Введение к работе
Актуальность проблемы. В развитых странах онкологические заболевания занимают второе место в структуре смертности, сменив инфекционные заболевания. Рак легкого стоит на третьем месте по заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей, как в мире, так и в России (Мукерия и Заридзе, 2010). На немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) приходится 85-87% всех мировых случаев выявления новообразований. Пятилетняя выживаемость при диагностике на I-II стадии составляет 57-67%, на III - 5-25% и на IV - менее 1%.
Рак толстой кишки (РТК) в России является чрезвычайно насущной проблемой, занимая четвертое место в структуре женской онкологической заболеваемости (~10 % в 2011 году в России) и пятое место (5.8% в 2011 году в России) в структуре мужской заболеваемости (Чиссов и др., 2012). Тяжесть заболевания и низкая выживаемость при раке толстой кишки связаны, прежде всего, с поздним выявлением опухоли. Так, при первичном обращении пациентов к врачу запущенные формы рака (III-IV стадии) диагностируются у 71% больных. Пятилетняя выживаемость больных РТК при выявлении заболевания на I стадии составляет 96%, на II - 87%, на III - 55% и на IV -только 5%.
Аномальное функционирование и измененный профиль экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл, апоптоз и дифференцировку, являются ключевым свойством злокачественного процесса (Hanahan and Weinberg , 2010). Исследования последних лет показывают, что эпигенетические нарушения (метилирование ДНК и модификации гистонов), в совокупности с генетическими изменениями, составляют комплекс механизмов, ответственных за формирование фенотипа трансформированной клетки (Godfrey et al, 2007). Изменение степени метилирования ДНК происходит при различных патологиях и характерно для онкологических заболеваний, при которых на фоне глобального деметилирования генома происходит избирательное гиперметилирование промоторов генов, проявляющих опухоль-супрессорные свойства (Jones andBaylin, 2007).
МикроРНК относятся к классу малых некодирующих РНК длиной 19-24 нуклеотида, выполняющих функцию посттранскрипционного регулятора экспрессии целевых генов (Макарова и Крамеров, 2007). Показана важная роль дифференциальной экспрессии генов микроРНК в процессах злокачественной трансформации, причем профили экспрессии микроРНК носят опухоль-специфичный характер (Melo andEsteller, 2011).
Экспрессия генов микроРНК также подвержена регуляции посредством метилирования CpG-динуклеотидов в составе CpG-островков, перекрывающих промоторные участки генов (Lopez-Serra and Esteller, 2012). Следует отметить, что для генов микроРНК метилирование является более характерным эпигенетическим механизмом подавления экспрессии, чем для белок-кодирующих генов. Так, 11,5% всех генов микроРНК подвержены регуляции посредством метилирования (122 из 1048 генов микроРНК по состоянию на
2011 год), для белок-кодирующих генов этот показатель составляет 1-2% (Kunej et al, 2011).
Цель работы. Целью данной работы явилось изучение вовлеченности метилирования CpG-островков, перекрывающих промоторные участки генов микроРНК в патогенез НМРЛ и РТК и оценка диагностических качеств панелей маркеров на основе исследованных генов.
Задачи исследования.
-
Исследовать статус и частоту метилирования CpG-островков 14 генов микроРНК: mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-107, mir-124a3, mir-125bl, mir-ІЗОЬ, mir-137, mir-129-2, mir-193a, mir-203, mir-212, mir-375 и mir-1258 на представительной выборке клинических образцов первичных опухолей и гистологически нормальной ткани легкого пациентов с НМРЛ и ткани легкого доноров без онкопатологий.
-
Исследовать статус и частоту метилирования CpG-островков семи генов микроРНК mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-129-2, mir-193a, mir-203 и mir-212 на представительной выборке клинических образцов опухолей и гистологически нормальной ткани толстой кишки пациентов с РТК и ткани толстой кишки доноров без онкопатологий.
-
Исследовать корреляции между частотой метилирования изучаемых генов и клинико-патологическими свойствами первичных опухолей РТК и НМРЛ, а также их подтипов.
-
Разработать на основе полученных данных о частотах метилирования группы генов микроРНК панели молекулярных маркеров для ранней диагностики опухолей легкого и толстой кишки.
Научная новизна. В результате проведенного исследования опухоль-специфичное метилирование CpG-островков, перекрывающих регуляторные участки генов микроРНК, при НМРЛ впервые выявлено для генов: mir-125bl, mir-129-2, mir-212, mir-375 и mir-1258. Кроме того, впервые исследовано метилирование гена тіг-137 на клиническом материале опухолей НМРЛ и определена частота метилирования CpG-островка этого гена в первичных опухолях легкого. Впервые показано отсутствие метилирования CpG-островков при НМРЛ генов mir-ІЗОЬ и mir-107. Выявлено специфичное метилирование CpG-островка гена mir-1258 при НМРЛ, что представляет первое сообщение о вовлеченности метилирования гена mir-1258 в процесс онкогенеза. Впервые показано специфичное метилирование гена mir-9-З на клиническом материале первичных опухолей РТК.
Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования CpG-островка гена mir-125bl с со стадией НМРЛ (Р=0,036) и наличием метастазов в региональных лимфоузлах {Р=0,0496). Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования CpG-островка гена mir-137 со стадией НМРЛ {Р=0,023).
Составлены оригинальные системы маркеров метилирования, позволяющие с высокой чувствительностью и специфичностью различать опухолевую ткань НМРЛ и здоровую ткань легкого.
Теоретическая и практическая значимость. Идентифицированы новые гены микроРНК, подверженные аномальному метилированию при НМРЛ. Показана высокая частота метилирования CpG-островков группы генов микроРНК при злокачественных новообразованиях легкого и толстой кишки. Показана связь метилирования генов mir-125bl и mir-137 с прогрессией НМРЛ.
Предложена система из 7 маркеров, которая позволяет с чувствительностью 81% и специфичностью 83% различить злокачественную опухоль НМРЛ от окружающей гистологически нормальной ткани легкого при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели. Предложенная система маркеров позволяет различить злокачественную опухоль пациентов с НМРЛ от ткани легкого человека без онкопатологий с чувствительностью 81% и специфичностью 95% при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели.
Предложена система из 4 маркеров, которая позволяет с чувствительностью 82% и специфичностью 93% различить злокачественную опухоль РТК от окружающей гистологически нормальной ткани тоетой кишки при обнаружении метилирования более чем в двух локусах из панели. Предложенная система маркеров позволяет различить злокачественную опухоль пациентов с РТК от ткани тоетой кишки человека без онкопатологий с чувствительностью 97% и специфичностью 78% при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели.
Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» 28 марта 2013 г. Материалы работы были представлены на 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2011» (Санкт-Петербург, апрель, 2011), научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, октябрь, 2011), XV Российском онкологическом конгрессе (Москва, ноябрь, 2011).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 4 материала конференций, зарегистрирована заявка на патент.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 326 источников. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 32 рисунками.
