Введение к работе
Актуальность проблемы
В последнее время появляется все больше наблюдений, свидетельствующих о тесной связи между пространственной организацией генома и его функционированием (Holwerda et al., 2012; de Wit et al., 2012; Palstra et al., 2009). Многочисленные цитологические (FISH) и биохимические (ЗС-методы) исследования позволили продемонстрировать, что для регуляции транскрипции важным является взаимное расположение генов и их регуляторных последовательностей внутри клеточного ядра. Так, модель активаторного хроматинового блока постулирует, что пространственное сближение удаленных регуляторных элементов с регулируемыми тканеспецифичными генами обеспечивает активацию экспрессии этих генов (de Laat et al., 2003). Результаты, на основании которых была предложена данная модель, были получены с использованием метода ЗС при изучении а- и (3-глобиновых генов позвоночных. Однако демонстрация пространственной сближенности удаленных элементов генома не решает вопроса о механизмах, которые обеспечивают это сближение. Наиболее популярное объяснение заключается в том, что удаленные регуляторные элементы генома удерживаются в составе единого комплекса посредством взаимодействий связанных с этими регуляторными элементами белков (модель активаторного хроматинового блока). Однако в настоящее время отсутствуют прямые доказательства данной гипотезы. Недостаточно изученными являются не только механизмы поддержания взаимодействий удаленных областей генома, но и собственно принципы функционально-зависимой пространственной организации протяженных протяженных областей генома. В последнее время значительную роль в установлении и поддержании трехмерной организации интерфазного генома приписывают так называемым «транскрипционным фабрикам» -структурам, в которых концентрируются молекулы РНК-полимеразы и факторы транскрипции, и куда привлекаются различные гены для осуществления транскрипции. В известном смысле, транскрипционная фабрика может рассматриваться и как активаторный хроматиновый блок, так как в ее составе присутствуют промоторы и регуляторные элементы ряда генов (Osborne et al., 2004; Faro-Trindade et al., 2006; Carter et al., 2008). Несмотря на огромный интерес к проблеме, количество экспериментальных работ, посвященных изучению
транскрипционных фабрик, остается довольно ограниченным, и результаты этих работ нередко противоречат друг другу. Так как число транскрибирующихся генов существенно превышает число транскрипционных фабрик (Martin et al., 2004), то очевидным представляется то, что в составе одной транскрипционной фабрики должны присутствовать разные гены. Случайно ли распределение транскрибирующихся генов между индивидуальными транскрипционными фабриками? Некоторыми авторами было показано, что функционально связанные гены преимущественно привлекаются в общие транскрипционные фабрики. (Schoenfelder et al., 2010). Но существуют примеры транскрипционных фабрик, которые содержат как тканеспецифичные гены, так и гены домашнего хозяйства (Osborne et al., 2007; Philonenko et al., 2009; Zhao et al., 2006). В связи с этим интересно узнать, какова роль генов домашнего хозяйства в организации транскрипционных фабрик, ведь число генов домашнего хозяйства заметно превышает количество тканеспецифичных генов в любом типе клеток.
Все вышесказанное определяет актуальность темы настоящей диссертационной работы, которая посвящена изучению закономерностей взаимного позиционирования удаленных элементов генома в клеточном ядре, а также механизмов опосредующих взаимодействия между этими элементами.
Цели и задачи исследования
Основными целями работы были выяснение роли генов домашнего хозяйства в трехмерной организации интерфазных хромосом и характеристика механизмов обеспечивающих удержание удаленных элементов генома в составе активаторного хроматинового блока.
Для реализации этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:
изучить спектр полногеномных взаимодействий гена домашнего хозяйства NPRL3 с использованием методики 4С
выяснить, насколько стабильными являются активаторные хроматиновые блоки вне хромосомного контекста.
Научная новизна и практическое значение работы
В работе впервые продемонстрировано, что для осуществления лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК в процедуре ЗС существенно сохранение ядерной локализации хромосомного домена. На основании этих результатов предложена новая модель активаторного хроматинового блока, постулирующая важную роль способа упаковки большого хромосомного домена в обеспечении сближения различных групп регуляторных элементов. В рамках данной модели активаторный хроматиновый блок рассматривается как хроматиновый домен или ядерный компартмент, пространственная структура которого поддерживается не только и не столько прямым взаимодействием между регуляторными элементами и промоторами транскрибируемых генов, но и всем способом упаковки хроматиновой фибриллы, трехмерная организация которой может стабилизироваться белками, не связанными непосредственно с регуляторными элементами генома, составляющими активаторный хроматиновый блок. Предложенная модель объясняет короткоживущие альтернативные взаимодействия регуляторных элементов с промоторами разных генов, которые входят в состав одного хроматинового блока.
В работе было показано, что ассоциация CpG-островков, маркирующих промоторы генов домашнего хозяйства, является важной детерминантой в пространственной организации интерфазных хромосом. С функциональной точки зрения, кластеризация CpG-островков вносит существенный вклад в пространственную организацию как транскрипции, так и репликации эукариотической ДНК. В работе было показано, что ассоциация CpG-островков поддерживается такими факторами как Spl и CTCF. Кроме того, результаты работы позволяют утверждать, что активные и неактивные области генома пространственно разделены в интерфазном ядре.
В целом, результаты работы вносят существенный вклад в современные представления о принципах пространственной организации генома и механизмах, поддерживающих эту организацию, а также позволяют внести поправки в интерпретацию данных, полученных методом ЗС.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях и симпозиумах: FEBS Congress «Mechanisms in biology» (Санкт-Петербург, 2013), 23th Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus (Венгрия, 2013), Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology «Genomic Instability and DNA Repair» (Канада, 2013), XVIth Gliwice Scientific Meetings (Польша, 2012), международная конференция «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2012), «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies» of Transregional Collaborative Research Centre (Германия, 2011).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них статей в рецензируемых научных изданиях - 3, материалов конференций - 7.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 28 рисунков, 5 таблиц и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Постановка задачи и методические подходы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы» (165 цитированных работ).
![Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания](/i/i/4306/51263.png "Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания Крындушкин Дмитрий Сергеевич")
