Введение к работе
Актуальность проблемы.
Экспрессия генов - фундаментальный процесс, лежащий в основе жизнедеятельности организма. Изучение механизмов регуляции активности генов - важнейшая задача как для фундаментальных, так и прикладных исследований.
Экспрессия генов включает в себя ряд последовательных молекулярных стадий: подготовка матрицы хроматина, транскрипция ДНК, созревание мРНК и формирование рибонуклеопротеиновых частиц, их внутриклеточный транспорт и трансляция на рибосомах. Каждая из указанных стадий контролируется определенным набором факторов - молекулярных машин, которые обычно представлены мультисубъединичными белковыми комплексами. Взаимодействие и согласованное привлечение различных факторов обеспечивает координацию отдельных этапов в единый процесс.
Контроль экспрессии генов осуществляется в основном на стадии транскрипции. У высших эукариот на этом этапе задействовано несколько тысяч белков и их комплексов. Они формируют большой аппарат транскрипции, обеспечиваюший точный контроль активности генов. Современные знания об этом аппарате далеки от полноты, в частности, остается малоизученным вопрос о координации действия его участников.
Экспрессия генов контролируется сигналами, поступающими в клетку извне. Распознавание и передача поступающих стимулов осуществляется многочисленными сигнальными путями. Важный вопрос - изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих связь сигнальных путей с аппаратом транскрипции. Конечным звеном сигнальных каскадов часто является специфический фактор транскрипции, контролирующий определенный круг генов-мишеней. Детали молекулярных событий, происходящих при активации генов-мишеней не всегда достаточно ясны. Т.к. сигнальные пути - важнейший регулятор онтогенеза, указанная проблема тесно связана с вопросом о молекулярных основах контроля работы генов в онтогенезе.
В работе изучался механизм действия фактора транскрипции высших эукариот SAYP. Гомологи SAYP найдены у всех многоклеточных животных, они являются незаменимыми в развитии. Было обнаружено, что SAYP координирует два этапа экспрессии генов посредством нового механизма. Также выяснена роль этого механизма в ряде сигнальных путей и в онтогенезе.
Цель работы и основные задачи исследования.
Целью данной работы является изучение механизма действия фактора транскрипции SAYP эукариот на модельном организме Drosophila melanogaster.
Предполагалось решить следующие задачи:
-
Разработать метод получения высокоочищенных белковых комплексов факторов транскрипции и протестировать его.
-
Очистить белковый комплекс, содержащий SAYP.
-
Исследовать молекулярную связь SAYP с близким по функциям фактором ENY2.
-
Изучить молекулярную структуру SAYP-содержащего комплекса.
-
Исследовать роль SAYP-содержащего комплекса в процессе транскрипции.
-
Идентифицировать специфические транскрипционные активаторы, взаимодействующие с SAYP, и связанные с ними биологические процессы.
-
Выяснить роль SAYP и содержащего его комплекса в активации генов- мишеней найденных активаторов.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Основным результатом работы является открытие нового белкового суперкомплекса BTFly, объединяющего хроматин-ремоделирующую активность и способность инициировать транскрипцию на промоторах. Найдены сигнальные пути клетки, использующие BTFly.
В ходе работы был разработан метод получения высокочищенных препаратов транскрипционных белковых комплексов, содержащих определенный фактор.
Найден и выделен белковый комплекс BTFly. Он включает коактиваторы транскрипции SAYP, Brahma и TFIID. Впервые продемонстрировано объединение полноразмерных белковых транскрипционных комплексов в один суперкомплекс. Выяснено, что BTFly стабилен в отсутствие хроматиновой матрицы.
Показано, что BTFly формируется на основе коактиватора SAYP. Обнаружен домен SAY, обеспечивающий активирующий потенциал SAYP. Показано, что расположенные рядом с SAY PHD домены белка SAYP не способны активировать транскрипцию, но стимулируют активность SAY- домена.
Изучена молекулярная структура суперкомплекса, показаны белковые домены в составе его субъединиц, на основе которых осуществляется сборка всего комплекса: SAY домен взаимодействует с белками BAP170 и TAF5 (WD- 40 доменом последнего).
Показана локализация BTFly на промоторах активных генов. Изучены функциональные свойства BTFly в активации транскрипции: наличие всех компонентов необходимо для активации транскрипции и привлечения РНК- полимеразы.
Продемонстрировано, что SAYP, TFIID и Brahma локализуются совместно во многих сайтах генома и совместно участвуют в развитии организма.
