/. Более детальное исследование одного из таких участков с использованием методов клонирования выявило, что в нем сгрушшровано 8 генов аспарагиновой тРНК, 4 гена аргинино-вой, 5 - лизиновой и I ген изолейциновой тРНК. Гены разделены спейсерами разной длины. Транскрипция не имела единой направлен- ности и осуществлялась с разных цепей /146/. Таким образом, определенной регулярности в организации генов тРНК, подобной организации рибосомных генов, не существует. III. МОБИЛЬНЫЕ ДИСПЕРГИРОВАННЫЕ ГЕНЫ Более 30 лет назад Б.Мак-Клинток с помощью генетических экспериментов показала, что в кукурузе имеются подвижные генетические элементы /94,95/. Позднее у дрозофилы также были обнаружены подвижные генетические элементы. Один такой описанный элемент -сегмент ДНК, несущий wc аллель локуса white /65/. другой подвижный элемент получил название ТЕ. Он значительно большего размера и часто переносит не только локус white , но и соседний локус roughest /70/. Иногда ТЕ инициирует транспозицию и других локусов, прилежащих к white и roughest Однако активное изучение подвижных элементов началось только с конца 70-х годов, когда исследователи начали интенсивно использовать методы генной инженерии /6/. Одновременно в лаборатории Георгиева и Хогнесса при отборе клонированных фрагментов ДНК дрозофилы, наиболее сильно гибриди-зующихся с цитоплазматической поли/А/+-РНК, были получены несколько последовательностей, дальнейшее исследование которых показало, что они являются представителями отдельных семейств множественных рассеянных по геному генов с варьирующей локализацией /69,18/. В американской литературе для обозначения этих последовательностей часто используется термин "copia-like elements". В настоящее время известно около 20 семейств таких генов, но наиболее изученными из них являются: ВДГІ /69,18,16,4,133,60, 8,9,13,132/, ВДГЗ /69,18,16,4,133,60,8,9,19/, copia /52,110, 127,103,45,88,117,48,56/, 412 /52,110,127,103,117,145/, 297 /52,110,127,103,68/, BI04 /116/. I. Общая характеристика структуры и организация в геноме дрозофилы ЩО? имеют размер от 5 до 8 тпн и представлены в геноме в количестве от 20 до 200 копий. Гибридизационные эксперименты не выявили никаких гомологии между представителями различных семейств. С другой стороны, практически все члены одного и того же семейства представлены в геноме идентичными по размеру и сходными по нуклеотидной последовательности фрагментами ДНК. Это было показано следующим образом.

Геномную ДЖ обрабатывали какой-либо рес-триктазой и фракционировали в агарозном геле. Затем ДНК переносили из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с мечеными клонированными копиями ВДГ. При этом наблюдали ряд полос, абсолютно совпадающих с теми, которые получаются при обработке клонированной копии ВДГ той же рестриктазой. В некоторых случаях можно было видеть слабые полосы, отличающиеся от основных. Из этого следует, что в основном все копии данного ДІЛ?, представленные в геноме D. meianogaster , идентичны, однако, есть незначительное число, отличающихся по рестриктной карте /52,8,103/. Из перечисленных выше семейств ВДГ наиболее выражена такая внутренняя гетерогенность у ВДГ 297 /60,127/. Обычно такие отличия связаны с делениями или изменениями в нуклеотидной последовательности. Описаны случаи, когда замещения негомологичными последовательностями затрагивают до 50$ всей длины ВДГ /52,103,121,83,134, ИЗ/. Эксперименты по перекрестной гибридизации внутренних фрагментов ЩО? показали, что все ВДГ имеют прямые длинные концевые повто- ры, размером 250-500 пн /52,8/. Сразу же за длинными концевыми повторами (ДКП), являющимися составной частью ЩГ, начинаются геномные последовательности, различающиеся для каждого члена данного семейства МДТ /52,8,103/. Это было продемонстрировано следующими экспериментами. В качестве гибридизационной пробы использовали краевой фрагмент клонированной копии МДГ, а геномную ДНК обрабатывали рестриктазой, которая имеет один сайт узнавания внутри этого фрагмента, а другой - снаружи, причем вне тела МДТ. Затем ДНК фракционировали электрофорезом в агарозном геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с меченой пробой.

