Введение к работе
Актуальность темы.
Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), несмотря на определенные успехи вакцино- и химиопрофилактики, остаются одной из самых актуальных медицинских и социально экономических проблем. В России на грипп и ОРВИ ежегодно приходится до 90% от всей регистрируемой инфекционной заболеваемости (до 30 млн. больных; из них 45-60% дети). Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет около 86% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями (Слёпушкин А.Н., 2003; Маринич И. Г. с соавт., 2004).
Изменения эпидемиологии и экологии гриппа человека и животных, наблюдаемые в течение последних десяти лет, позволяют ВОЗ прогнозировать появление в ближайшие годы нового антигенного варианта вируса гриппа, что может привести к развитию крупной пандемии с 4-5-кратным ростом заболеваемости и 5-10-кратным ростом смертности. Это связывалось с широким распространением высокопатогенного вируса гриппа субтипа A(H5N1) среди дикой птицы, с эндемичностью данного вируса для домашних животных и птиц, а также с регистрацией случаев инфицирования высокопатогенным штаммом человека (Сох N., 2003; WHO, 2005; Webster R. G. and Govorkova E. A., 2006 ). Уже в 2009 году в мире стал активно распространяться вирус гриппа H1N1 свиного происхождения, представляющий собой тройной реассортант вирусов гриппа человека, птиц и свиней (WHO, 2009; Morens D.M. et all, 2009). Такая смена лидеров пандемического процесса свидетельствует о том, что степень защищенности популяции человека в этой экологической цепи зависит от возможности прогнозирования появления кардинально новых в антигенном отношении вирусов гриппа и от своевременного их выявления.
Предотвратить тяжелые случаи гриппозной инфекции и ее осложнения может гриппозная вакцина при условии соответствия компонентов вакцины и штаммов, циркулирующих в человеческой популяции. Непрерывная изменчивость современных вирусов гриппа определяет необходимость ежегодного обновления штаммового состава гриппозных вакцин (Jong J. С. et all, 2000). Объективное понимание эволюции вирусов гриппа - основа для разработки эффективных вакцин. В связи с этим очень важен этиологический
надзор за антигенной изменчивостью современных вирусов гриппа, а также углублённое изучение эпидемических штаммов, циркулировавших ранее.
Антигенный, генетический и филогенетический анализ российских изолятов в сравнении со штаммами, циркулирующими в мире, позволяет полнее определить основные тенденции изменчивости вирусов гриппа и проследить эволюционные связи между циркулирующими и вновь возникающими антигенными вариантами вирусов гриппа. Данные настоящих исследований имеют не только теоретическое, но и практическое значение как для расшифровки текущих, так и для подготовки к будущим эпидемиям.
Цель исследования:
Целью настоящего исследования является изучение молекулярно -генетических основ антигенной изменчивости вирусов гриппа человека подтипов A(H1N1) и A(H3N2), выделенных в России на протяжении 10 лет (1997-2007 гг.), и выявление закономерностей эволюции вирусов гриппа А.
Задачи исследования:
Проанализировать этиологическую ситуацию по гриппу в России за период с 1997 г. по 2007 г. для определения структуры вирусной популяции на территории нашей страны.
Изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства вирусов гриппа подтипов A(H1N1) и A(H3N2), изолированных в разных регионах России, и установить степень гетерогенности популяций циркулирующих штаммов.
Провести молекулярно-генетический анализ субъединицы гемагглютинина (НА1) российских изолятов и определить основные аминокислотные позиции, изменения в которых оказывают влияние на антигенные свойства вируса.
На основании антигенного, молекулярно-биологического и филогенетического анализов современных вирусов гриппа типа А определить направленность антигенного дрейфа российских изолятов.
5. Оценить (ретроспективно) эпидемические и эволюционные потенции
необычных по антигенной и генетической структуре для того или иного
периода изолятов 1997-2007 гг.
Все исследования входили в плановую научную тематику лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа ГУ НИИ гриппа РАМН и были поддержаны международным грантом МНТЦ №3070 «Дальнейшее
усовершенствование надзора за гриппом в России. Вклад в глобальную подготовку к пандемии гриппа».
Научная новизна.
На базе Федерального центра по гриппу проведён анализ этиологии гриппозных эпидемий, возникавших в различных географических зонах РФ в период с 1997 по 2007 гг.
Впервые на большом фактическом материале, включающем результаты изучения около 1500 штаммов вирусов гриппа А(НШ1) и A(H3N2), установлены основные направления эволюции современных вирусов гриппа А. Впервые в 1998 г. на территории России зарегистрировано первичное появление и прослежено дальнейшее распространение вирусов гриппа A(H1N1), относящихся к новой эволюционной ветви и имеющих антигенное родство с эталоном А/Пекин/262/96. Была показана реальная возможность обнаружения опережающих вариантов вируса гриппа, которые приобретают эпидемическую значимость на территории страны через 2-3 года после их первичного появления.
На рубеже 2005-2006 гг. впервые зафиксировано выделение штаммов A(H1N1), обладающих существенными дрейфовыми изменениями в гене НА1 и значительно отличающихся от вирусов, циркулировавших ранее. Представителем этой разновидности является вирус А/С.Петербург/7/06. Данные вирусы занимают промежуточное положение между эволюционными клайдами, представителями которых являются штаммы А/Новая Каледония/20/99 и А/Брисбен/59/07.
В сезон 2006-2007 гг. показаны увеличение эпидемической активности вирусов подтипа A(H1N1) и одновременная циркуляция трёх генетических вариантов. Впервые изолированы в России штаммы подобные новому эталону А/Брисбен/59/07. Активный антигенный дрейф вирусов H1N1 в предпандемический период представляется особенно важным с точки зрения последующего вовлечения вирусов этого подтипа в реассортацию и активную селекцию с переходом в шифт в пределах одного подтипа (H1N1).