Показано участие SAYP в экдизоновом каскаде. Найдено взаимодействие SAYP с ядерным рецептором DHR3 - компонентом экдизонового каскада. Локализованы фрагменты белков SAYP и DHR3, опосредующие найденное взаимодействие. Показана совместная экспрессия указанных факторов в развитии, совместная локализация во многих сайтах хромосом. Продемонстрировано привлечение SAYP на DHR3-зависимые гены в организме.
Подобраны условия для активации DHR3-зависимой экспрессии в культуре клеток S2, найдены новые гены-мишени DHR3. Продемонстрировано участие BTFly в активации последних.
Изучено проявление мутации е(у)3и1 (в гене, кодирующем SAYP): обнаружено нарушение пролиферации и дифференцировки клеток при развитии крыльев и оогенезе.
Показано участие SAYP в сигнальном пути Jak/Stat. Найдено взаимодействие SAYP и специфического фактора транскрипции STAT, взаимодействие осуществляется через активационный домен STAT и консервативный домен SAY-PHD. Обнаружена совместная локализация STAT и SAYP во многих сайтах хромосом, участие SAYP в активации STAT- зависимых генов и привлечение SAYP на указанные гены в организме.
Подобраны условия активации Jak/STAT пути в культуре клеток, показана положительная роль SAYP в активации генов-мишеней указанного пути. Продемонстрировано привлечение BTFly на промоторы STAT-зависимых генов и его участие в их активации.
Разработанный метод очистки белковых комплексов был применен для изучения фактора транскрипции ENY2. С помощью разработанного метода показано присутствие ENY2 во многих белковых комплексах: SAGA, AMEX, THO. Связь ENY2 с комплексом THO показана впервые. Найдено, что взаимодействие ENY2-THO не зависит от взаимодействий ENY2-SAGA и ENY2-AMEX.
Поскольку SAYP является консервативным фактором у высших эукариот, можно ожидать, что обнаруженный механизм является универсальными.
SAYP играет важную роль в развитии организма, поэтому полученные результаты имеют и важное практическое приложение. SAYP участвует в активации генов эмбрионального развития, генов-мишеней ряда сигнальных путей. Его гомолог у млекопитающих PHF10 необходим для поддержания статуса стволовых клеток мозга, их пролиферации и дальнейшей дифференцировки. Кроме того, изученные факторы DHR3 и STAT также имеют гомологов у млекопитающих, участвующих в дифференцировке различных типов клеток и регуляции их пролиферации. Поэтому полученные результаты могут быть важны для дальнейшего выяснения молекулярных механизмов активации генов в указанных биологических процессах.
Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на международных российских и зарубежных конференциях: 7th International Conference on Molecular Biology (Suzdal, Russia, 2004), 6th EMBL International PhD Students Symposium "Animal Models" (Rome, Italy, 2005), Международная Конференция «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), IV International Summer School "DNA and Chromosomes" (Cargese, France, 2006), XIX Зимняя Молодежная Научная Школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007), Семинар российско-германской группы «Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот» (Суздаль, 2007), FEBS-EMBO Advanced Lecture Course "Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer" (Spetses, Greece, 2007), Meeting on Mechanisms of eukaryotic transcription (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA, 2007), EMBO Conference Series on Nuclear Structure and Dynamics (Montpellier, France, 2007), FEBS workshop "The biology of modular protein domains" (Tirol, Austria, 2007), Конференция молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), EMBO workshop "Mechanisms of Nucleocytoplasmic Transport" (Taormina, Italy, 2007), 2nd Szeged Minisymposium on Histone Modifying
Complexes (Szeged, Hungary, 2008), IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 8th Young Scientist Forum and 33d FEBS Congress (Athens, Greece, 2008), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009), International Meeting on Nuclear Trafficking (Banff, Canada, 2009), FEBS Special Meeting, Jak-Stat Signalling: from basics to disease (Vienna, Austria, 2010), International Symposium "Control of gene expression and cancer" (Moscow, 2010), III Всероссийская научная школа- конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), XXIII Международная зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011), VII International Scientific Conference for Students and PhD Students "Youth and Progress of Biology" (Lviv, Ukraine, 2011), EMBO Conference Series on Nuclear Structure and Dynamics (L'Isle sur la Sorgue, France, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, из которых 6 в зарубежных журналах, 11 в российских журналах и 23 в сборниках материалов конференций и симпозиумов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и
списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на страницах и
содержит рисунков. Библиография включает источник.
Похожие диссертации на Механизм действия белкового суперкомплекса, содержащего фактор транскрипции SAYP