Р-фактор и гибридный дисгенезис

К классу fold-back последовательностей можно в некоторой степени отнести и Р-элемент, который в настоящий момент интенсивно изучается. Р-элемент был выделен из Р-линий дрозофилы, где он представлен в количестве 30-50 копий на геном /21,111/. В большинстве лабораторных линий он отсутствует. Скрещивание самцов Р-линий с самками, не несущими этот фактор (М-линии) вызывает в потомстве явление гибридного дисгенезиса, которое включает в себя множественные мутации, хромосомные аберрации, а также ряд других проявлений /121/. Как оказалось, это связано с перемещениями Р-фактора. В Р-линиях перемещение Р-элемента заблокировано репрес-сором, который кодируется, по-видимому, самим Р-элементом. Реакторы гетерогенны по своей величине (0,5-3 тпн), но все они на концах несут 31 - нуклеотидный совершенный инвертированный повтор /35/, который, очевидно, и является местом действия транопоазы. Ряд данных свидетельствует о том, что транспоаза кодируется полным Р-элементом /111,122/. Р-элементы меньшего размера могут интегрироваться только в присутствии полноразмерного Р-фактора /111,122/. В настоящее время показано, что клонированный интактный Р- ЭЛемеНТ МОЖеТ бЫТЬ введен В ГеНОМ D.melanogaster (М-ЛИНИИ) НЄ- посредственно и с очень высокой эффективностью ( bCffa) путем инъекции ДНК в яйца. При этом, в геноме затем были обнаружены 1-5 копий полноразмерного Р-элемента, локализованных в разных участках хромосом. Штегрировались в геном только сами Р-элементы без окружающих их плазмидных и геномных последовательностей /122/. Показано также, что Р-элементы могут быть использованы как векторы для генетической трансформации /112/. В настоящее время известна еще одна система гибридного дис-генезиса -1-Е /78/ и выделен, подобно Р-элементу, 1-элемент. 3. Перемежающиеся повторы Существует еще один класс подвижных генетических элементов дрозофилы - перемежающиеся повторы ("scrambled sequences ), который пока еще очень слабо изучен. Протяженные последовательности этого типа предотавляют собой набор повторяющихся последовательностей генома длиной 0,2-1 тпн. Каждый такой кластер состоит из большого числа различных коротких повторов, индивидуальные последовательности внутри кластера могут встречаться как в прямой, так и в обратной ориентации. Одни и те же повторы могут встречаться в разных кластерах, но порядок чередования их и сам набор в целом строго специфичен для данного кластера.

В одном из кластеров была обнаружена рассеянная по хромосомам последовательность, повторяющаяся 1000 раз в геноме дрозофилы. Один из таких перемежающихся повторов был обнаружен на расстоянии 9 тпн от одного из генов теплового удара ( heat shock ), другой - в нитроне рибосомного гена и вблизи от ВДГ 412. Детальный анализ 4-х клонированных кластеров показал, что вместе они содержат по крайней мере 17 различных семейств повто- ряющихся последовательностей, что составляет около 25% умеренных повторов. Предполагается, что короткие повторяющиеся последовательности, входящие в состав больших кластеров, являются мобильными элементами, а их интеграция в геном наиболее эффективно проходит вблизи других таких же последовательностей /144/. У. МОБИЛЬНЫЕ ДИСПЕРГИРОВАННЫЕ ГЕНЫ В ДРУГИХ ОРГАНИЗМАХ. СХОДСТВО ВДГ С ПРОРЕТРОВИРУСАМИ. Вслед за открытием ВДГ у дрозофилы были обнаружены подобные элементы у дрожжей. В настоящее время хорошо изучено семейство ВДГ у дрожжей Ту I /30,109,89,79,49,57/. Это семейство представлено в гаплоидном геноме дрожжей 35 копиями /30/. Размер Ту I составляет 5,9 тпн /57/, на концах имеются ДКП, которые получили название 8 -повтор, длиной 338 пн /49,57/. Основной транскрипт имеет длину 5,7 тн, выявляется также еще один длиной 5,0 тн /46/. Также как и ВДГ дрозофилы, Ту I рассеян по геному, причем локализация его в различных штаммах отличается /30/. Для Ту I было показано, что могут появляться новые копии Ту I, а старые остаются на прежних местах /46/. Встраивание новой копии сопровождается дупликацией 5 нуклеотидов /49,57/. Структура ДКП очень похожа на ДКП ВДГ дрозофилы /49,57,46/. Особенностью Ту I элемента является наличие 5-нуклеотидного повтора внутри гена, непосредственно примыкающего к ДКП. Интересно также, что 8-повтор обнаруживается самостоятельно, а не только в связи с полным Ту I /30/. Ряд мутаций дрожжей связан со встраиванием этого ВДГ /109,89,126/. Некоторое сходство обнаруживается между ВДГ и транспозонами бактерий /29,106/, но пожалуй, самым интересным и поразительным является сходство мобильных диспергированных генов с провирусами эукариотических ретровирусов /17,24,11/. Наиболее ярко это выявляется при сравнении организации ДКП. Можно видеть, что все свойства ДКП ЩГ обнаруживаются и в ДКП проретровирусов /119,128/ (см. табл. 2). Для ретровирусов механизм их репликации относительно хорошо изучен (рис. 3). Известно, что после инфекции репликация вирусной РНК идет через обратную транскрипцию с последующим синтезом второй цепи ДНК, причем функцию затравки для минус-цепи выполняет одна из клеточных тРНК, а для синтеза плюс-цепи важен полипуриновый блок, расположенный вблизи одного из ДКП. В результате синтеза образуется линейная двуспиральная молекула ДНК, на обоих концах которой обнаруживаются полные последовательности ДКП. На следующем этапе линейные молекулы переходят, в кольцевые, содержащие I или 2 ДКП.