Выявлены особенности изменчивости вирусов гриппа A(H3N2). Вирусы данного подтипа характеризуются активной циркуляцией, постоянным антигенным дрейфом и выраженной гетерогенностью популяции.
Впервые проведённый молекулярно-биологический и филогенетический анализ штаммов А(НШ1) и A(H3N2), циркулировавших в период с 1997 по
2007 гг. в России, позволил выявить направленность антигенного дрейфа и определить основные детерминанты молекулы гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), ответственные за антигенные отличия.
Установлено частичное несоответствие антигенной и генетической структуры российских изолятов A(H1N1) и A(H3N2) актуальным вакцинным и референс-штаммам, что обуславливает важность локального этиологического мониторинга за гриппом.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. По данным вирусологического обследования населения на территории
России в период 1997-2007 гг. установлена циркуляция вирусов гриппа
A(H1N1), A(H3N2) и В. Удельный вклад каждого типа и подтипа вирусов
гриппа в различные эпидемические сезоны был неравнозначным, что
свидетельствовало об отсутствии реального лидера эпидемического процесса.
Популяция вирусов гриппа А каждого эпидемического сезона отличалась гетерогенностью, как на уровне подтипов, так и на уровне антигенных и генетических вариантов. Антигенный дрейф вирусов гриппа A(H3N2) носил непрерывный поступательный характер, в то время как эволюционные изменения вирусов гриппа А(НШ1) характеризовались сменой активной фазы на длительный период «затишья».
Определены и изучены аминокислотные позиции НА1 и NA отечественных изолятов, подверженные антигенному дрейфу. Ключевые позиции, существенно влияющие на антигенные свойства вируса, фиксировались в антигенно значимых областях А, В, С и Е НА1 (НЗ) и в антигенных сайтах Са, СЬ и Sb НА1 (HI).
4. Согласно проведённому антигенному, генетическому и
филогенетическому анализу дрейфовые изменения вирусов гриппа A(H3N2) и
А(НШ1) соответствовали глобальной тенденции молекулярно - генетической
эволюции этих вирусов в мире. Однако штаммы, циркулировавшие на
территории России, обладали определённым набором оригинальных замен,
отличающих их от референс-штаммов, рекомендованных в состав гриппозных
вакцин.
5. Раннее выявление штаммов, относящихся к новым эволюционным
ветвям, а также вирусов, являющихся промежуточным звеном между
различными филогенетическими ветвями, позволяет правильно оценить
этиологическую ситуацию и определить эпидемические потенции различных генетических и антигенных вариантов.
Личный вклад автора в проведение исследований.
Автором выполнен основной объем работ по изоляции, типированию, изучению антигенных свойств вирусов и филогенетическому анализу. Проведен теоретический анализ поведения вирусов H3N2 и H1N1 в предпандемический период.
Практическая значимость работы.
Изоляция и идентификация вирусов гриппа, циркулирующих на территории России (1997-2007 гг.), позволили определить этиологию эпидемий и сезонных подъёмов заболеваемости. На протяжении 10-ти лет осуществлялась помощь практическому здравоохранению в расшифровке гриппозных заболеваний. Выделены и изучены 1476 эпидемических штаммов вируса гриппа А. Все изоляты включены в коллекцию музея вирусов гриппа ГУ НИИ гриппа РАМН.
Данные по изоляции и идентификации вирусов гриппа учтены при составлении методических рекомендаций «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация», С.Петербург, 2006 г.
Результаты изучения антигенных и генетических свойств эпидемических изолятов позволили определить основные направления эволюции вирусов гриппа А и выявить новые оригинальные штаммы, что важно в практическом плане при прогнозировании эпидемий и вероятных пандемий, а также при выборе кандидатов в вакцинные штаммы и штаммы для производства диагностических препаратов.
Информация о выделении вирусов гриппа и об антигенной характеристике эпидемических штаммов ежегодно отправляется в ВОЗ, Министерство здравоохранения РФ и Центры гигиены и эпидемиологии и органы практического здравоохранения. В рамках сотрудничества с ВОЗ для включения в международный мониторинг за гриппом были переданы в референс-лаборатории (CDC&P, Атланта, Джорджия, США и NIMR, Лондон, Англия) 487 отечественных штаммов вируса гриппа А. Данные штаммы входят в состав коллекций лабораторий ВОЗ, а три из них являются референс-штаммами (MRC, National Institute for Medical Research., WHO Influenza Centre., 1999., 2007., 2008. - ).
Апробация результатов исследований.
Материалы диссертации были представлены на юбилейной международной научной конференции «Грипп XXI век» 1997г., VII Съезде Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 1997 г., Всероссийской научной конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций» 2001г., 6* annual Meeting European Society for Clinical Virology ESCV 2003, Options for the control of influenza V. Okinawa, Japan 2003, симпозиуме «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества» СПб., 2003 г., юбилейной научной конференции «Современная микробиология в клинической медицине и эпидемиологии» СПб., 2003 г., Международная конференция «Актуальные вирусные инфекции - практические и теоретические аспекты» СПб., 2004г., на международных конференциях "Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook", S.-Petersburg, Russia 2007, Options for the Control of Influenza IV, 2007, Toronto, Canada, на конгрессе «Экофорум 2008», на международной конференции 3rd ESWI Conference, Vilamoura, Portugal, 2008.
Публикации.
Результаты диссертации отражены в 31 печатной работе, в том числе в реферируемых журналах, тезисах докладов на Международных и Всероссийских конгрессах, съездах и конференциях, а также методических рекомендациях.
Объем и структура диссертации.