Хотя в настоящее время неизвестно какая форма молекул (линейная или кольцевая) встраивается в геном хозяина, но большинство исследователей считает, что в интеграции участвуют кольцевые молекулы проретровирусов /141а/. Для репликации вирусной РНК существенно присутствие на ее концах повторяющихся последовательностей длиной 20-60 нуклеоти-дов, что обеспечивается тем, что в ДКП последовательности, необходимые для инициации транскрипции (блоки Хогнесса) всегда предшествуют сигналам окончания транскрипции и полиаденилирования РНК (блоки ЛАТАМ) /62/. В результате в вирусной РНК на обоих ее концах находятся повторяющиеся последовательности /141а/. Как уже указывалось ранее МДГ дрозофилы также содержат районы, напоминающие участки связывания тРНК-праймера и полипуриновые блоки ретровирусов. Блоки Хогнесса у МДТ также предшествуют после- довательностям ДАТАМ. Более того, ДКП обнаруженного недавно ВДГ 17.6 имеет около 6($ гомологии с ДКП вируса лейкоза-саркомы птиц ( AL-sv ). Это позволило разделить ДКП ВДГ 17.6 на участки УП5,П и УПЗ, аналогичные таковым вируса AL-SV /83/. Этими же авторами были обнаружены в культуре клеток дрозофилы ретровирус-подобные частицы, содержащие РНК длиной 5 тн, которая гибридизовалась с ДНК МДТ copia . Эта РНК в бесклеточной системе направляла синтез полипептидов, которые осаждались сывороткой против этих ретровирусо-подобных частиц /П8а/. Очевидно, что сходство ретровирусов и ВДГ не случайно. Несомненно, что те и другие имеют родственную природу. И тут появляются две противоположные точки зрения. Некоторые авторы считают, что МДТ произошли от древнего ретровируса, заразившего предков современной дрозофилы /83/. Другие же полагают, что поскольку, вообще, мобильные генетические элементы обнаруживаются и у прокариот, то МДТ являются эволюционно более древними и ретровирусы произошли от мобильных диспергированных генов /53,135,51/. УІ. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕМЩЕНИЯ МДТ. Можно предположить два принципиально различающихся механизма перемещения мобильных элементов - механизм с участием обратной транскрипции (ревертазный путь) и механизм, заключающийся в ре-комбинационных перестройках (рекомбинационный путь). То удивительное структурное сходство, которое существует между МДТ и проретровирусами, позволяет предполагать, что образование новых копий МДТ и их интеграция в хромосомную ДНК может происходить ревертазным путем.

Организация ЩГ4 в геноме дрозофилы

Для решения вопроса о том, все ли копии ВДГ4 присутствуют в геноме дрозофилы в виде полноразмерных вариантов, мы использовали тот факт, что рестриктазы Bglli и xhol гидролизуют ДНК ВДЕ4 только по его ДКП-участкам (рис. 5). Следовательно, при обработке обеими рестриктазами полноразмерных копий ВДГ4 должны появляться фрагменты длиной около 7 тпн. Мы обрабатывали ДНК, выделенную из мух линии Oregon RO и из культуры клеток рестриктазами Bgiii и Xhol, фракционировали ее с помощью электрофореза в агарозном геле и после переноса на нитроцеллюлозные фильтры гибридизовали с ч?-мечеными Xhol-(7 тпн), Hindlll-EcoRl- (2,2 тпн) и HindIII-(l,7 тпн)-фрагментами ВДГ4. На рис. 6 представлены результаты этих экспериментов. Мэжно видеть, что наряду с полноразмерными копиями, величиной в 7 тпн имеются рестриктные фрагменты большей или меньшей величины, причем доля этих рестриктных фрагментов повышена для ДНК из мух, по сравнению с ДНК из культуры клеток. По-видимому, это не случайно и связано с тем, что при переводе клеток дрозофилы в культуру только полноразмерные копии ЩГ ашлифицировались. Интересно, что в случае мух Oregon НО , кроме основного рес-трикта длиной 7 тпн, большинство остальных Bgili- и xhol -рес-триктов не совпадают друг с другом по величине. Таким образом, появление этих фрагментов ДНК не связано, по-видимому, с удалением или инсерцией последовательностей ДНК в теле ЩГ4. Наиболее вероятно здесь предположить, что в геноме дрозофилы имеются последовательности, гомологичные тем или иным участкам ЭДДГ4. Этот вывод следует из анализа гибридизации Bgili- и Jhoi- рестриктов ДНК дрозофилы с Hindlll- и flindlll-EcoRI - фрагментами МДТ4 (рис. 6). Действительно, можно видеть, что наряду с общими для этих двух фрагментов f/ДГ, имеются полосы, которые появляются только лишь при гибридизации с одним из них. Не исключено также, что минорные полосы соответствуют последовательности, которые являются сильно дивергированныгли вариантами ВДГ4. Если провести подобный анализ с рестриктами ДНК из культуры клеток, то, помимо общей основной полосы, размером 7 тпн, обнаруживается еще целый ряд общих полос в дорожках с ДНК, рестриктиро-ванной Bgili и Xhol . По-видимому, в этом случае мы имеем дело с копиями ВДГ4, в которых произошли делеции или инсерции некоторых последовательностей ДНК.

Таким образом, полученные данные указывают, что в геноме дрозофилы помимо полноразмерных копий ЩГ4, обнаруживаются последовательности, гомологичные тем или иным участкам ВДГ4, возможно также, что это сильно дивергировавшие копии МДТ4. В культуре клеток обнаруживаются также варианты ВДГ4, в которых произошли делении или инсерции некоторых последовательностей ДНК. Кроме того, вышеприведенные данные показывают, что в культуре клеток дрозофилы доля полноразмерных копий ВДГ4 повышена по сравнению с ДНК, выделенной из мух линии Oregon ЕС. 3. Организация ВДГ4 в различных типах клеток D, melanogaster Е.В.Ананьевым были проведены эксперименты по гибридизации in situ МДТ4 с политенными хромосомами дрозофилы, которые показали, что на политенных хромосомах мух линии Oregon ЕС имеются 2 места гибридизации, а в хромосомах мух линии gtwa - 4. Ив том и в другом случае активно также метился хромоцентр. Как видно из табл. З для МДТ4 наблюдается несоответствие между числом копий ВДГ4 в геноме дрозофилы и числом мест гибридизации на политенных хромосомах, хотя для МДП и ЩГЗ эти характеристики примерно совпадали. Можно предположить несколько альтернативных объяснений этих данных. Одно из них заключается в том, что ЩГ4 представлен в хромосомах тандемно организованными копиями, другое, - что ВДГ4 может недореплицироваться при политенизации хромосом в слюнных железах. Необходимо также учитывать, что, как показано наїли (рис. 6), в геноме дрозофилы имеется большое число последовательностей, гомологичных некоторым участкам ЩГ4. Для того, чтобы выяснить, все ли копии ВДГ4 реплицируются при политенизации хромосом, мы обрабатывали ДНК, выделенную из мух линии Oregon ЕС , из эмбрионов и из слюнных желез личинок рестриктазой BamHi, которая не имеет сайтов узнавания внутри ВДГ4 (рис. 5), фракционировали ее электрофорезом в агарозном геле, затем переносили на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с т-мечеными Xhol-фрагментом (7 тпн) и Hindlii-фрагментом (1,7 тпн) ВДГ4. (рис. 5). Результаты этих экспериментов представлены на рис. 7. Несколько выводов молено сделать из этих экспериментов: I) Число сильных полос примерно совпадает с числом мест гибридизации на политенных хромосомах. Особенно четко это видно на препаратах ДНК из слюнных желез. 2) Помимо сильных полос можно видеть ряд более слабых. На препаратах с ДНК из слюнных желез их число снижено по сравнению с остальными препаратами ДНК. По-видимому, исчезновение ряда полос связано с недорепликацией некоторых последовательностей, гомологичных ЩГ4 при политенизации хромосом в слюнных железах. 3) Некоторые из слабых полос видны только при гибридизации с Xhol -фрагментом ЩГ4, но их не видно при гибридизации с Ніпйігцррагментом. Эти данные также подтверждают предположение, что отдельные участки ВДГ4 гомологичны некоторым последовательностям дрозофилы, которые в целом не являются ВДГ4. Опыт, проведенный аналогичным образом с ДНК из мух линии gtw3- , обработанной рестриктазой BamHl , также показал, что число сильных полос гибридизации примерно совпадает с числом мест гибридизации ЩГ4 на политенных хромосомах дрозофилы, если не учитывать хромоцентра. 4. Амплификация ВДГ4 в культуре клеток D,melanogaster Как уже отмечалось, в культуре клеток дрозофилы происходит амплифжация ІУЩГ4.

Кроме того, опыты по гибридизации геномной ДНК дрозофилы с фрагментами МДТ4 показали, что не все копии этого гена идентичны друг другу, и что в культуре клеток амплифицируют-ся только полноразмерные копии, имеющие Xkol -фрагмент величиной 7 тпн. В связи с этим, интересным представлялось сравнить организацию внутренних фрагментов МДТ4 в геноме мух Ът melanogaster и в культуре клеток. Для этого ДНК из мух линий Oregon ЕС и gtwa и культуры клеток дрозофилы линии 67J 25D обрабатывали теми же рестриктазами ( EcoRI и Hindlll ), которые как было показано, имеют сайты узнавания внутри ЩГ4 (рис. 5). Затем ДНК фракционировали электрофорезом в агарозном геле и после переноса на нит-роцеллюлозные фильтры гибридизовали с внутренними фрагментами ЩГ4, которые образуются при его обработке этими же рестриктазами ( Hindlll-EcoEl - фрагмент длиной 2,2 тпн и Hindlll - фрагмент длиной 1,7 тпн). На рис. 8 представлены результаты этих экспериментов. Можно видеть, что большинство полос в препаратах с ДНК из мух/обработанных рестриктазой Hindiii/ имеет размер более 4 тпн (рис. 8Ад 5 и рис. 8В3 5), причем они совпадают как для фрагмента в 1,7 тпн, так и для фрагмента в 2,2 тпн, в то же время, после дополнительной обработки рестриктазой EcoKi почти все эти полосы переходят в полосы, соответствующие фрагменту размером в 3,9 тпн,как при гибридизации с фрагментом 1,7, так и с фрагментом в 2,2 тпн. Интенсивность же полос, соответствующих самим этим фрагментам невелика (рис. 8Ад g и 8В. /). Из этих результатов следует, что большинство копий ЩГ4 в геноме мух не содержит Hindlll сайта, разделяющего эти два фрагмента в клонированных копиях МДТ4. В препаратах ДНК из культуры клеток картина совершенно иная. После обработки рестриктазой Hindlll и гибридизации с фрагментом в 1,7 тпн мы видим сильную полосу, соответствующую этому фрагменту и лишь незначительное число полос, тлеющих больший молекулярный вес, которые после дополнительной обработки рестриктазой EcoEl переходят в полосу размером 3,9 тпн (рис. 8Aj g) При гибридизации этих же препаратов ДНК с фрагментом в 2,2 тпн, практически все Hindlll -фрагменты после дополнительной обработки рестриктазой EcoRi переходят в интенсивно метящуюся полосу, соответствующую фрагменту длиной 2,2 тпн и лишь незначительная часть дает полосу длиной размером в 3,9 тпн (рис. 8Ву ). Таким образом, в культуре клеток большинство копий МДТ4 содержат внутренний Hindlll -сайт, названный нами факультативным Hindlll -сайтом. Оуммируя все вышеизложенное следует предположить, что в культуре клеток дрозофилы произошла амплификация только той (тех) копии МДТ4, которые содержат факультативный Hindlll-сайт.

Кольцевая сверхспирализованная ДНК дрозофилы

Вообще, кольцевая сверхспирализованная ДНК в клетках D.meianogaster была обнаружена еще в 1976 году Стэнфилдом и Хелин-ским /123/. Они показали, что в яйцах, а также в культуре клеток линии Schneider-2 и сублинии этой линии имеются кольцевые молекулы ДНК, гетерогенные по своему размеру. В культуре клеток их размер варьировал от 0,09 до 7,3 мкм (средний размер - 1,1 мкм), большинство молекул имело размер I мкм и менее. В основном кольцевая ДНК обнаруживалась в ядрах клеток в количестве 3-40 молекул на клетку, что соответствует 0,03$ от тотальной ДНК. В яйцах кольцевых молекул было значительно меньше и размер их также был меньше. В 1979 и 1980 годах Стэнфилд и Лингуел опубликовали работы /124,125/, в которых охарактеризовали общие свойства сверхспирали-зованной кольцевой ДНК дрозофилы. Они показали, что средний размер кольцевых молекул ДНК составляет 3,3 тпн, что 82$ кольцевой ДНК имеет кинетическую сложность 1,8x10 н.п. и 18$ - значительно более высокую. Эти кольцевые молекулы ДНК гибридизуются с умеренно повторящимися последовательностями хромосомной ДНК. Исследование термоустойчивооти образующихся гибридов выявило, что ошибки спаривания не превышают 2$. Эти авторы исследовали также РНК, гомологичную сверхспирализованной кольцевой ДНК D.melanogaster. Они показали, что транскрипты, гомологичные кольцевой ДНК присутствуют в разных фракциях РНК. Ядерная поли(А)"ьРНК, поли(А)"РНК и полисомная поли(А)+РНК дрозофилы связывали соответственно 10$, 7% и 20% кольцевой ДНК, меченой in vitro . Последовательностей, комплементарных сверхспирализованной ДНК в 10 раз больше в ядерной поли(А)+РНК, чем в поли(А)" РНК или полисомной поли(А)+РНК, совсем не было обнаружено гомологии между сверхспирализованной ДНК и цитоплазматической поли(А)""РНК. Авторы предположили, что, возможно, сверхспирализованной ДНК дрозофилы - промежуточное звено в процессе перемещения мобильных генов. 3. Обнаружение и характеристика кольцевых молекул ДНК различных МДГ В 1981 г. Флавел и №-Хоровщ /54 / опубликовали работу, в которой показали, что в культуре клеток D. melanogaster линии Кс имеются кольцевые молекулы ДНК, комплементарные МДГ Они показали, что имеется два типа кольцевых молекул ДНК - с одним и с двумя ДЮІ. Авторы также проклонировали некоторые кольцевые молекулы ДНК гена copia , и показали, что в ряде случаев в молекулах, содержащих 2 ДКП между последними имеется несколько нуклео-тидов хозяйской ДНК.

На основании этого они делают предположение, что перемещение ІДДГ copia происходит рекомбинационным путем. В настоящей работе представлены данные по обнаружению сверхспирализованной кольцевой ДНК, комплементарной различным ВДГ в двух линиях культуры клеток дрозофилы - 67 j25 D , из которой были клонированы ВДП, ВДГЗ и ВДГ4, и линии Кс, которая была использована Флавеллом и Йп-Хоровицем для получения кольцевых молекул ДНК ВДГ copia . Нами продемонстрировано, что в обеих линиях культуры клеток дрозофилы присутствуют кольцевые молекулы МДГІ, МДТЗ и copia . ВДГ4 удалось детектировать только в линии 67 J 25 D . Исследована также общая структура кольцевых молекул, гомологичных ВДГІ, ВДГЗ и copia . Основной вопрос, который нас интересовал - количество последовательностей ДКП, присутствующих в кольцевых молекулах ВДГ. Оказалось, что в отличие от проретровирусных кольцевых молекул ДНК, кольцевые копии ВДГ имеют, как правило, І ДШ. Только для ВДГ copia в культуре клеток линии Кс нами обнаружены кольцевые молекулы, содержащие 2 ДКП, что согласуется с данными, полученными Флавеллом и Иш-Хоровицем /54,55/. 4. Возможные механизмы образования кольцевых молекул ДНК ВДГ Полученные данные можно объяснить несколькими способами. Например: 1) кольцевые молекулы ВДГ образуются в результате рекомбинации, при этом рекомбинация между ДКП происходит значительно эффективнее, чем между короткими повторами хозяйской ДНК, обрамляющими ВДГ (ДКП - 300-500 пар нуклеотидов, а дупликация - 4-6 пн) и как следствие этого образование преимущественно кольцевых молекул с I ДКП. По ряду соображений, которые будут приведены ниже, это объяснение нам кажется маловероятным; 2) .образование кольцевых молекул ДНК ВДГ происходит ревертазным путем, при этом образуются линейные молекулы с двумя ДКП, которые затем превращаются в кольцевые молекулы с одним ДКП, а образование кольцевых молекул с двумя ДКП по каким-либо причинам не происходит. Нельзя также исключить, что молекулы с двумя ДКП образуются, но они либо очень быстро превращаются в молекулы с одним ДКП, либо очень быстро внедряются в хромосомную ДНК. Нами обнаружено также, что в культуре клеток дрозофилы линии 67 J 25 D помимо полноразмерных кольцевых молекул ДНК гена copia с I ДКП, имеются кольцевые молекулы, содержащие I ДКП и делецию размером 0,4 тпн, локализованную внутри МДГ copia и не затрагивающую ДКП. Показано также, что такие делетированные копии этого гена существуют и в хромосомной ДНК. Аналогичные данные были получены и для МДТЗ. В линии 67 J 25 D обнаруживаются кольцевые молекулы ДНК МДГЗ, содержащие І ДКП, а в линии Кс - молекулы с одним ДКП и с делецией, размером 1,3 тпн, причем никаких иных кольцевых молекул ДНК МДГЗ не обнаруживается. Показано, что делеция затрагивает внутренний EcoEi-фрагмент, включая правый EcoRI -сайт и часть правого EcoRI-Hindlll -фрагмента МДГЗ. Интересно, что такие делетированные копии имеются в хромосомной ДНК как обеих линий культуры клеток, так и трех линий мух D. melanogaster . Однако, в культуре клеток линии 67 J25 D амплифицированы и обнаруживаются в составе экстрахромосомной еверхспирализованной ДНК только полноразмерные копии МДГЗ, а в линии Кс - только делетированные. В связи с этим интересны данные, полученные нами в недавнее время. В культуре клеток линии 67 J25 D обнаруживается только поли(А)+РНК, размером л/5 тн, то есть соответствующая полноразмерным копиям МДГЗ, а в линии Кс выявляются только транскрипты размером 4 тн, то есть считывающиеся, по-видимому, с делетированных копий ЩГЗ. Эти данные указывают на связь образования кольцевых молекул ДНК, комплементарных ЩГ с синтезом РНК, и позволяют предполагать, что в культуре клеток линии Кс по каким-то причинам, транскрипция полноразмерных копий ЩГЗ не происходит, и следствием этого является избирательная амплификация делетированных копий ЩГЗ и обнаружение в составе кольцевых молекул ДНК дрозофилы только делетированных вариантов этого гена. Таким образом, можно предполагать, что амплификация и перемещение МДТ в культуре клеток происходит с участием механизмов обратной транскрипции. Однако, возникает целый ряд вопросов, касающихся избирательности транскрипции и амплификации ЩГ, которые требуют дальнейшей экспериментальной работы, и в частности, клонирования делетированных вариантов ЩГЗ, а также кольцевых молекул ДНК D.melanogaster , комплементарных МДТ с целью их дальней шего изучения и определения тонкой структуры этих молекул. Следует также иметь в виду, что процессы, протекающие в культуре клеток D.melanogaster , не могут служить полной аналогией процессам, имеющим место в клетках организма. Хотя показано, что в клетках мух происходит перемещение ЩГ, однако это - явление довольно редкое и не сопровождается заметной амплификацией МДТ. В этом направлении также необходимы дальнейшие экспериментальные разработки.

Исследование структурных хромосомных и внехромосомных копий мобильных диспергированных генов дрозофилы Любомирская Наталия Вениаминовна

Гены рибосомной 5S РНК

Р-фактор и гибридный дисгенезис

Организация ЩГ4 в геноме дрозофилы

Кольцевая сверхспирализованная ДНК дрозофилы

Похожие диссертации на Исследование структурных хромосомных и внехромосомных копий мобильных диспергированных генов дрозофилы